RESUME
Potensi Sistem Pelepasan Obat Target pada Tumor yang Terdiri
dari Fragmen Peptida Spesifik MMP-2 dengan Karakteristik
Self-assemblingObat sitotoksik seperti paclitaxel harus bekerja
spesifik pada sel tumor agar tidak merusak sel normal disekitarnya.
MMP (matriks metalloproteinase) adalah target potensial untuk
terapi kanker, ada banyak hal menarik dalam mengembangkan inhibitor
MMP sintetik, terutama untuk MMP-2 dan MMP-9. MMP-2 (gelatinase A,
72 kDa) dan MMP-9 (gelatinase B, 92 kDa) memainkan peran penting
dalam perkembangan tumor, angiogenesis, dan metastasis. Enzim ini
membantu sel-sel tumor untuk bertahan hidup dan tumbuh dengan
merusak matriks ekstraselular, melepaskan faktor pertumbuhan untuk
merangsang proliferasi sel dan faktor angiogenesis untuk
mempromosikan pembentukan pembuluh darah. Matriks
metalloproteinases (MMPs), yang mampu mendegradasi matriks
ekstraselular dan membran sel pada sel tumor, yang menyebabkan
metastasis di tempat yang jauh dari tumor primer.MMP ini dapat
dihambat oleh bahan antiangiogenik seperti senyawa golongan reaktif
zinc-chelating (tiol atau hydroxamate) dan beberapa inhibitor MMP,
tetapi tidak ada inhibitor spesifik untuk MMP. Sistem drug
targeting pada MMP dirancang dalam bentuk prodrug dimana obat akan
terikat secara kovalen pada MMP. Adanya peptida MMP-spesifik
memungkinkan pelepasan obat pada MMP-2. Pengembangan klinik peptide
MMP-spesifik dan konjugat obat sitotoksik oleh stabilitas obat yang
sangat rendah. Sehingga penelitian ini merancang peptida
self-assembling untuk meningkatkan stabilitas. Peptida MMP-spesifik
adalah fitur self-assembling melalui integrasi urutan aktif untuk
pemotongan MMP. Peptida yang dimodifikasi mampu membentuk
supramolekul mengandung obat antikanker dengan cara
self-assembling. Peptida self-assembling ini dapat memproduksi
supramolekul berrongga di mana molekul obat dapat dimuat di
dalamnya. Fitur self-assembling ini jika dikombinasi dengan bahan
target MMP-2 mungkin menghasilkan sistem pelepasan obat yang baru
yang memiliki spesifikasi yang baik dan stabilitas berkepanjangan.
sehingga rancangan ini terdapat dua fungsi sebagai carrier
pelepasan obat, yaitu, pembentukan kompleks dapat meningkatkan
stabilitas obat dan protein MMP-2 bisa mengaktifkan untuk pelepasan
obat dengan proteolisis spesifik. Supramolekul dibentuk oleh
substrat peptide self-assembling MMP dan paclitaxel yang telah
stabil kemudian obat bisa dilepas pada pemotongan spesifik oleh
MMP-2. Heptapeptide digunakan sebagai fragmen peptide substrat
spesifik MMP-2. Setelah memodifakasi fragmen ini dengan fitur
self-assembling, paclitaxel diisikan untuk bentuk dari supramolekul
yang mengandung obat. SAMTA7 (sebutan calon obat pada penelitian
ini) merupakan carrier pelepasan obat terkontrol dan sustained.
