1 Resistencia al frío en dos microalgas verdes del genero Chlorella, aisladas de la Octava Región y del territorio Antártico chileno. Nombre de los estudiantes que integran el equipo de trabajo (máximo 3) Nombre completo: Curso: 1. María Paz Soto Vergara 3ro Medio 2. Daniel Ignacio Figueroa Jerez 3ro Medio 3. Eugenio Nicolás Sanhueza Monsalves 3ro Medio Asesor(a) Nombre: Juana Verónica Torrejón Montenegro RUT: 8.222.544 - 7 Especialidad: Biologia Establecimiento Educacional: Colegio San Agustín Dirección Particular: Tucapel 216, Concepcion Teléfono Particular: Celular: 95980628 E-mail personal: juvetomo@yahoo.com Director del establecimiento educacional que respalda la propuesta Nombre: María Paulina Bellolio Olivieri RUT: 5.568.093-0 Firma: Nombre del establecimiento educacional: Liceo San Agustín de Concepción Dependencia: Part/Subvenc. Dirección: Tucapel 219, Concepción Ciudad/Región: Concepción Teléfono: 41 – 2954549 Fax: 41 – 2954549 E-mail: [email protected]Científico (a) asesor (a) Nombre: Dra. Patricia Gómez Vergara Especialidad: Biotecnología microalgal Institución: Universidad de Concepción. Teléfono: E-mail: Informe si se ha desarrollado parte o toda la investigación en otras instituciones que no haya sido su establecimiento educacional. Toda la investigación se desarrolló en los laboratorios de Cultivo de Microalgas y Sistemática Molecular del Departamento de Botánica, Facultad de Ciencias Naturales y Oceanográficas, Universidad de Concepción.
16
Embed
Resistencia al frío en dos microalgas verdes del genero Chlorella, aisladas de … · 2016-03-04 · de las variaciones estaciónales, las algas verdes deberían recuperarse de estos
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
1
Resistencia al frío en dos microalgas verdes del
genero Chlorella, aisladas de la Octava Región y del
territorio Antártico chileno.
Nombre de los estudiantes que integran el equipo de trabajo (máximo 3)
Informe si se ha desarrollado parte o toda la investigación en otras instituciones que no
haya sido su establecimiento educacional.
Toda la investigación se desarrolló en los laboratorios de Cultivo de Microalgas y
Sistemática Molecular del Departamento de Botánica, Facultad de Ciencias Naturales y
Oceanográficas, Universidad de Concepción.
2
INDICE .
▪ Resumen de la Investigación…………………...…………………………………… 3
▪ Introducción…………………………………………………………………………… 4
▪ Formulación del Problema………………………………………………………….. 6
▪ Materiales y metodología de investigación………………………………………… 7
▪ Resultados Obtenidos……………………………………………………………… 10
▪ Análisis y discusión de resultados………………………………………………… 12
▪ Conclusiones………………………………………………………………………… 13
▪ Bibliografía…………………………………………………………………………… 14
▪ Participación………………………………………………………………………… 15
▪ Agradecimientos…………………………………………………………………… 16
3
RESUMEN DE LA INVESTIGACION .
La Antártica es el continente más frío del mundo. Las exploraciones y descubrimientos en estos territorios se encuentran en estado de desarrollo, motivando su estudio a muchos
científicos.
El calentamiento global afecta en gran medida al continente blanco, ya que el aumento de temperatura de la tierra está derritiendo los hielos, acabando con el hábitat y el
maravilloso paisaje de esta tierra.
Las algas son los productores primarios en el ambiente marino, con un rol muy importante, sustentando a toda la trama alimenticia. Al ser fotosintéticas absorben CO2 del ambiente contribuyendo a disminuir el efecto invernadero producido por la
acumulación de este gas en la atmósfera.
Nuestra hipótesis se basa en que las algas antárticas son mas resistentes al estrés por frio que algas de ambientes más cálidos, contribuyendo así a la disminución de las cantidades de CO2 en la Antártica, y así disminuir los efectos del calentamiento global en este ambiente extremo.
