UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – NUPEB PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIENCIAS BIOLÓGICAS Resposta ao estresse ácido em Saccharomyces cerevisiae e efeito protetor do íon sódio na morte celular induzida por ácido AUTORA: GILZEANE DOS SANTOS SANT’ANA ORIENTADOR: PROF. Dr. IESO DE MIRANDA CASTRO Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para a obtenção do Título de Doutor(a) em Ciências Biológicas, área de concentração: Biologia Molecular Ouro Preto – Minas Gerais Maio de 2009
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – NUPEB
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIENCIAS BIOLÓGICAS
Resposta ao estresse ácido em Saccharomyces cerevisiae e efeito protetor do íon sódio na
morte celular induzida por ácido
AUTORA: GILZEANE DOS SANTOS SANT’ANA
ORIENTADOR: PROF. Dr. IESO DE MIRANDA CASTRO
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para a obtenção do Título de Doutor(a) em Ciências Biológicas, área de concentração: Biologia Molecular
Ouro Preto – Minas Gerais Maio de 2009
II
RESUMO
Saccharomyces boulardii é usada como probiótico para previnir ou tratar distúrbios
gastrointestinais ocasionados pelo uso excessivo de antibióticos, ou em enterites agudas. A
fim de exercer os efeitos benéficos, os probióticos devem ter um mecanismo que os
protegem do estresse do ambiente gástrico intestinal. Neste trabalho analisamos as
diferenças metabólicas na resposta ao estresse ácido de S. boulardii comparativamente a S.
cerevisiae W303, bem como a proteção conferida pela adição do íon sódio nesta condição.
Como esperado, S. boulardii exibiu maior tolerância ao meio gástrico simulado frente às
outras linhagens de S. cerevisiae. Sob estas condições o baixo pH (pH 2) foi o principal
fator responsável pela diminuição da viabilidade celular. Neste trabalho observamos que a
adição de baixas concentrações de cloreto de sódio foi mais eficaz do que a adição de
outros sais na proteção das células em condições de estresse ácido. O efeito protetor do Na+
na viabilidade de leveduras, sob condições ácidas, foi testado utilizando cepas de S.
cerevisiae com deleções nos genes que codificam proteínas envolvidas na homeostase de
sódio, como por exemplo, os genes que codificam para a bomba Na+ATPase (ena1-4∆) e
genes codificadores dos canais trocadores Na+/H+ (nha1∆) e Na+/H+ pré-vacuolar (nhx1∆).
O efeito protetor de NaCl está relacionado à influência do íon Na+ no potencial elétrico de
membrana citoplasmática. Além disso, a ausência ou baixa expressão do gene que codifica
para a proteína Ena1-4p sugere uma relação direta com os níveis basais do potencial de
membrana citoplasmática das células de leveduras. É provável que a resistência de S.
boulardii e do mutante ena1-4∆ ao estresse ácido (na ausência ou presença de NaCl), deve-
se ao elevado potencial basal da membrana destas células e ao fato do íon sódio retardar a
despolarização da membrana induzida pelo pH 2.0. Além disso, o maior conteúdo de
trealose observado em S. boulardii pode ter contribuído para a resposta mais eficiente
frente ao estresse ácido dos sinais metabólicos avaliados.
III
ABSTRACT
Saccharomyces boulardii as a probiotic is used to prevent or treat gastrointestinal disorders
caused by excessive use of antibiotics, or in acute enteritis. In order to exert beneficial
effects, the probiotic must have a mechanism that protects the gastric intestinal stress
environment. We examined the differences in metabolic response to acid stress in
S. boulardii compared with S. cerevisiae W303 and the protection conferred by the addition
of sodium ion in this condition. As expected, S. boulardii exhibited higher tolerance to
simulated gastric environment facing the other strains of S. cerevisiae. Under these
conditions the low pH (pH 2) was the main factor responsible for the decrease in cell
viability. In this work we observed that the addition of low concentrations of sodium
chloride was more effective than the addition of other salts in the protection of cells under
conditions of acid stress. The protective effect of Na + on the viability of yeast cells under
acidic conditions, was tested using using S. cerevisiae null mutants for Na+-ATPases (ena
1-4 null mutant), for Na+/H+ antiporter (nha1∆) and Na+/H+ antiporter prevacuolar (nhx1∆).
The protective effect of NaCl relates with the effect of ion Na+ in electric membrane
potential. Additionally, the absence or low expression/activity of Ena proteins seems to be
closely related to basal membrane potential of yeast cells. Moreover, the absence or low
expression of the gene coding for protein Ena1-4p suggests a direct relationship with the
levels of membrane potential of yeast cells. It is likely that the resistance of S. boulardii
and ena1-4∆ mutant to acid stress (in the absence or presence of NaCl), due to the high
potential of the basal membrane of these cells and because of the ion slowing of membrane
depolarization induced by pH 2.0. Furthermore, the highest concentration of trehalose
observed in S. boulardii may have contributed to a more efficient response against the
stress of acid metabolic signals evaluated.
IV
Trabalho desenvolvido no Laboratório de Biologia Celular e Molecular do Núcleo de
Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, sob a orientação
do Professor Dr. Ieso de Miranda Castro e com auxílio financeiro da Coordenadoria de
Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES), da Fundação de Amparo a
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), do Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e da Universidade Federal de Ouro
(uma isoenzima da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase) e tps2∆ (trealose-6-fosfato
fosfatase) são sensíveis a 2 mM de sorbato no meio de crescimento (Cheng, L. e cols.,
1999).
Os ácidos orgânicos inibem a resposta ao estresse de choque térmico e
aumentam a frequência de mutações que causam deficiência no metabolismo
respiratório de S. cerevisiae, quando cultivada a elevadas temperaturas (Cheng, L. e
cols., 1999). O tratamento de células de S. cerevisiae com ácidos orgânicos inibe a
síntese das Hsp e, consequentemente, a termotolerância (Piper, P. e cols., 1998).
A presença de ácido acético na concentração de 50 mM no meio de crescimento
(pH 3,5) semelhantemente ao ácido sórbico, diminui o pH citosólico e aumenta a
atividade da H+-ATPase na membrana plasmática de células de S. cerevisiae (Carmelo,
V. e cols., 2005). Linhagens de panificação dessa levedura foram sensíveis a 0,4% de
ácido acético (v/v) em meio YEP ágar (meio sem glicose). Nessas condições, a
sobrevivência da maioria das linhagens testadas foi inferior a 10% do total de células
inoculadas no meio (Lewis, J. G. e cols., 1997). Células de S. cerevisiae pré-adaptadas
ao estresse ácido, quando presentes em meio mínimo, sem glicose, contendo 1mM de
ácido benzóico (pH 4,5), acumulam uma grande quantidade de benzoato no meio
intracelular, porém quando a glicose é adicionada ao meio de cultura as células
eliminam cerca de 90% do ácido benzóico absorvido. Isso mostra que a célula depende
de glicose ou de outra fonte de energia, para gerar ATP e fazer funcionar a H+-ATPase e
a proteína Pdr12p, restaurando a homeostase do pH intracelular ( Henriques, M. e cols.,
1997).