SAMTA7 memberikan aktivitas antiproliferatif pada sel tumor HT1080
yang mengekspresikan MMP-2. Dengan rancangan ini bioavailabilitas
obat dalam darah juga diperpanjang.Metode1. Kultur sel HT1080 dan
HEp2
2. Analisis paclitaxel dan campuran peptide substrat MMP
self-assembled Menggunakan HPLC
3. Pengujian proteolisis MMP-2
Pengujian proteolisis digunakan untuk menentukan kompleks
menggunakan modifikasi peptida dan paclitaxel melalui pemotongan
menggunakan enzim MMP-2. Berbagai macam kompleks peptida dan
paclitaxel dengan perbandingan molar 1:10 diinkubasi dengan dan
tanpa MMP-2 (5 g) dalam buffer fosfat saline (pH 7,0) yang
mengandung 100 M ZnSO4. HPLC-MS digunakan untuk memonitoring jumlah
paclitaxel bebas yang terlepas dari campuran.4. Pengukuran HPLC-MS
untuk memonitoring jumlah paclitaxel bebas yang terlepas dari
campuran.5. Pengujian MTT
(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide),
untuk mengetahui toksisitas dari paclitaxel bebas dan juga kompleks
SAMTA7-paclitaxel.6. Pengujian Scratch untuk mengetahui kecepatan
inhibisi metastasis yang dihitung menggunakan rumus :
Kecepatan inhibisi = (jarak kelompok uji setelah inhibisi jarak
kelompok control setelah inhibisi jarak terbesar utk
inhibisi)/jarak terbesar utk pemulihan x 100
7. Pengobatan tikus yang membawa xenograft tumor manusia yang
telah diinokulasi dengan impaltasi sel tumor HT1080, HEp2, atau
U-87MG. tumor dibiarkan tumbuh sekitar 100 mm3 pada punggung tikus
yang mirip dengan kondisi klinis dimana pengobatan dimulai setelah
tumor telah tumbuh. Hewan uji diobati dengan paclitaxel bebas
ataupun kompleks SAMTA7-paclitaxel via intravena dengan dosis (3
mg/kg/BB) tiap 5 hari. Control hanya menggunakan SAMTA7 saja. Waktu
bertahan hidup dicatat mulai hari setelah pengijeksian tumor, dan
berat dan ukuran tumor dimonitoring 3 x dalam seminggu selama
periode uji 30 hari.Ukuran tumor dihitung dengan rumus volume elips
berdasarkan rumus:Ukuran = lebar2 x panjang x /68. Simulasi
dinamika molecular untuk analisis pembentukan supramolekular dari
kompleks SAMTA7-paclitaxel
RESULT
Modifikasi dari 7 macam peptida yang telah disintesi dan
divalidasi yang mana yang sesuai dengan pemotongan urutan basa
PVGLIG yang merupakan fragment substrat spesifik MMP-2 termasuk
penambahan fragmen EAK, RADA, dan modifikasi amfipatic.
Peptida yang sudah dirancang sedemikian rupa di inkubasi dengan
paklitasel bebas. Lalu dilanjutkan dengan studi HPLC untuk
mengindentifikasi peptida mana yang mampu membentuk supramolekul
dengan obat paclitaxel. Hasilnya adalah sebagai berikut (Gambar
1):
Hasil tersebut menyatakan bahwa 1a dan 1b menunjukkan spectrum
SAMTA7 dan paklitasel bebas tidk dapat berikatan dengan rasio molar
1:1. Gambar 1c (rasio molar 1:1) juga sama kondisinya dengan gambar
1a dan 1b. Gambar 1d dengan rasio molar 1:5 menunjukkan adanya
ikatan kompleks antara SAMTA7-paklitasel yang terdeteksi pada waktu
retensi puncak 13,5 menit, serta puncak yang menyatakan paklitasel
bebas kadarnya berkurang di waktu 30 menit. Gambar 1e dengan rasio
1:6 menunjukkan puncak paklitasel bebas menghilang da nada puncak
di menit 13,5 yang menunjukkan kompleks antara SAMTA7 dengan
paklitasel bebas.
Formasi supramolekul SAMTA7-paclitaxel perlu untuk diketahui
apakah formasi supramolekul tersebut mampu melepas paclitaxel
dengan adanya enzim MMP-2 dengan studi MS dalam waktu 24 jam.
Hasilnya terlihat pada Gambar 2 (gambar berikut ini).
Supramolekul yang terbentuk oleh SAMTA7 mulai melepaskan obat
setelah di inkubasi dengan MMP-2 selama 2 jam. Paclitaxel terlihat
terlepas secara sempurna dari formasi supramolekul dalam waktu 24
jam. Hal tersebut menyatakan bahwa peptida SAMTA7 membungkus secara
sempurna paclitaxel dibandingkan peptida lainnya.
Dilakukan juga tes MTT dan tes awal sel untuk menilai aktivitas
antitumor dari formasi supramolekul yang terbentuk dari
SAMTA7-paclitaxel. Uji ini melihat aktivitas antiproliferasi dari
SAMTA7-paclitaxel secara spesifik terhadap MMP-2.