En este trabajo se evaluó la capacidad de dos cepas de microalgas, una aislada de Concepción y la otra del territorio Antártico Chileno, de recuperarse y seguir creciendo luego de ser sometidas a estrés por frío. Las cepas fueron sometidas por 24 h a 3 tratamientos de frío: 4ºC, -20ºC y -80ºC. Luego se evaluó su crecimiento en el tiempo por medidas de la absorbancia del cultivo a 665nm (longitud de onda a la que absorbe la clorofila). Para determinar la densidad celular en células por ml se realizo una curva de calibración contando las células en una cámara Neubauer. Con los datos obtenidos se construyeron curvas de crecimiento para las dos cepas sometidas a los distintos tratamientos de frío y se compararon los resultados. En ambas cepas el crecimiento se vio favorecido luego del tratamiento de 4ºC. Las microalgas crecieron en menor cantidad luego de ser incubadas a -20ºC en comparación a los otros tratamientos, incluso al de -80ºC, tratamiento al que respondieron sorprendentemente bien. Los resultados obtenidos en la experimentación en base al crecimiento de las microalgas fueron en general exponenciales hasta el día 12, donde los mejores resultados se observaron a variaciones de temperaturas de 20 y 4°C. Se comprobó que ambas cepas presentan la misma tendencia de crecimiento pero que la cepa antártica tiene un crecimiento más lento que la cepa de Concepción. Se concluye que las algas verdes responden positivamente al estrés de temperatura, lo que permite su sobrevivencia en temperaturas extremas y así estarían contribuyendo en
forma muy importante a la disminución de los efectos del calentamiento global.
Investigadores Chilenos camino a Patrio Hills. Foto: Inach 16 de mayo 2011
4
INTRODUCCION .
La antártica es una masa continental que ocupa el polo sur de nuestro planeta, es el
continente más frío y ventoso, y está cubierto por una espesa capa de hielo. Este territorio
se encuentra a 66.5° de latitud Sur, con unos catorce millones de kilómetros de tierra
aproximadamente. Su temperatura media es cercana a los -17°C. Cerca del 90% del agua
dulce del planeta se encuentra en este continente, lo que la convierte en la mayor reserva
hídrica del mundo.
El continente antártico es un lugar único, donde la ciencia ocupa un espacio privilegiado,
asemejándose a un inmenso laboratorio científico.
Hoy en día, el principal problema que afecta a nuestro planeta es el calentamiento global,
provocado por el aumento de CO2, causante de los cambios de temperatura y
acidificación de las aguas, situación que se ve reflejada mayoritariamente en el continente
blanco. Según un estudio de la revista “Science”, este fenómeno natural ha sido
probablemente el principal causante del aumento de las precipitaciones y disminución de
la masa de hielos al interior de la antártica. En los últimos cincuenta años la temperatura
atmosférica de la península aumento más de 2,5°C. Los investigadores encontraron que
entre abril de 2002 y agosto de 2005, la placa de hielo antártica decreció anualmente 152
kilómetros cúbicos de hielo. Si este llegara a derretirse en su mayoría, el nivel del mar
subiría en todo el mundo unos 55 metros.
“El aumento del deshielo podría tener un impacto a mayor escala si es grave y se
mantiene en el tiempo”. (Steffen. K, 2007)
La temperatura normal de la Antártica ha ascendido en los últimos años por acción del
fenómeno actual, dejando los -17°C.
El continente antártico presenta una escasa vegetación de musgos, algas y líquenes.
Dentro de la escasa diversidad de algas, se encuentran las clorófitas, algas verdes que
presentan células con un núcleo bien definido, pared celular y se caracteriza por
presencia de clorofila a y b, y la acumulación de almidón en el interior del cloroplasto.
Existen en la Tierra hace más de 540 millones de años, siendo uno de los organismos
más primitivos, sorpresivamente se han conservado de forma casi inalterada hasta
nuestros días, gracias a su extraordinaria capacidad de supervivencia. La mayor parte de
las algas habitan en agua dulce, suelos húmedos o epifitas. Las clorofilas son
cosmopolitas, es decir, presentan una amplia distribución por todo el mundo, variando en
sus ambientes. Las algas verdes son organismos fotosintéticos, es decir, realizan el
proceso de captación de dióxido de carbono ambiental y lo transforman en oxígeno.