Contribuindo para este conjunto de evidências, Ludovico, P. e cols. (2001)
verificou que o tratamento de S. cerevisiae com 20-200 mM de ácido acético, durante
200 minutos a pH 3,0, conduzia à perda de viabilidade das células. Contudo, a
16
concentração de ácido necessária para a ocorrência de um processo ativo de morte
celular revelou-se crítica. Com efeito, enquanto que a morte celular observada para
concentrações acima de 80 mM não era inibida pela cicloheximida (inibidor da síntese
protéica) e estava associada a alterações ultra-estruturais típicas de necrose, a morte
induzida por concentrações mais baixas de ácido acético (20-80 mM) foi parcialmente
inibida por cicloheximida. Nestas condições foi possível detectar diferentes alterações
estruturais típicas de apoptose nomeadamente: i) condensação extensiva de cromatina
na periferia do invólucro nuclear observada por microscopia eletrônica de transmissão;
ii) exposição de fosfatidilserina na superfície da membrana citoplasmática avaliada por
reação com anexina V conjugada com FITC e iii) ocorrência de quebra de DNA
avaliada por TUNEL. O fato de o ácido acético ser um subproduto da fermentação
alcoólica produzida por S. cerevisiae e, portanto, bastante corriqueiro no seu ambiente
natural, parece indicar que este processo, à semelhança do que acontece nos eucariotos
superiores, pode ter um papel fisiológico relevante no ciclo de vida da levedura.
No trabalho de Claret, S. e cols. (2005) foi avaliado o efeito da exposição de
S. cerevisiae em estresse em baixo pH (HCl) e a ativação da via PKC como resposta.
Durante condições de crescimento em baixo pH a via PKC foi ativada, e o sensor
Mid2p foi identificado como decisivo na ativação desta via, demonstrando que os
componentes Bck1p e Slt2p da cascata MAPK são essenciais em ambiente ácido. Além
desses componentes, também foi constatado o envolvimento de RGD1 na via PKC em
pH ácido, comprovando a interação de duas vias, uma envolvendo o sensor Mid2p e o
outro envolvendo Rgd1p, ambos convergem na via de integridade celular, traduzindo a
sinalização em pH baixo. Demonstraram também, que a interrupção das duas vias
envolvidas gera mutantes incapazes de sobreviver sob condições de estresse ácido.
Entretanto, em contraste do que foi observado com os mutantes bck1∆ ou slt2∆, o
suporte osmótico não eliminou a letalidade dos mutantes rgd1∆ e rgd1∆mid2∆
provocada pelo choque ácido, sugerindo que a ação mediada por Rgd1p na tolerância ao
estresse ácido não está limitada a via PKC.
Malakar, D. e cols. (2006) investigaram a função protetora da adição de S-
adenosil-L-metionina (Adomet) nas células de S. cerevisiae expostas ao estresse ácido
17
(10 mM HCl, pH∼2), demonstrando que este estresse provoca redução do espaço
periplasmático da membrana plasmática, e substancial aumento no número de vacúolos
no citoplasma, entretanto a adição de 1mM de Adomet, nesta condição, além de reduzir
o número de vacúolos formados, amenizou as variações de pH interno observadas em
estresse ácido.
Resultados preliminares no nosso laboratório demonstraram respostas a
diferentes estresses pelo probiótico S. boulardii e que esta cepa responde melhor aos
estresses de temperatura e ao ambiente gástrico simulado, quando comparado a cepas
S. cerevisiae de laboratório (Fietto, J. L. R. e cols., 2004). Neste trabalho, evidenciamos
a resistência de S. boulardii ao estresse ácido, além de observar que a adição de sódio,
um componente do suco gástrico, em pH 2, confere significativa proteção a esta cepa
probiótica. Os mecanismos pelos quais o estresse ácido afeta o metabolismo das cepas
S. cerevisiae avaliadas, e as diferenças na resposta de S. boulardii frente à proteção
conferida pela adição de íons, abrangem o que procuramos elucidar com nossos estudos.
18
Objetivos
19
2 - Objetivos
2.1 - Objetivo Geral
Caracterizar a resposta da levedura S. boulardii ao pH ácido e o efeito de NaCl,
em baixas concentrações, nesta resposta.
2.2 - Objetivos Específicos
• Comparar a viabilidade de diferentes cepas Saccharomyces cerevisiae frente a
uma simulação do ambiente gástrico;
• Identificar os componentes do ambiente gástrico responsáveis pela perda de
viabilidade celular;
• Estudar o efeito do pH ácido (HCl / pH 2) sobre a viabilidade de diferentes
cepas S. cerevisiae;
• Avaliar o efeito da adição de diferentes íons sobre a viabilidade celular em pH
ácido (HCl / pH 2);
• Investigar possíveis mecanismos envolvidos no efeito protetor de sódio, por
meio de medidas da expressão dos genes envolvidos na homeostase deste íon;
medidas de acúmulo e extrusão de sódio; medidas de potencial de membrana,
em cepas com deleções em genes que codificam proteínas envolvidas na
homeostase de sódio;
• Verificar possíveis correlações entre a resistência ao pH baixo e atividade da H+-
ATPase, o potencial de membrana e o pH intracelular;
20
• Verificar a homeostase do cálcio em células submetidas ao estresse ácido (pH 2 /
HCl);
• Determinar a capacidade tamponante das células e dos extratos celulares obtidos
de células submetidas ao estresse ácido (pH 2 / HCl);
• Analisar a composição lipídica de membrana das cepas Saccharomyces, em
reposta ao estresse ácido;
• Correlacionar os níveis de reservas energéticas com a reposta ao estresse ácido.
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Material e Métodos
22
3 - Material e Métodos
3.1 - Cepas Saccharomyces utilizadas nos experimentos
Nos experimentos foram utilizadas cepas de Saccharomyces cerevisiae e
mutantes com deleções nos genes envolvidos no transporte de sódio. As cepas utilizadas
estão demonstradas na tabela 1:
Cepas Genótipo Procedência
Saccharomyces cerevisiae var. boulardii
Selvagem Floratil®,Merck S.A.
UFMG 20 Selvagem Martins, F. S. e cols., 2008
UFMG 24 Selvagem Martins, F. S. e cols., 2008
W303 MATa leu2-3,112 ura3-1 trp1-1 his3-11,15 ade2-1 can1-100 GAL mal SUC2
Johan M. Thevelein, J.M. Laboratorium voor Moleculaire Celbiologie, Katholieke Universiteit Leuven, Belgium.
LBCM 479 W303 Matα ena1 :: HIS3 :: ena4 José Ramos Department of Microbiology, ETSIAM, Edificio Severo Ochoa, Campus de Rabanales, University of Cordoba, Spain
LBCM 511
W303 Matα nha :: LEU2 Hana Sychrová, H. Departments of Membrane Transport, Institute of Physiology,
4.3 - Participação da H+- ATPase de membrana plasmática em resposta ao estresse
gástrico
Quando a levedura enfrenta condições de baixo pH às células necessitam do
sistema de efluxo de prótons H+. Geneticamente bem caracterizadas, as H+-ATPases de
S. cerevisiae e de Schizosacharomyces pombe são codificadas pelo gene PMA1
(Serrano, R. e cols., 1986). Um segundo gene, PMA2, codificando para a H+-ATPase e
mostrando alta homologia com PMA1, está presente em ambos os microrganismos, no
entanto, a Pma2 p é expressa em níveis muito baixos e sua função fisiológica ainda não
está bem estabelecida (Portillo, F., 2000).
