Review BKH

1

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK BERAS KETAN HITAM (Oryza sativa Linn. var glutinosa) DENGAN METODE DPPH

(2,2-Difenil-1-Pikril Hidrazil) AMIRA LESTARI

Fakultas Farmasi, Universitas Hasanuddin, Makassar-Indonesia 90245

ABSTRAK

Beras ketan hitam (Oryza sativa Linn. var glutinosa) merupakan salah satu varietas beras yang mengandung pigmen antosianin yang memiliki aktivitas antioksidan dan dapat menghambat radikal bebas. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan dari beras ketan hitam. Dilakukan uji aktivitas antioksidan metode penangkapan radikal bebas DPPH (2,2 difenil 1 pikrilhidrazil). Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak beras hitam ketan memiliki antioksidan dengan IC50 ekstrak metanol, ekstrak etanol dan ekstrak aseton adalah 47,15 g/ml, 23,32 g/ml dan 14,49 g/ml. Jenis ekstrak tersebut secara signifikan mempengaruhi aktivitas antioksidan (p

2

berfungsi sebagai antioksidan, berperan penting, baik bagi tanaman itu sendiri maupun bagi kesehatan manusia. Peran antioksidan bagi kesehatan manusia adalah untuk mencegah penyakit hati (hepatitis), kanker usus, stroke, diabetes, sangat esensial bagi fungsi otak dan mengurangi pengaruh penuaan otak. Antosianin dari beras ketan hitam dapat diekstraksi dengan pelarut organik, seperti etanol, metanol dan aseton (2, 3, 4).

Antioksidan adalah zat yang dapat menangkal atau mencegah reaksi oksidasi dari radikal bebas. Reaksi oksidasi dapat menghasilkan radikal bebas dan memicu reaksi berantai, menyebabkan kerusakan sel dalam tubuh. Radikal bebas sangat berbahaya karena dapat merusak jaringan tubuh yang dapat menyebabkan penyakit degenerative (5).

Radikal bebas merupakan atom, molekul ataupun senyawa yang sangat tidak stabil, karena struktur atom dan molekulnya yang tidak berpasangan, sehingga radikal bebas sangat reaktif. Radikal bebas harus berpasangan dengan molekul, atom, atau bahkan elektron untuk membentuk senyawa yang stabil, dengan cara mengambil atom hidrogen dari molekul lain, berikatan dengan molekul lain, atau berinteraksi dengan radikal bebas lainnya. Radikal dapat terbentuk secara endogen dan eksogen. Radikal endogen terbentuk dalam tubuh melalui proses metabolism normal di dalam tubuh. Sementara radikal eksogen berasal dari bahan pencemar yang masuk ke dalam tubuh melalui pernafasan, pencernaan, dan penyerapan kulit (6, 7).

Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa metode, salah satunya adalah metode DPPH (2,2-difenil-1-pikril hidrazil). Metode ini digunakan sebab hasilnya terbukti akurat, reliabel dan praktis dalam mendeteksi antiradikal. Selain itu, sederhana, cepat dan memerlukan sedikit sampel (8).

Berdasarkan uraian diatas, maka akan dilakukan penelitian yang bertujuan mengetahui adanya aktivitas antioksidan dari ekstrak metanol, etanol dan aseton beras ketan hitam (Oryza sativa Linn. var glutinosa) dengan metode DPPH (2,2-difenil-1-pikril hidrazil).

BAB II PELAKSANAAN PENELITIAN

III.1 Penyiapan Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan adalah botol coklat, Elisa reader (Biotec), kertas saring whatman no.1, labu Erlenmeyer (Pyrex), labu tentukur, mikropipet (Socorex), mikrowell plate, multichannel mikropipet, neraca analitik (Sartorius), oven, pH meter (Buchi), pipet volume, seperangkat alat rotavapor (Buchii), seperangkat alat pompa vakum (Buchii), Spektrofotometer UV-Vis (Agilent) dan vial. Bahan yang digunakan adalah air suling, beras ketan hitam (Oryza sativa Linn. var glutinosa), difenil pikril hidrazil (DPPH) (Sigma Aldrick), HCl Pekat (36%), KCl, Na-Asetat (CH3COONa), pelarut etanol tekhnis,

3

pelarut aseton tekhnis, pelarut metanol tekhnis, metanol absolute tekhnis, silika gel RP-18 (E.Merck) dan vitamin C (E.Merck). III.2 Metode Kerja III.2.1 Pengambilan Sampel Penelitian

Sampel beras ketan hitam (BKH) diperoleh di pasar Daya, Makassar. Sampel dikeringkan dalam oven simplisia suhu 40C lalu diserbukkan dengan menggunakan blender sebelum diekstraksi.