Esta flora puede verse afectada por el calentamiento global de manera positiva o
negativa, ya que cada especie reacciona de distinta manera a los cambios de temperatura
en el ambiente.
Por medio de fotosíntesis, estas algas al captar el CO2 que existe en la atmósfera de
manera excesiva, lo disminuirían, y por consiguiente aportarían a minimizar la
5
temperatura existente que está aumentando por acción del fenómeno anteriormente
nombrado.
Dentro de los ambientes acuáticos, el fitoplancton aporta de la misma forma a mitigar el
efecto de calentamiento global que los organismos vegetales terrestres, los organismos
vegetales marinos cumplen una tremenda función, produciendo la mitad del oxígeno que
se respira, absorbiendo el dióxido de carbono y manteniendo a los peces del océano.
La importancia del fitoplancton en los océanos reside también en su labor como primer
eslabón de la red trófica o alimentaria marina. “Sería el equivalente a la vegetación
terrestre, ya que transforma elementos inorgánicos en energía y materia orgánica para
que el resto pueda alimentarse”. (Huertas. E, 2011)
Al conocer estas características del continente blanco y saber cómo le está afectando el
calentamiento global, nos lleva a pensar en cómo poder aportar a que este maravilloso
espacio para la ciencia continúe por un largo tiempo y nos deslumbre con sus hallazgos.
Un medio para conseguir esto son las algas verdes, mediante su estudio y
experimentación podemos obtener los datos necesarios para responder a los problemas
que le afectan. Como el calentamiento global causa una variación de temperatura aparte
de las variaciones estaciónales, las algas verdes deberían recuperarse de estos cambios
y si es así, a temperatura alta responder de manera adecuada.
En este trabajo de experimentación se presenta una posible respuesta a nuestra
pregunta, mediante el trabajo en laboratorio con algas verdes, análisis e interpretación de
datos de cada muestra de algas y conclusiones que nos llevarán a lograrlo.
Para esto, a las microalgas las someteremos a distintos grados de estrés, provocados
por la variación de temperatura, y observaremos como se recupera en cada situación.
Todo esto con el objetivo de simular los cambios de temperatura en la antártica, tanto los
estacionales como los provocados por el calentamiento global, y ver cómo afecta en el
crecimiento de las algas verdes, y así comprobar si disminuiría o aumentaría su ayuda a
contrarrestar este cambio climático.
6
FORMULACION DEL PROBLEMA .
Pregunta:¿Podrán las algas verdes antárticas resistir a una variación de temperatura y
luego seguir con un crecimiento eficiente?
Hipótesis: Las algas verdes antárticas responderán mejor que las algas de ambientes más
cálidos al estrés por frio, por lo que estarían adaptadas para contribuir a disminuir el CO2
atmosférico y por ende el calentamiento global en la Antártica.
Objetivos:
▪ Motivar al estudio de las microalgas y su rol en el calentamiento global ya que no se les
ha dado el grado de importancia en su aporte a contrarrestar este fenómeno.
▪ Establecer una comparación de la resistencia al frío entre una microalga verde antártica
y una aislada de la Octava Región.
7
MATERIALES Y METODOLOGIA DE INVESTIGACION .
Tratamiento a algas verdes locales y antárticas: Se somete a las algas verdes a ciertos
grados de estrés provocados por la variación de temperatura en 24 horas y luego se deja
en una sala de cultivo para comprobar su viabilidad días después.
1.- Área de estudio: Ficología.
2.-Materiales:
Cepa antártica (Aff.Chlorella), Cepa local (Aislada de la Laguna
Grande de San Pedro, Octava Región), Espectrofotómetro con
Cubetas de cuarzo, Maquinas refrigerantes (refrigerador, freezer y
congelador), Tubos Eppendorf, Tubos de ensayo, Pipeta con rodillo,
Pipetas plásticas, Micropipetas de 500-1000μL con los tips
correspondientes, Timer, Medio de cultivo Bristol, Matraz, Gradilla, Microscopio binocular,
Cámara de Neubauer.