Sabe-se também que Pma1p gera um gradiente eletroquímico de prótons capaz
de impulsionar transportes secundários, contribuindo para regulação do pH intracelular
e por conseqüência a viabilidade. Portanto investigamos a atividade H+-ATPase em
estresse ácido na presença de baixos níveis de sódio, em S. boulardii, S. cerevisiae
W303 e mutante correspondente ena1-4∆ (Figura 8).
A atividade H+-ATPase foi 2 vezes maior nas cepas S. boulardii e no mutante
ena1-4∆, no qual demonstra uma contribuição positiva da atividade Pma1p ao estresse
ácido submetido. Ativação da H+-ATPase in vivo é essencial para conter os efeitos de
vários tipos de estresses, incluindo o decréscimo do pH (Carmelo, V. e cols., 1996).
Apesar dos resultados de ativação da H+-ATPase terem sido maiores em resposta ao
estresse por S. boulardii, não visualizamos nenhuma correlação entre atividade e
variações no pH interno da cepa probiótica e de S. cerevisiae W303.
64
Figura 8 – Ativação da H+-ATPase de membrana plasmática nas cepas S. boulardii (♦),
S. cerevisiae W303 (■) e ena1-4∆ (▲) crescidas em YPD 4% até fase exponencial e
expostas a pH 2 + 85 mM de NaCl durante 30 e 60 minutos.
0
0,1
0,2
0 15 30 45 60 75
Ati
vid
ad
e H
+-A
TP
ase
(µm
ol.
Pi.
min
-1.m
g d
e p
rote
ína
)
Tempo (min)
65
4.4 - Potencial de membrana das células submetidas ao estresse ácido
Para verificarmos se a sensibilidade das células de leveduras ao pH ácido resulta
na despolarização da membrana plasmática, decidimos comparar o potencial de
membrana (∆ѱ) das cepas Saccharomyces. Utilizamos a distribuição de Nernstian com
o uso do marcador bis-oxonol trimetina (1,3-ácido dibutilbarbitúrico) (Di-BaC-4(3)). O
potencial de membrana plasmática descrito por Borst-Pauwels, (1981) em S. cerevisiae,
está entre -50mV a -130mV.
Os resultados de potencial de membrana obtidos antes e após a exposição das
cepas em pH 2 e adicionado de 85mM de NaCl, podem ser visualizados na tabela 3.
Observamos que os valores iniciais de potencial de membrana das cepas S. boulardii,
W303 e ena1-4∆ foram de -98,4mV, -48,7mV e -83,7mV, respectivamente. O valor de
potencial de membrana mesmo nas condições iniciais do experimento demonstra um
potencial mais negativo da cepa S. boulardii e de ena1-4∆.
Com a exposição ao pH 2 ocorre uma despolarização da membrana plasmática
em todas as cepas analisadas. Contudo a adição de sódio ao meio ácido retarda a
despolarização. Após 30 minutos observamos uma recuperação de potencial de
membrana de S. boulardii de -76,5 para -90,4mV. Em S. cerevisiae W303 de +24,9 para
-18,5mV e do mutante ena1-4∆ de -69,8 para -88,5mV. Estes resultados corroboram ao
efeito protetor da adição de sódio em estresse ácido, conforme dados de viabilidade
apresentadas anteriormente e, por outro lado, um potencial de membrana plasmática
mais negativo (S. boulardii) deve estar relacionado à maior resistência da cepa
probiótica ao ambiente ácido (pH 2).
66
Tabela 3 – Potencial de membrana das cepas Saccharomyces
As células de leveduras foram crescidas em YPD 4% até fase exponencial e
submetidas até 1 hora em pH 2 na presença ou ausência de 85mM de NaCl. Os dados
representam méDias, R. S. e desvios padrões de três experimentos provenientes de
diferentes culturas de células.
Potencial de membrana (mV)
67
4.5 - Análise de alterações metabólicas que podem esclarecer a maior resistência da cepa S. boulardii frente ao estresse ácido 4.5.1 - Avaliação da homeostase do cálcio em cepas Saccharomyces submetidas ao estresse ácido
O cálcio tem uma função ampla e importante na célula, como controle da
expressão gênica, exocitose, rearranjo do citoesqueleto e fisiologia celular (Iida, H. e
cols., 1990). Como para todo mensageiro secundário, a concentração de cálcio livre no
citoplasma é mantida em níveis muito baixos, variando entre 50 a 100 nM em células de
leveduras ( Halachmi, D. e Eilam, Y., 1989). O aumento da concentração interna de
cálcio pode ocorrer em resposta a diferentes sinais (Sanders, D. e cols., 2002) afetando
diversos processos celulares que incluem a regulação da expressão gênica, progressão
do ciclo celular, processamento e síntese de proteínas, apoptose, o transporte nuclear, a
segregação de cromossomos (Rudolph,H. K. e cols, 1989; Iida, H. e cols., 1990;
Okorokov, A. L. e Lehle, L., 1998; Durr, G. e cols., 1998; Yoshida, T. e cols., 1994;
Corbertt e Michalak, 2000; Carrion e cols., 1999).
Para avaliar o papel do cálcio na resposta ao estresse ácido das cepas
Saccharomyces, analisamos o acúmulo do cálcio e a atividade da Ca+2-ATPase vacuolar
(Pmc1p) nas cepas submetidas ao estresse ácido a 30°C e coletadas ao longo da
exposição. Foi possível observar que a cepa S. cerevisiae W303 acumula o dobro de
cálcio quando comparada a S. boulardii na condição controle, ou seja, cultivadas em
meio rico (YPD 4%) e que ao longo da exposição ao estresse ácido ocorre uma perda
considerável (mais de 50%) deste íon pela cepa W303. No probiótico S. boulardii houve
perda de no máximo 40% de cálcio, indicando a manutenção dos estoques do íon,
podendo contribuir para a sinalização e ativação das vias de resposta ao estresse (Figura
9).
Dos sistemas de transporte de cálcio, as Ca+2-ATPases são de interesse
especial, devido à importância do cálcio como sinalizador celular (Berridge, M. J. ,
1993). Muitas funções celulares são direta ou indiretamente reguladas pela concentração
de cálcio livre, o que faz com que mudanças drásticas na homeostase de cálcio causadas
por condições de estresse, sejam incompatíveis com a vida. Os resultados da atividade
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da bomba Ca+2-ATPase (Pmc1p) (Figura 10) mostram que S. cerevisiae reduz o
seqüestro de cálcio em 75% em relação ao controle nos primeiros 5 minutos de
exposição, após 30 e 60 minutos a cepa S. cerevisiae recupera o seqüestro do cálcio em
cerca de 25%.