III.2.2 Ekstraksi Sampel Sampel diekstraksi dengan cara maserasi dengan

memenggunakan 3 macam larutan penyari, yaitu : BKH (A) : 25 gram beras ketan hitam yang diekstraksi menggunakan 50

ml larutan HCl 0,01% dalam metanol. BKH (B) : 25 gram beras ketan hitam yang diekstraksi menggunakan 50

ml larutan HCl 0,01% dalam etanol. BKH (C) : 25 gram beras ketan hitam yang diekstraksi menggunakan 50

ml larutan penyari yang terdiri dari aseton 70% yang dibuat dalam HCl 0,01%.

Maserasi dilakukan selama 1 hari dengan dilakukan pengadukan sesekali. Ekstrak yang diperoleh kemudian disaring dengan menggunakan kertas whatman no.1 dengan bantuan pompa vakum. Selanjutnya dilakukan remaserasi sebanyak 4-5 kali hingga diperoleh hasil ekstraksi yang agak jernih. Ekstrak yang diperoleh kemudian dikumpulkan dan dipekatkan menggunakan rotavapor suhu 50C untuk mengu apkan pelarut. Ekstrak yang diperoleh dimasukkan didalam lemari pendingin.

III.2.3 Pengukuran dan Perhitungan Kadar Antosianin Total dengan Metode pH Differensial (9)

III.2.3.1 Pembuatan Larutan Dapar pH 1,0 dan pH 4,5 Larutan dapar pH 1,0 dibuat dengan menggunakan KCl sebanyak

1,86 g dicampur dengan air suling dan diatur pH-nya hingga mencapai 1 dengan menggunakan HCl pekat. Selanjutnya larutan dipindahkan ke dalam labu ukur 1 L dan dicukupkan volumenya hingga 1 L dengan menggunakan air suling.

Larutan dapar pH 4,5 dibuat dengan menggunakan CH3COONa.3H2O sebanyak 54,43 g dicampur dengan 960 ml air suling. Kemudian diukur pH-nya dan diatur dengan penambahan HCl pekat hingga diperoleh larutan dengan pH 4,5. Selanjutnya larutan dipindahkan ke dalam labu ukur 1 L dan dicukupkan volumenya dengan air suling hingga 1 L.

III.2.3.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum dan Faktor Pengenceran

Sampel dilarutkan dalam dapar KCl pH 1 kemudian diukur pada spektrofotometer untuk menentukan panjang gelombang maksimum dari sampel. Faktor pengenceran ditentukan dengan cara melarutkan sampel dalam dapar KCl pH 1 hingga diperoleh absorbansi kurang dari 1,2. Faktor

4

pengenceran yang diperoleh adalah 0,1 ml ekstrak antosianin dilarutkan hingga 5 ml. Jadi Faktor pengenceran = 50

III.2.3.3Perhitungan Kadar Antosianin 1. Dua larutan sampel disiapkan, pada sampel yang pertama digunakan

dapar KCl pH 1 dan untuk sampel kedua digunakan dapar Na-Asetat dengan pH 4,5. Masing-masing sampel dilarutkan dalam larutan dapar berdasarkan FP (faktor pengenceran) yang sudah ditentukan sebelumnya. Dibuat 3 replikasi untuk masing-masing sampel

2. Sampel yang dilarutkan menggunakan dapar pH 1 dibiarkan selama 15 menit sebelum diukur, sedangkan sampel yang dilarutkan dengan dapar pH 4,5 di ukur setelah dibiarkan bercampur selama 5 menit.

3. Absorbansi dari setiap larutan pada panjang gelombang 509 dan 700 nm diukur dengan dapar pH 1 dan pH 4,5 sebagai blankonya

4. Absorbansi dari sampel yang telah dilarutkan (A) ditentukan dengan rumus :

A = [(A509 A700)pH 1 (A509 A700)pH 4,5] 5. Kandungan antosianin pada sampel dihitung dengan rumus :

Total antosianin (%b/b) =

%

Keterangan : = Absorptivitas molar Sianidin-3-glukosida = 26900 L(mol.cm) L = Lebar kuvet = 1 cm MW = Bobot molekul Sianidin-3-glukosida = 449,2 g/mol DF = Volume akhir atau volume ekstrak pigmen (L) Wt = Bobot awal bahan (g)

III.2.4 Uji Kualitatif Aktivitas Antioksidan Analisis dilakukan secara kromatografi lapis tipis autografi terhadap

ekstrak metanol, etanol dan aseton dari sampel yang dilarutkan dalam metanol, ditotolkan pada lempeng KLT silika gel RP-18 dan dikeringkan. Fase gerak KLT untuk ekstrak adalah metanol dengan air (80:20). Selanjutnya dilakukan pengembangan dalam bejana kromatografi dan noda yang terbentuk diperiksa di bawah lampu UV pada panjang gelombang 366 nm dan 254 nm. Noda-noda yang memiliki daya antioksidan terlihat dari pemudaran warna pereaksi semprot DPPH.