3.- Metodología
3.1.-Preparacion de la Muestra:
Jueves 15 de Septiembre de 2011
La preparación de las muestras consiste en igualar la densidad celular en ambas cepas
para que comiencen con la misma cantidad de células por mL. Para lograr esto, debimos
tomar la absorbancia a 750 nm (Turbidez) y a 665 nm (Clorofila) de ambas cepas en el
espectrofotómetro, ya que la absorbancia es directamente proporcional con la densidad
celular:
Primero, debemos tomar 4 mL de medio de cultivo Bristol, con una pipeta, y vertirlo en la
Cubeta de cuarzo, especial para el espectrofotómetro, luego se debe ubicar esta cubeta
en la primera celda de la máquina.
Segundo, extraer 4 mL de cultivo del alga antártica con una pipeta de plástico, y vaciarlo
en una segunda cubeta de cuarzo, poner esto en la celda dos del espectrofotómetro.
Medir absorbancia a 750 nm y 665 nm.
Tercero, retirar la cubeta con muestra de la máquina, y vaciarla en el frasco de desechos
líquidos. Lavar el recipiente con agua para eliminar los residuos de la cepa.
Cuarto, extraer 4mL de cultivo del alga local, con una pipeta de plástico diferente a la
primera, y echarlo en la cubeta de cuarzo lavada. Poner esto en la segunda celda de la
máquina. Medir Absorbancia a 750nm y 665 nm
Resultados:
Para igualar las absorbancias debemos diluir cierta cantidad de cepa local en un
determinado volumen de Bristol. Queremos obtener 20 mL de solución “Cepa Local +
Bristol” con una turbidez de 0.020 nm. Utilizamos una proporción Inversa como la
siguiente:
750 nm 665 nm
Cepa antártica: 0,020 0,021
Cepa Local: 0,800 0,856
8
“20 mL x 0,020 = V x 0,8” Siendo “V” la cantidad de mL de cepa local.
Despejamos “V” y nos da como resultado que es 0,5 mL de cepa local. Por lo tanto
debemos agregar 19,5 mL de medio Bristol para completar los 20 mL de solución.
Finalmente a un matraz esterilizado agregamos, con una pipeta, 19,5 mL de Bristol y,
con otra pipeta, agregamos 0,5 mL de cepa local. Así nuestras dos cepas poseen la
misma absorbancia, por lo tanto, la misma densidad celular.
3.2.- Procedimiento del experimento
Jueves 15 de Septiembre de 2011
En primer lugar, con una micropipeta extraemos 1,5 mL de cepa local para cada tubo
Eppendorf rotulado con números del 1 al 4, luego cambiamos la punta del instrumento y
repetimos el mismo procedimiento con la cepa antártica, con otros 4 tubos Eppendorf
rotulados del 5 al 8. Pondremos a diferentes temperaturas cada tubo, por 24 horas, como
se indica a continuación:
Tubo eppendorf 1: Cepa Local a 20ºC en laboratorio con temperatura
controlada
Tubo eppendorf 2: Cepa Local a 4ºC en la parte baja de un refrigerador
Tubo eppendorf 3: Cepa local a -20ºC en el freezer de un refrigerador
Tubo eppendorf 4: Cepa local a -80ºC en un congelador (deep freezer)
Tubo eppendorf 5: Cepa Antártica a 20ºC en laboratorio con temperatura controlada
Tubo eppendorf 6: Cepa Antártica a 4ºC en la parte baja de un refrigerador
Tubo eppendorf 7: Cepa Antártica a -20ºC en el freezer de un refrigerador
Tubo eppendorf 4: Cepa local a -80ºC en un congelador (deep freezer)
Viernes 16 de Septiembre de 2011
24 horas después sacamos nuestras muestras de sus respectivos lugares y esperamos a
que se descongelen por 20 min aprox. Mientras tanto, con una pipeta, vertimos 3 mL de
medio Bristol en los 8 tubos de ensayo, cada uno rotulado para cada muestra. Una vez
descongeladas las muestras, las homogenizamos agitándolas suavemente, tomamos 1
mL con una micropipeta y lo ponemos en los tubos de ensayo, cambiando la punta del
instrumento por cada cepa. Estos 4 mL (cepa + medio de
cultivo), se llevan a una sala de cultivo, con temperatura 18ºC ±
1ºC e intensidad luminosa de 17 μmol / m2•seg, para iniciar con
su crecimiento.