Para confirmar o perfil observado com o acúmulo e atividade da bomba
responsável pelo sequestro de cálcio, as mesmas cepas foram avaliadas quanto ao sinal
intracelular de cálcio em estresse ácido, através de um ensaio de aequorina. Os
resultados representados na figura 11, demonstram, como esperado, que a cepa S.
cerevisiae W303 possui maior nível de cálcio citosólico livre que a cepa S. boulardii,
mesmo na condição controle, e que mesmo depois da exposição em pH 2 a cepa
probiótica permanece com níveis de cálcio citosólico livre ainda menores que W303.
69
Figura 9 – Medida de cálcio celular total, em cepas Saccharomyces crescidas em YPD
4% até D.O.600nm 1,0 e submetidas ao pH 2 por 5, 15, 30 e 60 minutos. S. boulardii
(barras azuis)e S. cerevisiae (barras vermelhas). Não há diferença estatisticamente
significativa entre os tempos 5, 15, 30 e 60 minutos das cepas submetidas ao estresse,
avaliadas pelo teste t de Student (P< 0,05).
0
20
40
60
80
100
120
140
Controle 5 15 30 60
mm
ole
s d
e C
a+
2/K
g d
e m
ass
a s
eca
Tempo (min)
70
Figura 10 – Atividade Ca+-ATPásica das cepas Saccharomyces crescidas em YPD 4%
até D.O.600nm 1,0 e submetidas ao pH 2 por 5, 30 e 60 minutos. S. boulardii (barras
azuis) e S. cerevisiae W303 (barras vermelhas) - teste t de Student (P< 0,05).
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Controle 5 30 60
Ati
vid
ad
e C
a+
2-A
TP
ási
ca
(nm
ole
s d
e P
i.m
in-1
.mg
de
pro
teín
a -
1)
Tempo (min)
71
Figura 11 – Sinal de cálcio das cepas Saccharomyces crescidas em YPD 4% até
D.O.600nm 1,0 e submetidas ao pH 2 por 30 e 60 minutos. S. boulardii (barras azuis) e S.
cerevisiae W303 (barras vermelhas).
0
100
200
300
400
500
600
700
Controle pH 2 30 pH 2 60
UR
L
72
4.5.2 - Capacidade tamponante das cepas Saccharomyces após estresse ácido
Adicionalmente com o objetivo de verificar a capacidade maior sobrevivência
demonstrada pela cepa S. boulardii, verificamos a capacidade tamponante de células e
do extrato celular quando expostos ao pH 2.
Podemos observar na figura 12 que as células de S. boulardii possuem maior
capacidade tamponante que S. cerevisiae W303, pois notamos um deslocamento para
esquerda da curva de tamponamento da cepa W303, tanto em condições controle,
quanto após 1 hora de exposição ao estresse ácido.
Como esperado, a capacidade tamponante do conteúdo intracelular é
significativamente maior que da levedura intacta. Os dados apresentados sugerem que a
maior resistência observada ao estresse ácido por S. boulardii pode estar vinculada a sua
maior capacidade tamponante do conjunto de componentes intracelulares desta cepa.
73
Figura 12 – Capacidade tamponante das cepas Saccharomyces crescidas em meio YPD
4% até D.O.600nm 1,0 e submetidas ao estresse ácido. Painel A: Capacidade tamponante
das células S.boulardii (•), S. boulardii exposta a pH 2 (○), S. cerevisiae W303 (■) e S.
cerevisiae W303 exposta a pH 2 (□); Painel B: Capacidade tamponante dos extratos
celulares S.boulardii (•), S. boulardii exposta a pH 2 (○), S. cerevisiae W303 (■) e S.
cerevisiae W303 exposta a pH 2 (□).
B A
74
4.5.3 - Análise qualitativa das alterações na composição lipídica de membrana das cepas Saccharomyces submetidas ao estresse ácido
No presente trabalho adaptou-se a Distância Euclidiana para avaliação das
diferentes porcentagens lipídicas da membrana. Desta maneira, Distâncias Euclidianas
foram calculadas entre os resultados obtidos para cada procedimento de amostragem.
Logo, quanto menor a Distância Euclidiana, menor a alteração lipídica da membrana.
Os resultados da composição lipídica da membrana de S. boulardii e
S. cerevisiae W303 podem ser observados na figura 13. Ao longo da exposição das
cepas ao estresse ácido podemos observar que, existem alterações na composição
lipídica da membrana da cepa W303, distanciando-a da composição lipídica original, ou
melhor, na condição controle.
A variação na composição lipídica da membrana em S. boulardii foram menos
drásticas que na cepa W303 em pH 2 (HCl). Entretanto a adição de sódio, ao estresse
ácido, parece ter diminuído os mecanismos que promoveram estas alterações em W303,
sugerindo que ao detectar que o estresse ácido pode levar a perda de viabilidade, esta
cepa promove modificações lipídicas na membrana na tentativa de adaptação nesta
condição.
Em porcentagem, verificamos que alterações lipídicas na membrana da cepa
W303, exposta a pH 2, foi observada em quase todos os ácidos graxos quantificados,
contudo, as principais modificações foram detectadas quanto ao ácido oléico (18:1) que
aumentou a porcentagem de 29,76 para 33,52%, após 30 minutos de exposição em pH
2, ao ácido araquídico (20:0) de 0,34 a 0,32% e também o ácido gadoléico (20:1w9) de
0,54 a 031%.
75
Figura 13 – Dendograma da análise lipídica da membrana plasmática de S. cerevisiae
W303 e S. boulardii. Células crescidas em YPD 4% até fase exponencial e submetidas
ao estresse em pH 2 e acrescidos de 85mM de NaCl.
Distância Euclidiana
76
4.5.4 - Análise quantitativa das reservas energéticas durante a exposição ao
estresse ácido
Nos resultados apresentados na figura 14A podemos notar que S. boulardii
acumula 7 vezes mais trealose do que S. cerevisiae W303 nas condições controle.
Segundo Thevelein, J.M. (1984), as células de leveduras quando se encontram em fase
de crescimento exponencial em glicose, contém baixas concentrações de trealose. Após
30 minutos de exposição ao estresse ácido S.boulardii consegue mobilizar trealose
ocorrendo perda gradual deste carboidrato. Em se tratando da cepa S. cerevisiae W303,
apesar do conteúdo inicial normal de trealose nestas condições (0,5 a 0,85 mg de
trealose/ 100mg de massa seca, segundo Alcarde e Basso, 1997), durante a exposição ao
pH 2 não observamos mobilização deste açúcar reserva. Segundo Soumalainem e Pfaffli
(1961) a maior viabilidade celular em leveduras, envolvidas no processo de panificação,
eram decorrentes do elevado teor de trealose; deste modo, a função do mesmo seria de
proteção às células contra autólise.