III.2.5 Uji Kuantitatif Aktivitas Antioksidan III.2.5.1 Pembuatan Larutan Sampel

Ekstrak BKH (A), (B) dan (C) ditimbang sebanyak 1 mg, kemudian dilarutkan dengan metanol absolut dan dicukupkan volumeya hingga 10 ml, sehingga diperoleh larutan stok 100 g/ml. Kemudian masing-masing ekstrak dibuat pengenceran dengan konsentrasi yang berbeda-beda.

III.2.5.2 Pembuatan Larutan DPPH 240 M DPPH ditimbang sebanyak 0,94 mg. kemudian dilarutkan dalam metanol absolute hingga volume 10 ml.

5

III.2.5.3 Pengujian Aktivitas Antioksidan Sampel Ekstrak BKH (A), (B) dan (C) masing-masing dipipet sebanyak 20,

40, 60, 80 dan 100 l kedalam mikroplate, lalu masing-masing ditambahkan 75 l DPPH 240 M dengan menggunakan multichannel mikropipet dan volume campuran dicukupkan sehingga 200l dengan pelarut metanol, sehingga didapatkan seri konsentrasi 10, 20, 30, 40 dan 50 g/ml. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37C s elama 30 menit, kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum (515 nm) dengan menggunakan Elisa Reader, sebagai blanko larutan DPPH 240 M dipipet sebanyak 75 l kemudian ditambahkan 125 l metanol absolute. Untuk pembanding digunakan vitamin C dengan konsentrasi 2,5; 5; 7,5; 10 dan 12,5 bpj. Aktivitas antioksidan dari masing-masing sampel dinyatakan dengan persen inhibisi, yang dihitung dengan rumus sebagai berikut :

%inhibisi =serapanblanko serapansampel

serapanblanko %

Persen inhibisi yang dihasilkan oleh masing-masing ekstrak beras ketan hitam uji, kemudian ditabulasi dan dihitung nilai IC50 nya dengan analisis probit dari data log konsentrasi dengan probit persentasi pengikat radikal bebas.

II.2.6 Analisis Statistik Analisis data statistik menggunakan SPSS 16.0 for windows

dengan metode oneway Anova yang dilanjutkan dengan analisis lanjutan uji Duncan untuk mengetahui pengaruh jenis ekstrak terhadap aktivitas antioksidan ekstrak beras ketan hitam. Analisis korelasi antara kadar antosianin total dengan nilai IC50 dianalisis dengan metode korelasi Pearson. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan software SPSS 16.0 for windows.

BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN

III.1 Hasil Penelitian III.1.1Hasil Perhitungan Rendamen Tabel 1. Hasil Perhitungan Rendamen Ekstrak BKH No Jenis Ekstrak Hasil Ekstraksi (g) rendamen (%b/b)* 1 metanol-Asam 22.8758 2.29 2 Alkohol-asam 22.5389 2.25 3 Aseton-asam 26.9059 2.69

*rata-rata dari 3 replikasi

6

III.1.2 Hasil Perhitungan Kandungan Total Antosianin Table 2. Hasil Perhitungan Kadar Antosianin Total Ekstrak BKH

No Jenis Ekstrak Kadar Antosianin (%b/b)* 1 Metanol 0,166 2 Etanol 0,126 3 Aseton 0,076


III.1.3 Profil KLT

Gambar 1. Kromatogram Lapis Tipis Ekstrak Beras Ketan Hitam dan antosianin murni

Keterangan : M = Ekstrak Metanol E = Ekstrak Etanol A = Ekstrak Aseton

Fase diam : Silika gel RP-18 Fase gerak : Metanol-Air (80:20)

A,E = Profil KLT pada sinar tampak B,F = Visualisasi dengan UV 254 C,G = Visualisasi dengan UV 366 D = Visualisasi dengan larutan DPPH 0,4Mm

A B C D

M E A

E An

M E A M E A M E A

E An E An

E F G

7

III.1.4 Hasil Perhitungan Aktivitas Antioksidan Tabel 3. Hasil pengujian aktivitas antioksidan Beras Ketan Hitam

Sampel Nilai IC50(g/ml)* BKH A 47,15 1,26537

BKH B 23,32 1,26537

BKH C 14,49 0,29141

Vitamin C 7,11 0,20075


III.2 Pembahasan Beras ketan hitam merupakan salah satu varietas beras berpigmen

yang telah lama dikonsumsi oleh masyarakat Indonesia sebagai bahan makanan. Beras ketan hitam mengandung pigmen antosianin yang tergolong senyawa fenolik kelompok flavanoid. Antosianin memiliki aktivitas antioksidan dan dapat menghambat radikal bebas (2,3).