Jueves 22 de Septiembre de 2011.
Para saber la cantidad de células por mL, podemos crear una
relación entre la absorbancia a 665 nm y la densidad celular, ya
que son directamente proporcionales. Para ello debemos crear
una curva de calibración, que servirá para extrapolar los datos
MUESTRAS
9
que obtendremos, tanto como de la cepa antártica como local porque son más o menos
del mismo tamaño.
La forma en que creamos la curva fue:
Primero debemos hacer una disolución seriada de la cepa local, colocando 3 mL de
Bristol en un tubo de ensayo rotulado con la letra A y agregando 2 mL de cepa local. Lo
homogenizamos y luego extraemos 2 mL de solución del tubo A y lo vaciamos en un tubo
de ensayo rotulado con la letra B. Se repiten los pasos con los tubos C y D.
Teniendo los 4 tubos de ensayos A, B, C y D listos, procedemos a contar el número de
celular en el microscopio óptico binocular a magnificación
40X con ayuda de una cámara de Neubauer. En esta
cámara podemos contar el número de celular en un
volumen de 0.004mm3, ya que de largo y ancho tiene 0.2
mm y alto 0.1 mm por celda. Los resultados son 121; 35;
30 y 20 de los tubos A; B; C y D respectivamente.
Una vez contadas las 4 muestras, calcularemos el número
de células en 1 mL con una proporción directa. Por ejemplo si en 0,004 mm 3 hay 20
células, en 1000 mm3 habría 5x106 células. Así calculamos las restantes. Luego las
llevaremos al espectrofotómetro y mediremos su absorbancia a 665 nm. Hasta el
momento los datos que tenemos son los siguientes:
Tendiendo estos datos, crearemos un gráfico con la absorbancia a 665nm en el eje de las
abscisas y el número de células en el eje de las ordenadas. A los puntos que se crean, le
crearemos la ecuación de la recta (línea de tendencia) que los delimita, pasando a ser
esta la curva de calibración. Esta ecuación es y=30.000.000x + 3.000.000. Por lo tanto,
sabiendo la absorbancia de nuestra muestra, podemos ingresarla a la ecuación y saber
cuántas células por mL hay en el cultivo.
Después de 6 días de crecimiento, se realiza la primera medición de absorbancia a 665
nm de todas las muestras. Devolver las muestras a sus respectivos tubos y volver a
ponerlos en la sala de cultivo.
También se repite el paso anterior a los 10 y 12 días de crecimiento.
Los datos obtenidos de las mediciones se ingresan a la formula hecha a partir de la curva
de calibración y se extrapolan en un gráfico que tiene el número de días en el eje de las
abscisas y el número de células por ml en el eje de las ordenadas.
A partir de lo anterior, tenemos el número de células por mL de cada día, tratamiento de
temperatura y cepa para crear gráficos comparativos entre estas.
A665 Cels/ml A 0.988 30500000 B 0.384 8750000 C 0.116 7500000 D 0,025 5000000
10
Grafico 1: Curva de Crecimiento cepa Local
Según el grafico 1:
▪ Ninguno de los cuatro tratamientos mata en su totalidad a los cultivos.
▪ Posterior al tratamiento térmico, el crecimiento de las algas verdes locales fue
exponencial (en el tratamiento de 20, 4 y -80ºC), a diferencia del tratamiento a -20ºC que
comienza a disminuir su velocidad de crecimiento entre el día diez y doce de cultivo.
▪ La temperatura de tratamiento no es directamente proporcional con el número de
células, ya que el tratamiento de -80ºC obtuvo un mayor número de células en todas las
mediciones que el tratamiento de -20ºC.
▪ Al tratamiento de 4ºC obtuvo la mayor densidad celular en menor tiempo, que fue de
41400000 cels/mL.
0 6 10 12
Local 20ºC 907500 cels/mL 8460000 cels/mL 22200000 cels/mL 37020000 cels/mL
Local 4ºC 907500 cels/mL 8940000 cels/mL 25620000 cels/mL 41400000 cels/mL
Local -20ºC 907500 cels/mL 4500000 cels/mL 12870000 cels/mL 18120000 cels/mL