Os teores de glicogênio demonstram uma diferença significativa entre o
conteúdo do mesmo em S. boulardii e em S. cerevisiae W303 (Figura 14B). Durante a
exposição ao estresse ácido a cepa probiótica S. boulardii reduziu em 86% o conteúdo
de glicogênio, com a mesma tendência observamos o mutante ena1-4∆, enquanto
S. cerevisiae W303 parece manter os teores de glicogênio em 30 minutos de exposição
em pH baixo, estes dados podem estar relacionados à perda de viabilidade durante o
estresse em S. cerevisiae W303 e consumo de glicogênio pelo aumento do metabolismo
por S. boulardii.
Deste modo, segundo o consumo de glicogênio durante o estresse ácido por
S. boulardii, avaliado neste experimento, sugere a utilização deste açúcar de reserva
para atividade metabólica em defesa ao estresse submetido.
A concentração de ATP (adenosina 5’-trifosfato) foi determinada utilizando um
ensaio de geração de luminescência envolvendo o complexo luciferina-luciferase, capaz
de formar um produto eletronicamente excitado e emitir luz, e a luz da reação é medida
por fluorescência (Roucou e cols., 1999).
77
As células de leveduras são capazes de gerar ATP para preservar funções
celulares fundamentais, tais como: gradientes iônicos, que atravessam as membranas
celulares, controle na geração de sinalização intracelular, síntese de proteínas e
progressão do ciclo celular.
Os resultados apresentados na figura 14C demonstram que S. boulardii consome
o conteúdo de ATP ao longo do estresse ácido, iniciando com níveis de 1720,5 µg de
ATP por grama de células, tendo redução das taxas de ATP em até 98% após 30
minutos em pH 2. Em S. cerevisiae W303 os níveis de ATP são mantidos em torno de
1033,02 µg de ATP por grama de células, mesmo após 30 minutos de exposição. Os
níveis de ATP observados, ao longo da exposição de cepas Saccharomyces ao estresse
ácido, permite sugerir que a indução da H+-ATPase de S. boulardii (figura 8) está
diretamente relacionada com os níveis intracelulares decrescentes de ATP (figura 14C).
Entretanto, não visualizamos o mesmo perfil na cepa S. cerevisiae W303, no qual nos
permite relacionar a não mobilização dos níveis de ATP à perda de atividade metabólica
em se tratando dos parâmetros analisados neste trabalho.
78
Figura 14 – Conteúdo de trealose (A), glicogênio (B) e ATP (C) em cepas
Saccharomyces crescidas em meio YPD 4% até D.O.600nm 1,0 e submetidas ao estresse
ácido pH 2 (símbolos não preenchidos) e pH 2 + 85 mM de NaCl ( símbolos
preenchidos) durante 30 e 60 minutos. S. boulardii (□, ■), S. cerevisiae W303 (∆, ▲) e
o mutante ena1-4∆(○,•).
A
B
C
79
Discussão
80
5 - Discussão A sobrevivência de microrganismos probióticos é dependente da sua habilidade
de resistir à passagem do trato digestivo. Neste contexto, tolerância ao pH baixo e sais
biliares têm sido utilizados como critérios de seleção de microrganismos com potencial
probiótico (Ouwehand, A.C. e cols., 1999).
O fluido gástrico tem grande importância como primeira defesa contra
patógenos entéricos, e pesquisas simulando este fluido têm sido bem documentadas
(Smith, J. L., 2003; Tamplin, M. I., 2005). O estômago destaca-se por ter um papel
fundamental não só na digestão parcial dos alimentos, mas também na inativação e
morte de agentes patogênicos presentes nos alimentos antes da sua entrada no trato
gastrointestinal (Smith, J. L., 2003).
Estudos preliminares de tolerância a simulação de ambientes gástrico,
pancreático e intestinal, mostraram uma resistência maior de S. boulardii, comparado a
S. cerevisiae W303 (Fietto, J. L. R. e cols., 2004). Neste trabalho, ao avaliarmos a
tolerância de S. boulardii ao ambiente gástrico simulado (solução aquosa contendo
85mM de NaCl, 3g/L de pepsina e pH 2), em comparação com S. cerevisiae W303
(uma linhagem de laboratório) e com outras linhagens S. cerevisiae UFMG 20 e UFMG
24, depois de 1 hora de exposição ao estresse, S. boulardii apresentou maior tolerância
em relação as demais cepas estudadas, representando uma característica primordial a ser
analisada em uma cepa potencialmente probiótica.
Os efeitos dos diferentes componentes do meio gástrico simulado foram
investigados com o objetivo de esclarecer o envolvimento dos mesmos na perda de
viabilidade das células. Nós observamos que a exposição a NaCl e a pepsina,
separadamente, não são capazes de afetar significativamente a viabilidade celular. Por
outro lado, identificamos que o principal componente gástrico responsável pela
diminuição drástica da viabilidade, foi o pH ácido (pH 2), e que a adição de NaCl nesta
condição restabeleceu a resistência observada anteriormente em estresse gástrico
simulado. A resistência a baixo pH demonstrada pela cepa S. boulardii , consiste em um
importante fator para a seleção de microrganismos a serem utilizados como probióticos.
Nossos resultados estão de acordo com outros trabalhos que já comprovaram que a cepa
81
S. boulardii é altamente resistente ao ambiente ácido (Fietto, J. L. R. e cols., 2004; Van
Der AA Kuhle, A. e cols., 2005; Edwards-Ingram, L. e cols., 2007).
Após identificarmos o efeito protetor da adição de NaCl quanto a viabilidade em
pH 2, resolvemos investigar a especificidade do NaCl, nesta condição, com adição de
diferentes íons conjugados do mesmo ânion (cloreto). Os diferentes íons analisados
promoveram efeito protetor tanto em S. boulardii quanto em S. cerevisiae W303.
Observamos que na cepa S.boulardii o efeito protetor do sódio foi mais evidente que os
íons cálcio, potássio e magnésio, entretanto apenas o íon lítio não apresentou uma
proteção proeminente, provavelmente nas concentrações que utilizamos este íon pode
ter apresentado uma toxicidade maior do que o efeito protetor. Em contrapartida na cepa
W303 o efeito protetor foi mais intensa com a adição do íon cálcio em pH 2, e isto, nos
permite sugerir, que seria importante a investigação da homeostase do cálcio, em
relação a cepa W303, nestas condições.
Considerando que o ensaio foi realizado a 37°C (temperatura corporal), e que
dados na literatura demonstram que em S. cerevisiae sob pequenas elevações de
temperatura de incubação pode gerar alterações no perfil de proteínas (Miller e cols.,
1979), nós resolvemos investigar o perfil da síntese protéica neste contexto. A resposta
ao estresse não resulta somente no reparo de possíveis danos, mas também leva à
aquisição de tolerância ao estresse que o gerou e, muitas vezes a outros tipos de
estresses (Lewis, J. G. e cols., 1995).
A cicloheximida foi utilizada no trabalho de Ludovico, P. e cols., (2001), para
determinar o envolvimento de processos de apoptose em células de S. cerevisiae
expostas em ácido acético (pH ∼ 2), no qual demonstraram que a morte induzida por
concentrações mais baixas de ácido acético (20-80 mM) foi parcialmente inibida por
cicloheximida, evidenciando que nestas concentrações foi possível detectar diferentes
alterações típicas de apoptose.