Metode maserasi digunakan untuk mengekstraksi senyawa antosianin dalam sampel. Metode ini digunakan karena senyawa antosianin tidak stabil dengan pemanasan. Pelarut yang digunakan adalah metanol, etanol dan aseton yang diasamkan dengan penambahan 0,01% HCl. Menurut literatur, antosianin dapat diekstraksi menggunakan tiga pelarut yaitu metanol, etanol, dan aseton yang diberi asam klorida dalam jumlah kecil karena antosianin bersifat stabil dalam suasana asam (10). Cairan ekstrak yang telah dimaserasi dipekatkan dengan rotavapor dengan suhu 50C hingga sampel mengental, kemudian diu apkan. Setelah proses ekstraksi, diperoleh rendamen ekstrak metanol sebanyak 2,29%b/b, ekstrak etanol sebanyak 2,25%b/b dan ekstrak aseton sebanyak 2,69%b/b. Ekstrak yang diperoleh diduga mengandung antosianin. Dimana hal ini dapat dilihat berdasarkan warna tiap ekstrak yaitu berwarna merah tua-ungu. Menurut pustaka, antosianin merupakan suatu zat warna atau pigmen pada tanaman seperti buah, umbi dan biji-bijian yang memberi warna merah, biru dan ungu (11). Selain itu, berdasarkan pengukuran panjang gelombangnya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis, ekstrak antosianin beras ketan hitam memiliki panjang gelombang maksimum 509nm. Hal ini sesuai dengan pustaka yang menyatakan panjang gelombang antosianin berada pada rentang 500-535nm (10). Dilihat dari profil KLT ekstrak etanol BKH dibandingkan dengan antosianin murni menggunakan lempeng silika RP-18 dan fase gerak metanol-air (80:20), noda ekstrak BKH memiliki Rf yang sama dengan antosianin murni yaitu 0,85. Hal ini berarti ekstrak BKH yang diperoleh mengandung antosianin.

8

Pengukuran kadar antosianin total dilakukan dengan metode pH Differensial yaitu metode yang digunakan untuk mengukur antosianin berdasarkan perbedaan pH 1,0 dan pH 4,5. Penetapan konsentrasi antosianin dengan metode ini dikarenakan pada pH 1,0 antosianain membentuk senyawa oxonium (kation flavilium) yang berwarna dan pada pH 4,5 berbentuk karbinol/hemiketal tidak berwarna. Kondisi inilah yang akan dijadikan acuan untuk menentukan absorbansi dengan menggunakan spektrofotometer Uv-Vis dari masing-masing ekstrak yang dihasilkan. Perubahan warna pada antosianin dalam tingkatan pH tertentu disebabkan sifat antosianin yang memiliki tingkat kestabilan yang berbeda (12). Dari hasil penetapan senyawa antosianin dengan metode pH differensial, maka diperoleh kadar antosianin ekstrak metanol sebesar 0,166%b/b, ekstrak etanol sebesar 0,126%b/b dan ekstrak aseton 0,076%b/b.

Masing-masing ekstrak dari tiap sampel kemudian di uji kualitatif menggunakan metode kromatografi lapis tipis (KLT), dengan fase diam silika gel RP-18 dan fase gerak yang digunakan adalah campuran metanol:air (80:20). Profil KLT menunjukkan 1 noda pada sinar tampak dengan nilai Rf ekstrak metanol, etanol dan aseton sama yaitu 0,87. Noda yang terbentuk kemudian diperiksa dibawah lampu UV pada panjang gelombang 366 nm dan 254 nm. Identifikasi noda pada UV 254 nm berdasarkan adsorbsi oleh noda yang mengandung gugus kromofor terhadap sinar UV 254 nm sehingga noda tampak gelap pada lempeng KLT dibawah sinar UV 254 nm, sedangkan pada UV 366 nm noda yang tampak akan berwarna terang dengan latar yang gelap.

Identifikasi KLT juga dilakukan dengan menggunakan DPPH untuk mengetahui apakah noda yang dimiliki oleh ekstrak tersebut dapat mengikat radikal bebas DPPH. Selain noda dengan Rf-0,87, pada ekstrak aseton juga terdapat 2 noda setelah disemprot DPPH dengan Rf=0,93.