Pada line sel HT1080 dengan MMP-2 menghasilkan respon cepat
kematian sel. Pengobatan denagn supramolekul SAMTA7-paclitaxel
mengakibatkan kerugian pada sel tumor tersebut bila dibandingkan
dengan sel HEp2 yang tidak mengekspresikan MMP-2. Dari hasil MTT
terlihat bahwasupramolekul SAMTA7-paclitaxel memiliki kemampuan
menghambat lini sel yang mengekspresikan MMP-2 seperti pada HT1080.
Selain itu pada uji MTT ditemukan bahwa ada Kristal paclitaxel
disekitas sel HT1080 saja Hal itu dianggap bahwa pelepasan kompleks
paclitaxel secara spesifik dengan adanya MMP-2 paclitaxel telah
jenuh dan kemudian mengkristal. Temuan ini memberikan penjelasan
lain bahwa kompleks SAMTA7-paclitaxel dapat melepaskan paclitaxel
di MMP-2 dengan proses degradasi tertentu.MMP-2 memainkan peran
penting dalam perkembangan sel tumor, proses angiogenesis tumor,
dan proses metastasis. Kemampuan dari supramolekul
SAMTA7-paclitaxel dalam mengahambat proses metastasis sel tumor
dievaluasi dengan uji awal sel (cellular scratch assay). Hasilnya
dapat terlihat pada Gambar.3
Hasil tersebut menunjukkan bahwa supramolekul SAMTA7-paclitaxel
secara signifikan menghambat sel HT1080 dibandingkan dengan sel
HEp2 dengan peningkatan 5,3 kali lipat dalam aktivitasnya sebagai
antimigratory dimana sel HT1080 memiliki protein MMP-2 yang akan
mempengaruhi secara spesifik pelepasan paclitaxel pada peptida
(SAMTA7) spesifik self-assembling. Dilakukan pengujian pada tikus
yang mempunyai sel HT1080 dan HEp2, atau xenograft U-87MG untuk
melihat efek dari supramolekul SAMTA7-paclitaxel dibandingkan
dengan paclitaxel bebas saja. Akan dipantau volume tumor setelah
pengobatan. Hasilnya adalah sebagai berikut (Gambar 4) :
Dari hasil tersebut gambar 4a (sel tumor Ht1080) menunjukkan
bahwa ukuran tumor itu sangat berkurang dengan penggunaan
supramolekul SAMTA7-paclitaxel dibandingkan dengan paclitaxel
bebas. Namun, supramolecule memiliki aktivitas antitumor yang buruk
pada tikus dengan sel tumor HEp2 dan U-87MG , seperti yang
ditunjukkan pada Gambar 4B dan C. Tikus dengan sel tumor HT1080
diberi phosphate-buffered saline (control), paclitaxel bebas, dan
kompleks SAMTA 7-paclitaxel. Gambar 4D menunjukkan bahwa SAMTA
7-paclitaxel dapat meningkatkan tingkat kelangsungan hidup pada
tikus tersebut.
Gambar di atas (Gambar. 5) menunjukkan gambar 5A merupakan
SAMTA7 tunggal dengan konformasi hairpin-seperti interaksi dengan
fragmen RADA. Konformasi ini dieksplorasi untuk mengenal peptida
MMP-2. Fragmen PVGLIG rentan terhadap proteolysis MMP-2. Gambar 5B
menunjukkan SAMTA7 dengan sifat self-assembling dan mampu
membungkus paclitaxel di dalamnya menjadi formasi supramolekul ,
namun formasi itu tidak mempengaruhi efek terapi.
MMP-2 ditargetkan untuk system pelepasan obat secara spesifik
terhadap substrat MMP-2 dari PVGLIG. Pada hexapeptida, PVLGLIG,
akan membungkus obat dengan sifat self-assembling melalui
modifikasi struktur untuk mendapatkan struktur SAMTA7 yang memiliki
dua sifat, yaitu self-assembling dan kemudian membungkus obat dalam
rongga supramolekul. Formasi tersebut dianggap akan meningkatkan
indeks terapi karena aktivitasnya spesifik terhadap target tersebut
ditingkatkan.
CONCLUTIONDari hasil modifikasi obat tersebut yang memiliki
sifat pelepasan obat secara spesifik terhadap peptida MMP-2 akan
meningkatkan waktu paruh dalam darah dikarenakan obat terbungkus
dalam formasi supramolekul dan akan terlepas jika bertemu dengan
peptida MMP-2 dan menurunkan toksisitas.