A adição de cicloheximida no ensaio de pH 2 acrescido de sódio resultou em
uma diminuição da resistência apresentada por S. boulardii, sugerindo um papel, ainda
que parcial, de síntese protéica na resposta ao estresse, e descartando, de fato, processos
apoptóticos nestas condições. Diante do fato de que avaliamos viabilidade celular, a
82
utilização de uma droga como a cicloheximida não é ideal para ensaios de resistência,
sugerimos então, que o perfil protéico seja melhor investigado, para permitir identificar
os alvos protéicos envolvidos no fenômeno de resistência/susceptibilidade.
O modo de ação para que se estabeleça o efeito positivo dos íons, deve envolver
a homeostase iônica. Em leveduras, a manutenção da homeostase de Na+ e K+ é
dependente de sistemas transportadores responsáveis pelo influxo e efluxo de sais, tais
como a bomba exportadora de sódio Ena1p (Benito B. e cols., 1997), permutadores de
Na+/H+ Nha1p localizado na membrana plasmática, Nhx1p permutador prevacuolar
(Nass, R. e cols., 1998) e Vnx1p descrito como transportador presente na membrana do
vacúolo responsável pela homeostase de íons Na+ e K+ e regulação do pH vacuolar
(Cagnac, O. e cols., 2007). Além da captação de Na+ e K+ pelos transportadores Trk1p e
Trk2p (Ko, C. H. e Gaber, R.F., 1991) existem outros canais menos específicos como o
Nsc1p, ainda não identificado geneticamente (Bihler, H. e cols., 2002).
Neste trabalho, investigamos a relação da homeostase de sódio com o efeito
protetor do mesmo observado nas células submetidas ao pH 2, utilizando cepas com
deleções em genes que codificam para proteínas envolvidas no sistema de regulação
deste íon. Nossos resultados evidenciam um maior aumento da viabilidade celular do
mutante ena1-4∆ submetido ao estresse ácido na presença do íon sódio, quando
comparado à cepa selvagem. Este fenótipo é semelhante ao fenótipo observado para a
cepa S. boulardii que apresentou maior resistência a pH ácido na presença de NaCl.
Este dado sugere que a baixa extrusão de sódio por Ena1-4p seja um fator importante na
resposta ao estresse ácido. A atividade e aumento de expressão de ENA1-4 têm sido
descrito na literatura em resposta ao estresse alcalino e altas concentrações de sais
(Nelson e Nelson, 1990; Haro e cols.,1991; Marquez e Serrano, R., 1996), visto que os
principais participantes da ativação deste gene compreendem, as vias de sinalização da
calcineuria, Rim101 e Snf1 (Platara e cols., 2006). Não há relatos na literatura do
envolvimento da proteína Ena1-4p em estresse ácido.
De acordo com esses resultados iniciais, determinamos a expressão do gene
ENA1-4 em S. boulardii, que apresentou níveis muito baixos deste transcrito, quando
comparada a cepa S. cerevisiae W303, mesmo nas condições controle dos ensaios S.
83
boulardii possui expressão quase nulas do gene ENA1-4, e após a exposição em pH 2
mais NaCl a transcrição deste gene foi consideravelmente reduzida em ambas as cepas
avaliadas, reforçando a hipótese de uma relação inversa entre expressão/atividade dos
genes ENA e resistência ao estresse ácido na presença de sódio. Os dados de expressão
por RT-PCR explicam também a semelhança do fenótipo observado entre S. boulardii e
o mutante ena1-4∆ sob condições de estresse ácido e adição de baixas concentrações de
sódio, presumindo um envolvimento da diminuição do efluxo de sódio para aumento da
viabilidade.
A participação de ATPases do tipo P em geral foi testada pela adição do
vanadato ao estresse ácido. Este inibidor não afetou de forma significativa a viabilidade
celular do mutante ena1-4∆ submetido ao estresse (acídico + NaCl 85 mM), mas
aumentou significativamente a viabilidade da cepa selvagem, provavelmente pela
inibição de Ena1-4p. Surpreendentemente, o vanadato exerceu um efeito contrário em S.
boulardii. Sugerimos então um possível envolvimento de outras ATPases do tipo P na
resposta, pois como demonstrado a expressão de ENA1 em S. boulardii é muito baixa.
Quando a levedura enfrenta condições de baixo pH as células necessitam do
sistema de efluxo de prótons H+. Geneticamente bem caracterizadas, as H+-ATPases de
S. cerevisiae e de Schizosacharomyces pombe são codificadas pelo gene PMA1
(Serrano, R. e cols., 1986). Sabe-se também que Pma1p gera um gradiente
eletroquímico de prótons capaz de impulsionar transportes secundários, contribuindo
para regulação do pH intracelular e por conseqüência a viabilidade.
Desta forma, o perfil de ativação da H+-ATPase nas cepas S. boulardii e
ena1-4∆ demonstrou uma contribuição positiva na proteção contra o estresse ácido
submetido, em relação a S. cerevisiae W303. Os resultados obtidos sugerem um
envolvimento na regulação negativa por Ena1-4p na ativação da H+-ATPase de
membrana plasmática sob estresse ácido adicionado de sódio.
Após as evidências de que as cepas S. boulardii e o mutante ena1-4∆ são
capazes de responder ao estresse ácido através da ativação da H+-ATPase
diferentemente de S. cerevisiae W303, decidimos verificar o pH interno das cepas
nestas condições.
84
A redução da viabilidade das células de leveduras em pH baixo, mesmo na
presença de 85mM de NaCl, pode estar relacionada ao pH intracelular (Sychrova e
cols., 1999; Kinclova-Zimmermannova, O. e cols., 2006). Nestas condições S.
boulardii, a cepa selvagem W303 e ena1-4∆ não apresentaram diferenças significativas
de pH intracelular após exposição ao pH 2 e NaCl. Estes dados permitem-nos sugerir
que provavelmente em pH ácido não há influxo indiscriminado de prótons em células
submetidas ao estresse, e que apesar dos resultados de ativação da H+-ATPase terem
sido maiores em resposta ao estresse por S. boulardii, não visualizamos nenhuma
correlação entre atividade e variações no pH interno da cepa probiótica e de S.
cerevisiae W303.
No trabalho de Malakar, D. e cols., (2006) observaram um aumento da atividade
H+-ATPásica, depois de 2 horas de exposição de S. cerevisiae, a 10 mM de HCl (pH 2)
e uma subseqüente queda dessa atividade a níveis basais após estas duas horas, e que
apesar da adição de S-adenosil-L-metionina (AdoMet), para proteção em estresse ácido,
ter diminuído a redução do pH interno, o perfil de atividade H+-ATPásica foi o mesmo
observado anteriormente.
Neste contexto, nosso próximo passo foi relacionar a ativação da H+-ATPase
observada na cepa S. boulardii e no mutante ena1-4∆ com o potencial de membrana e a
conseqüente despolarização da membrana sob estresse ácido. A membrana de S.
boulardii e do mutante ena1-4∆ são hiperpolarizadas em comparação a S. cerevisiae
W303 e com a exposição ao pH 2 observamos uma despolarização da membrana
plasmática em todas as cepas analisadas. Entretanto, demonstramos também que a
adição de sódio ao meio ácido retarda consideravelmente esta despolarização sofrida em
conseqüência da exposição ao pH 2.