Uji aktivitas antioksidan dilakukan menggunakan metode DPPH (2,2-Difenil-1-Pikrilhidrazil). Metode DPPH ini dipilih karena pengerjaannya cepat, sederhana, dan praktis untuk mengetahui kapasitas antioksidan (13). Radikal DPPH merupakan senyawa organik berwarna ungu yang mengandung nitrogen tidak stabil dengan absorbansi kuat pada max 515 nm. Setelah bereaksi dengan senyawa antioksidan, DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan memudar (penurunan intensitas warna). Perubahan tersebut dapat diukur dengan Mikroplate Reader. Penurunan intensitas warna yang terjadi disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH karena terjadi penangkapan satu elektron oleh zat antioksidan, menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk beresonansi. Sebagai akibatnya, penambahan senyawa antioksidan akan menurunkan konsentrasi DPPH dan akan menyebabkan penurunan absorbansinya, sehingga akan diperoleh suatu kurva yang menurun. Parameter yang digunakan untuk menginterpretasikan hasil dari metode DPPH adalah nilai EC50 (Efficient Concentration) atau sering juga disebut nilai IC50 (Inhibitory Concentration)

9

yang didefinisikan sebagai konsentrasi dari substansi yang dapat meredam 50% aktivitas DPPH. Parameter IC50 menunjukkan bahwa semakin tinggi aktivitas antioksidan, maka semakin rendah nilai IC50 (14). Suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan yang sangat kuat apabila nilai IC50 kurang dari 50 g/ml, kuat apabila nilai IC50 50-100 g/ml, sedang apabila nilai IC50 100-150 g/ml, dan lemah bila nilai IC50 antara 150-200 g/ml (13).

Berdasarkan hasil pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak metanol, etanol dan aseton berturut-turut adalah 47,15 g/ml; 23,32 g/ml dan 14,49 g/ml. Aktivitas antioksidan yang paling tertinggi terdapat pada ekstrak aseton yaitu 14,49 g/ml. Sedangkan aktivitas antioksidan yang paling lemah terdapat pada ekstrak metanol yaitu 47,39 g/ml. Angka ini menunjukkan bahwa ekstrak aseton memiliki aktivitas antioksidan yang lebih besar dari pada ekstrak metanol dan ekstrak etanol pada konsentrasi yang sama.

Gambar 8. IC50 penangkalan radikal bebas DPPH Selanjutnya dari aktivitas antioksidan dengan metode DPPH dianalisis secara statistik dengan menggunakan analisis ragam (ANOVA) dan dilanjutkan dengan uji lanjutan Duncan. Hasil pengolahan statistik data hasil pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode DPPH. Data hasil pengolahan analisis ragam menunjukkan bahwa nilai signifikan sampel adalah 0,000

10

dan ekstrak metanol memiliki aktivitas yang paling rendah diantara semua ekstrak. Meskipun demikian, aktivitas ekstrak aseton masih lebih rendah dengan signifikansi p

11

DAFTAR PUSTAKA

1. Damardjati, D. S. Struktur dan Komposisi Kimia Beras. Fakultas Pasca Sarjana. IPB, Bogor. 1980.

2. Tananuwong, K. dan Tewaruth W. Extraction and application of antioxidants from black glutinous rice LWT. Food Sci. Technol. 2010. 476

3. Hanum, T. Ekstraksi dan Stabilitas Zat Pewarna Alami dari Katul Beras Ketan Hitam (Oryza sativa glutinosa). Buletin Teknologi dan Industri Pangan, Vol. XI, 1. Universitas Bandar Lampung. 2000.

4. Ronald, E.W and Terry, E.A. Handbook Food Analitycal Chemistry : Extraction, Isolation and Purification of Anthocyanins. John Wiley and Sons, Inc. 2001.

5. Chang, L., Huang, S.C. and Duh, P.D. Antioxidant activity of sesame coat. Food Chemistry. 2002

6. Wu, D and Cederbaum, A.I. Alcohol, Oxidative Stress, and Free Radical Damage. Alcohol Research and Health. 2003. Vol. 27 No. 4. 278.

7. Miller, A.L. Antioxidant flavonoids : structure, function and clinical usage. Alt Med. 1996. 103-111.

8. Marxen, K., Vanselow, K.H., Lippemeier, S., Hintze, R., Ruser, A., and Hansen, U.P. Determination of DPPH radical oxidation caused by methanolic extracts of some microalgal species by linear regression analysis of spectrophotometric measurements. Sensors 7. 2007. 2080-2091.

9. Giusti, M and Wrolstad, R.E. Characterization and Measuement of Anthocyanins by UV-Visible Spectroscopy. Oregon State Unuversity. 2001.

10. Shipp, J., dan Abdel-Aal, E.M., Food Applications and Physiological Effects of Anthocyanins as Functional Food Ingredients. The Open Food Science Journal. 2010.4. Hal. 7-22.

11. Harborne, J.B., Phytochemical Methods: A Guide to Modern techniques of Plant. London : Chapman and Hall. 1998.

12

12. Giusti, M., dan Wrolstad, R.E., Characterization and Measuement of Anthocyanins by UV-Visible Spectroscopy. Oregon State University. 2001.

13. Molyneux, P., The Use of The Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity. Journal Science Technology. 2004. 26(2). Hal. 211-219.

14. Suhartono, E., Triawanti., Setiawan, B., Firdaus, T.R., dan Sari, M.P., Peran Rebusan Daun Tapak Dara (Catharanthus roseus L. G.Don) Sebagai Antioksidan dalam Menghambat Fotooksidasi Cairan Nutrisi parenteral Glukosa. Majalah Obat Tradisional, 2004, Vol : 9. hal. 21-25.

15. Boonsit, P., Karlade, D., dan Phongpiacan, C., Gamma Oryzanol Content in Purple Rice Thailand Local Genotype. Prosperity and Poverty in a Globalized WorkdChallenges for Angricultural Research. 2006. 1-4.

13

LAMPIRAN

Lampiran 1. Penyiapan Sampel

Skema Kerja Penetapan Kadar Total Antosianin

Dikeringkan dalam oven suhu 40C selama 2 jam dan diblender. Ditimbang sebanyak 25 gram

Diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan pelarut metanol+ HCl 0,01%, etanol + HCl 0,01% dan aseton + HCl 0,01% selama 1 x 24 jam. Di remaserasi 4-5 kali

Dirotavapor dengan suhu 50C

Beras Ketan Hitam (Oryza sativa Linn. var glutinosa)

Serbuk beras ketan hitam

Ekstrak cair

Ekstrak Metanol Kering

Ekstrak Etanol Kering

Ekstrak Aseton Kering KLT KLT KLT

Hasil

- Pengukuran Kadar Antosianin - Pengujian Antioksidan

Pembahasan dan Kesimpulan

Ekstrak - Dilarutkan ekstrak dalam dapar KCl pH1 - Ditentukan panjang gelombang maksimum dengan

spektrofotometer dan faktor pengenceran (Fp= 50)

pH 1 pH 4,5

Sampel dilarutkan dalam dapar KCl pH 1

Sampel dilarutkan dalam dapar Na-asetat pH 4,5

Didiamkan 15 menit Didiamkan 5 menit

Absorbansi

Absorbansi diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 509 nm dan 700 nm

Kadar Total Antosianin

14

Pengujian antioksidan

Lampiran II. Perhitungan Rendamen Ekstrak

Table 4. Data Penimbangan Bobot Sampel dan Ekstrak

No. Jenis Ekstraksi Bobot Sampel (g) Hasil

Ekstraksi (g) Rendamen (%b/b)

1 Metanol-Asam 25,0040

0,5725 2,29 25,0046 25,0032

2 Alkohol-Asam 25,0031

0,5625 2,25 25,0051 25,0022

3 Aseton-Asam 25,0051

0,6725 2,69 25,0036 25,0055

Perhitungan rendamen ekstrak

Rendamen =#$%&'$()'%&(

#$%&')&*+$,-100%

=

,1231

31,

45-100%

= 2,29

Ekstrak sebanyak 1 mg dilarutkan dalam 10 ml metanol absolute

Ekstrak Metanol, Etanol dan Aseton BKH

Larutan stok ekstrak

Larutan ektsrak 10, 20, 30, 40 dan 50 bpj

Ditambahkan DPPH 75 l Diinkubasi pada suhu 37C selama 30 menit Di ukur absorbansi dengan Elisa Reader (515 nm)

Mikroplate

Hasil

Pembanding Vitamin C

Larutan pembanding 2,5, 5, 7,5, 10 dan 12,5 bpj

Data absorbansi Perhitungan IC50

15

Lampiran III. Perhitungan Kadar Antosianin Total

Tabel 5. Data Absorban pada pH 1

No Ekstrak Volume (L) Bobot sampel

(g)

pH 1 Absorban

700 nm 509 nm A(509 - 700)

1 Aseton 1 0.058 25.0051 0.011 0.507 0.496 2 Aseton 2 0.067 25.0036 0.216 0.792 0.576 3 Aseton 3 0.051 25.0055 0.037 0.608 0.571 4 Alkohol 1 0.071 25.0031 0.425 1.332 0.908 5 Alkohol 2 0.072 25.0051 0.278 0.945 0.667 6 Alkohol 3 0.072 25.0022 0.337 1.231 0.894 7 Metanol 1 0.073 25.0040 0.403 1.435 1.032 8 Metanol 2 0.070 25.0046 0.418 1.405 0.986 9 Metanol 3 0.071 25.0032 0.437 1.325 0.887

Tabel 6. Data Absorban pada pH 4.5


(g)

pH 4.5 Absorban

700 nm 509 nm A(509 - 700) 1 Aseton 1 0.058 25.0051 0.019 0.123 0.104 2 Aseton 2 0.067 25.0036 0.210 0.416 0.206 3 Aseton 3 0.051 25.0055 0.024 0.175 0.151 4 Alkohol 1 0.071 25.0031 0.353 0.732 0.379 5 Alkohol 2 0.072 25.0051 0.189 0.411 0.222 6 Alkohol 3 0.072 25.0022 0.300 0.585 0.285 7 Metanol 1 0.073 25.0040 0.245 0.534 0.289 8 Metanol 2 0.070 25.0046 0.309 0.564 0.255 9 Metanol 3 0.071 25.0032 0.253 0.523 0.270