Estes resultados corroboram com o efeito protetor da adição de sódio em
estresse ácido em relação aos dados de viabilidade apresentadas anteriormente e, por
outro lado, sugerimos que o potencial de membrana plasmática mais negativo
apresentados por S. boulardii deve estar relacionado à maior resistência da cepa
probiótica ao ambiente ácido (pH 2).
85
Observamos que mesmo após 1 hora de exposição em pH 2 a cepa S. boulardii
apresentou viabilidade maior que as outras cepas Saccharomyces avaliadas que não
corresponde ao efeito protetor de íons. Estes dados sugerem mecanismos de resposta ao
estresse ácido em S. boulardii que atuam de maneira independente da proteção de íons e
que não são identificadas nas cepas S. cerevisiae analisadas.
Com o intuito de esclarecer os mecanismos que envolvem esta resposta
observada na cepa S. boulardii em pH 2, inicialmente avaliamos a homeostase do íon
cálcio nestas condições. Os sistemas de transporte que retiram Ca+2 do citoplasma estão
presentes em todas as células sendo responsáveis pela manutenção da concentração de
cálcio citoplasmático em nível fisiológico (Cunningham e Fink, 1994; Clapham, 1995;
Sanders, D. e cols., 1999). Acredita-se que esses mecanismos responsáveis pela
homeostase tornaram-se ideais para subseqüente evolução de vias de sinalização,
baseados na elevação transitória da concentração de cálcio citosólico.
O aumento da concentração interna de cálcio pode ocorrer em resposta a
diferentes sinais (Sanders, D. e cols., 2002) afetando diversos processos celulares que
incluem a regulação da expressão gênica, progressão do ciclo celular, processamento e
síntese de proteínas, apoptose, o transporte nuclear e a segregação de cromossomos
(Rudolph,H. K. e cols, 1989; Iida, H. e cols., 1990; Yoshida, T. e cols., 1994;
Okorokov, A. L. e Lehle, L., 1998; Durr, G. e cols., 1998; Carrion e cols., 1999;
Corbertt e Michalak, 2000).
Os nossos resultados envolvendo a homeostase de cálcio em estresse ácido,
demonstram que a cepa S. cerevisiae W303 apresenta níveis de íons cálcio e atividade
Ca+2-ATPásica consideravelmente mais elevados que S. boulardii, e que após exposição
em estresse ácido a levedura W303 diminui a atividade da Ca+2 –ATPase vacuolar
drasticamente, perdendo cálcio do vacúolo, promovendo assim, elevações absurdas de
cálcio citosólico livre; estes fatos não são observados na cepa S. boulardii, sugerindo
que apesar da exposição ao pH 2, esta não é afetada, quando se tratando de aumento dos
níveis de cálcio citosólico livre.
Sabemos que as proteínas funcionam como ácidos e bases orgânicas
tamponando o citoplasma (Nelson e Lox, 2004). Subseqüentemente determinamos que a
86
cepa S. boulardii tem maior capacidade tamponante que S. cerevisiae W303 sob
estresse ácido, tanto da célula íntegra quanto do extrato celular, representando mais um
fator para demonstrar a maior resistência de S.boulardii frente ao estresse ácido.
Outros parâmetros foram avaliados para esclarecer os efeitos do pH ácido no
metabolismo de S. cerevisiae W303 e S. boulardii. Dentre eles, fizemos uma análise das
alterações na composição lipídica da membrana durante a exposição ao estresse ácido e
também com adição de NaCl.
As características dinâmicas e estruturais da membrana podem mudar pelas
alterações das condições ambientais, ou seja, mudança na composição molecular da
membrana ou pela adição de moléculas estranhas que interagem com os constituintes da
membrana. Isso explica porque mudanças na fluidez da membrana são observadas em
resposta a muitos estresses ambientais, e porque as células mantêm um ótimo nível de
fluidez dentro da matriz lipídica (Beney, L. e Gervais, P. , 2001).
Através da análise qualitativa das alterações lipídicas da membrana podemos
observar que a cepa S. cerevisiae W303 numa tentativa de melhor adaptação a condição
de estresse ácido na qual foi submetida, alterou consideravelmente a composição
lipídica da membrana plasmática, entretanto tais modificações não foram identificadas
na cepa S. boulardii, provavelmente devido ao fato de que esta cepa não apresenta tanta
sensibilidade ao estresse ácido que desencadeie estas alterações. Com a adição de sal,
observamos que a cepa W303 apresenta uma reversão do fenótipo detectado em estresse
ácido, sugerindo que os efeitos deletérios do estresse ácido foram amenizados com
NaCl.
Outro aspecto importante avaliado foi quanto aos níveis de reservas energéticas
das cepas durante a exposição ao estresse ácido. O conteúdo dessas reservas pode
esclarecer os mecanismos de defesa e perfil metabólito dessas cepas durante o estresse
ácido. Originalmente, a trealose, juntamente com o glicogênio era considerada
substância de reserva energética para levedura, porém, recentemente, vários autores
sugerem que a trealose possua função de proteção para a célula de levedura durante
processos de estresse, tais como altas temperaturas, choque osmótico, efeitos tóxicos do
etanol e desidratação, ficando o glicogênio como o principal carboidrato de reserva em
87
leveduras (Majara, M. e cols., 1996; Sano, F. e cols., 1999; Lodato, P. e cols., 1999;
Cerrutti, P. e cols., 2000; François, J. e Parrou, J. L., J. L., 2001; Elbein, A. D. e cols.,
2003).
A capacidade da trealose em proteger estruturas celulares da desestabilização
causada por situações de estresse ou por agentes desnaturantes está bem documentada
na literatura, onde vários estudos mostram proteção in vitro bem como in vivo de
membranas e proteínas. Ratificando que de fato, o acúmulo de trealose tem sido
relacionado com a capacidade de leveduras de tolerar condições ambientais adversas
(Majara, M. e cols., 1996; Sano, F. e cols., 1999; Lodato, P. e cols., 1999; Cerrutti, P. e
cols., 2000; François, J. e Parrou, J. L., J. L., 2001; Elbein, A. D. e cols., 2003). As
propriedades vítreas das soluções de trealose, somadas à habilidade deste açúcar em
formar ligações de hidrogênio com radicais das superfícies de biomoléculas são
características fundamentais que determinam seu efeito protetor pronunciado (Sano, F. e
cols., 1999; Anchordoquy, T. J. e cols., 2001). Por outro lado, em S. cerevisiae a
trealose é um importante carboidrato de reserva e representa cerca de 20 % do peso seco
da célula, dependendo das condições de cultivo e do estágio de vida. Foi também
sugerido que o metabolismo respiratório confere às leveduras maior tolerância ao
estresse, pois durante a respiração mais trealose pode ser sintetizada do que durante o
metabolismo fermentativo (François, J. e Parrou, J. L., J. L., 2001).