16

Tabel 7. Perhitungan kadar Antosianin beras ketan Hitam


(g) A

(pH 1) A

(PH 4.5)

Absorban (A) %

Kadar Rata- rata (ApH1-

ApH4.5) 1 Aseton 1 0,058 25,0051 0,496 0,104 0,392 0,076

0,076 2 Aseton 2 0,067 25,0036 0,576 0,206 0,370 0,083

3 Aseton 3 0,051 25,0055 0,571 0,151 0,420 0,071

4 Alkohol 1 0,071 25,0031 0,908 0,379 0,529 0,125

0,126 5 Alkohol 2 0,072 25,0051 0,667 0,222 0,445 0,107

6 Alkohol 3 0,072 25,0022 0,894 0,285 0,609 0,146

7 Metanol 1 0,073 25,0040 1,032 0,289 0,743 0,181

0,166 8 Metanol 2 0,070 25,0046 0,986 0,255 0,731 0,171

9 Metanol 3 0,071 25,0032 0,887 0,270 0,617 0,146

Contoh Perhitungannya :

Aseton 1 - Perhitungan Absorbansi dari sampel

A = [(A509 A700)pH 1 (A509 A700)pH 4,5] A = (0,507 0,011) (0,123 0,019) = 0,496 - 0,104 = 0,392

Perhitungan kandungan antosianin

Total antosianin (%b/b) =

%

=

,453885,31,19

%

3:5

31,

1

= 0,076 % b/b

17

Lampiran IV. Perhitungan Aktivitas Penangkapan Radikal Bebas DPPH

Tabel 8. Data Absorbans DPPH pada perlakuan dengan ekstrak BKH Kons. Ekstrak BKH A Ekstrak BKH B Ekstrak BKH C Blanko Abs. %inhib. Blanko Abs. %inhib. Blanko Abs. %inhib.

10 ppm

0,844 0,778 7,81 0,865 0,614 29,01 0,865 0,498 42,42 0,862 0,775 10,09 0,832 0,629 24,39 0,832 0,495 40,50 0,851 0,773 9,16 0,859 0,643 25,14 0,859 0,491 42,84 0,863 0,778 9,84 0,848 0,623 26,53 0,848 0,487 42,57 0,881 0,740 16,00 0,843 0,640 24,08 0,843 0,482 42,82

20 ppm

0,844 0,686 18,72 0,865 0,464 46,35 0,865 0,379 56,18 0,862 0,640 25,75 0,832 0,481 42,18 0,832 0,361 56,73 0,851 0,646 24,08 0,859 0,476 44,58 0,859 0,362 57,85 0,863 0,683 20,85 0,848 0,463 45,50 0,848 0,375 55,77 0,881 0,646 26,67 0,843 0,471 44,12 0,843 0,366 56,58

30 ppm

0,844 0,561 33,53 0,865 0,361 58,26 0,865 0,274 68,83 0,862 0,581 32,59 0,832 0,370 55,52 0,832 0,285 65,74 0,851 0,543 36,19 0,859 0,370 56,92 0,859 0,287 66,58 0,863 0,524 39,28 0,848 0,380 55,18 0,848 0,286 66,27 0,881 0,512 41,88 0,843 0,357 57,65 0,843 0,283 66,42

40 ppm

0,844 0,480 43,12 0,865 0,284 67,16 0,865 0,219 74,68 0,862 0,475 44,89 0,832 0,290 65,14 0,832 0,213 74,39 0,851 0,497 41,59 0,859 0,297 65,24 0,859 0,220 74,38 0,863 0,495 42,64 0,848 0,281 66,86 0,848 0,216 74,52 0,881 0,491 44,26 0,843 0,277 67,14 0,843 0,213 74,73

50 ppm

0,844 0,416 50,71 0,865 0,209 75,83 0,865 0,144 83,35 0,862 0,415 51,85 0,832 0,214 74,27 0,832 0,157 81,12 0,851 0,407 52,17 0,859 0,261 69,61 0,859 0,163 81,02 0,863 0,406 52,95 0,848 0,212 75,00 0,848 0,162 80,89 0,881 0,412 52,23 0,843 0,217 74,25 0,843 0,161 80,90

18

Tabel 9. Data Absorbans DPPH pada perlakuan dengan vitamin C Kons. Vitamin C Blanko Absorbansi %inhibisi

2,5 ppm

0,818 0,756 7,5 0,826 0,743 4,19 0,810 0,776 10,04 0,831 0,726 12,6 0,816 0,713 12,6

5 ppm

0,818 0,582 28,85 0,826 0,568 31,48 0,810 0,555 31,23 0,831 0,560 31,37 0,816 0,560 32,61

7,5 ppm

0,818 0,411 49,75 0,826 0,414 50,61 0,810 0,400 49,87 0,831 0,416 47,91 0,816 0,425 49,93

10 ppm

0,818 0,296 63,81 0,826 0,286 66,66 0,810 0,270 65,37 0,831 0,267 63,97 0,816 0,294 67,87

12,5 ppm

0,818 0,187 77,13 0,826 0,172 80,00 0,810 0,162 79,17 0,831 0,198 81,37 0,816 0,152 76,17

19

Tabel 10. Hasil Perhitungan Nilai IC50 Eksrak BKH dengan Metode DPPH No. Sampel IC50 (g/ml)

1 Ekstrak Metanol

Replikasi 1 50,58 Replikasi 2 47,75 Replikasi 3 47,42 Replikasi 4 46,34 Replikasi 5 45,49

2 Ekstrak Etanol


3 Ekstrak Aseton


4 Vitamin C


Contoh perhitungan IC50 pengikatan radikal bebas DPPH :

& = 1,810# = 1,872% = 0,986

> = & + #-

x =5 1,810

1,872

- = 1,704

Log IC50 = 50,58 g/ml

Blanko Konsentrasi Absorbansi % inhibisi Log (X) Probit (Y)

0,844

10 0,778 7,81 1 3,76 20 0,686 18,72 1,30 4,10 30 0,561 33,53 1,47 4,57 40 0,480 43,12 1,60 4,82 50 0,416 50,71 1,69 5,02

20

Tabel 11. Harga Probit Sesuai Persentasenya

PERSENTASE

Probit

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

-

3,72

4,17

4,48

4,75

5,00

5,25

5,52

5,84

6,25

2,67

3,77

4,19

4,50

4,77

5,03

5,28

5,55

5,88

6,34

2,95

3,82

4,23

4,53

4,80

5,05

5,31

5,58

5,92

6,41

3,12

3,87

4,26

4,56

4,82

5,08

5,33

5,61

5,95

6,48

3,25

3,92

4,29

4,59

4,85

5,10

5,36

5,64

5,99

6,55

3,36

3,95

4,33

4,61

4,87

5,13

5,39

5,67

6,04

6,64

3,45

4,01

4,36

4,64

4,90

5,15

5,41

5,71

6,08

6,75

3,52

4,05

4,39

4,67

4,92

5,18

5,44

5,74

6,13

6,88

3,59

4,08

4,42

4,69

4,95

5,20

5,47

5,77

6,18

7,05

3,66

4,12

4,45

4,72

4,97

5,23

5,50

5,81

6,23

7,33

99

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

7,33 7,37 7,41 7,46 7,51 7,58 7,66 7,75 7,88 8,09

Sumber : (Soekardjo, B. Siswandono. 1995. Prinsip-prinsip Rancangan Obat).

21

Lampiran V. Data Statistik

Oneway

Post Hoc Tests

Homogeneous Subsets

Descriptives

IC50 DPPH

5 23,3260 2,84955 1,27436 19,7878 26,8642 18,83 26,605 47,1500 1,26537 ,56589 45,5788 48,7212 45,49 48,755 14,4980 ,29141 ,13032 14,1362 14,8598 14,22 14,995 7,1108 ,20075 ,08978 6,8615 7,3601 6,93 7,38

20 23,0212 15,52549 3,47160 15,7550 30,2874 6,93 48,75

ekstrak etanolekstrak metanolekstrak asetonVitamin CTotal

N Mean Std. Deviation Std. Error Lower Bound Upper Bound

95% Confidence Interval forMean

Minimum Maximum

ANOVA

IC50 DPPH

4540,388 3 1513,463 614,835 ,00039,385 16 2,462

4579,774 19

Between GroupsWithin GroupsTotal

Sum ofSquares df Mean Square F Sig.

IC50 DPPH

5 7,11085 14,49805 23,32605 47,1500

1,000 1,000 1,000 1,000

KelompokVitamin Cekstrak asetonekstrak etanolekstrak metanolSig.

DuncanaN 1 2 3 4

Subset for alpha = .05

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.Uses Harmonic Mean Sample Size = 5,000.a.

22

Correlations

Antosianin Total DPPHx

Antosianin Total Pearson Correlation 1 .901**

Sig. (2-tailed) .001 N 9 9

DPPHx Pearson Correlation .901** 1

Sig. (2-tailed) .001

N 9 9

**. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).

Lampiran VI. Gambar

Gambar 3.Foto Beras Ketan Hitam Gambar 4. Foto Ekstrak BKH yang dilarutkan

Gambar 5. Foto Mikrowell Plate Gambar 6. Foto Elisa Reader

23

Lampiran VII. Bukti Determinasi Sampel Beras Ketan Hitam

Review BKH

Documents