Os resultados deste trabalho permitem constatar que a capacidade de S. boulardii
para acumular muito mais trealose do que as cepas S. cerevisiae W303 e o mutante
ena1-4∆, mesmo em fase exponencial de crescimento, podem atribuir maior resistência
da cepa probiótica para enfrentar o estresse ácido avaliado, e que este mecanismo de
defesa é independente da viabilidade atribuída pelo efeito protetor de íons. Lillie e
Pringle (1980) associaram a sobrevivência de células de levedura, por períodos
prolongados de tempo, principalmente ao nível de trealose. Por outro lado os níveis de
glicogênio também seguem o mesmo perfil, nas mesmas condições. Interessantemente,
constatamos uma relação da proteína Ena1-4p com a capacidade de acúmulo deste
açúcar reserva, pois a deleção deste gene inverteu o fenótipo observado para acúmulo de
glicogênio na cepa selvagem W303.
88
Ainda no que diz respeito às análises de reservas energéticas, notamos que
quanto ao dispêndio de ATP, a cepa S. boulardii foi mais eficiente na utilização das
reservas e também na mobilização ao longo da exposição ao estresse, sugerindo que
pelo fato da cepa probiótica possuir maior resistência durante o estresse ácido,
comparativamente as outras cepas S. cerevisiae avaliadas, o perfil observado descreve o
metabolismo normal de S. boulardii ainda que em condições de estresse, em
contrapartida, devido à perda de viabilidade, notamos uma paralisação do metabolismo
durante a exposição pela cepa S. cerevisiae W303.
Estes resultados permitem-nos sugerir que a cepa S. cerevisiae é afetada
drasticamente pelo estresse ácido e que de alguma forma, ainda não esclarecida S.
boulardii possui mecanismos de defesa significativamente mais eficientes que as cepas
Saccharomyces analisadas. Dentre os efeitos de ácido clorídrico em leveduras, no
trabalho de Malakar, D., e cols., (2008) demonstraram que as células de leveduras S.
cerevisiae quando submetidas ao ácido clorídrico pH 2, apresentam características de
apoptose, incluindo condensação da cromatina, exposição da fosfatidilserina do lado
externo da membrana citoplasmática, e fragmentação do DNA. Também fazem parte
dos efeitos desencadeados pelo ácido em S. cerevisiae, o aumento dos níveis
intracelulares de espécies reativas de oxigênio (ROS), com conseqüente elevação do
nível de peroxidação lipídica, e por fim culminando na perda de potencial de membrana
mitocondrial.
Unindo todos os nossos resultados demonstram que a resistência da levedura em
meio ácido é otimizada pela presença em baixas concentrações de íons no meio. Neste
trabalho correlacionamos o efeito protetor de íons em pH ácido e a manutenção do
potencial de membrana plasmática. A verdadeira natureza do processo não foi
completamente elucidada, embora seja plausível que a homeostase iônica provoque um
efeito indireto na sinalização celular, capaz de desencadear respostas específicas quando
em estresse ácido.
Além disso, também evidenciamos as diferenças metabólicas de S. boulardii e S.
cerevisiae W303 que explicam a maior resistência dessa cepa probiótica ao pH ácido,
89
através de características que demonstram menor discrepância nas respostas em estresse
ácido.
90
Conclusões
91
6 - Conclusões
O âmbito deste trabalho incidiu no estudo de alguns aspectos relacionados ao
estresse ácido (pH 2/HCl), em cepas Saccharomyces, e a proteção da adição de sódio
neste contexto. Dentre as conclusões, destacam-se os seguintes aspectos:
� A análise comparativa da resposta das diferentes cepas Saccharomyces
cerevisiae ao ambiente gástrico simulado, sugere que S. boulardii é mais
resistente a este estresse avaliado.
� Com relação ao estresse gástrico, notamos que o pH ácido é o principal
componente envolvido na perda de viabilidade celular.
� A cepa probiótica S. boulardii exibe maior tolerância ao estresse ácido em
relação às outras cepas analisadas.
� Íons, de modo geral, conferem um papel protetor com relação ao estresse ácido
em leveduras.
� A presença de íons sódio, em baixas concentrações, confere proteção a células
de leveduras. Sugerindo o envolvimento direto ou indireto da homeostase deste
íon na resposta ao estresse ácido.
� A cepa S. boulardii possui um mecanismo protetor em pH ácido que independe
do efeito protetor de íons.
� A resposta positiva que envolve homeostase iônica e baixos níveis de expressão
e/ou atividade de Ena1-4p está diretamente correlacionado ao efeito protetor.
92
� O efeito protetor de íons sódio é parcialmente dependente de síntese protéica
(efeito de cicloheximida) e da atividade de ATPases do tipo P (efeito do
vanadato).
� Os sistemas envolvidos na manutenção do potencial de membrana, atividade H+-
ATPase e homeostase de íons, estão relacionados à resposta ao estresse ácido.
� A manutenção do potencial de membrana plasmática estabelecido pela presença
de NaCl é o principal mediador da proteção contra acidez.
� S. boulardii apresenta menores concentrações de cálcio citosólico livre quando
submetida a pH ácido se comparada à cepa S. cerevisiae.
� A cepa S. boulardii apresentou maiores níveis de trealose, possibilitando maior
resistência da mesma em estresse ácido.
� Verificamos alterações na composição lipídica da membrana por S. cerevisiae
W303 quando submetida ao estresse ácido, sugerindo que estas mudanças são
feitas como tentativa de adaptação nesta condição.
� As respostas verificadas quanto à exposição a estresse ácido por S. boulardii
apresentaram-se normais, evidenciando que esta cepa é menos afetada
metabolicamente que S. cerevisiae W303, principalmente tratando-se de
consumo das reservas energéticas.
93
Perspectivas
94
7 - Perspectivas
� Experimentos de micro arranjos de DNA usando sondas preparadas com mRNA
obtido de experimentos controle, de células expostas a pH ácido (pH 2) e pH
ácido + NaCl 85mM facilitariam a identificação de genes alvos envolvidos na
resistência.
� Com relação a resistência ao ácido clorídrico, detectar se durante a exposição
ocorre alterações estruturais típicas de apoptose nomeadamente: i) condensação
extensiva de cromatina na periferia do invólucro nuclear observada por
microscopia eletrônica de transmissão; ii) exposição de fosfatidilserina na
superfície da membrana citoplasmática avaliada por reação com anexina V
conjugada com FITC; e iii) ocorrência de quebras de DNA avaliada por
TUNEL.
� Através de técnicas de citometria de fluxo, analisar a produção de espécie
reativas de oxigênio (ROS) com adição do fluorocromo dihidroetidium (DHE)
durante o estresse ácido, e subseqüente análise do potencial de membrana
mitocondrial nestas mesmas condições.
� Análise da ocorrência de peroxidação lipídica durante a exposição ao estresse
ácido.
� Análise dos componentes da parede celular de S. boulardii e as modificações
ocorridas durante a exposição.
95
Referências Bibliográficas
96
5. Referências Bibliográficas
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