RESISTENCIA A LA INSULINA LÍPIDOS E INFLAMACIÓNturing.iimas.unam.mx/...insulina_obesidad.pdf · DIABETES MELLITUS TIPO 2 DEFECTOS EN SECRECIÓN DE INSULINA RESISTENCIA A LA INSULINA

RESISTENCIA A LA INSULINA LÍPIDOS E INFLAMACIÓN

Adriana Monroy

Diabetes Division, Department of Medicine

University of Texas Health Science Center at San AntonioSan Antonio, Tx

INCIDENCIA MUNDIAL DE DIABETES

Zimmet P et al. Nature 2001;414:782­7

DIABETES MELLITUS TIPO 2

DEFECTOS EN SECRECIÓN DE INSULINA RESISTENCIA A LA INSULINA

Fajans et al. N Engl J Med 2001;345:971­9 Saltiel AR & Kahn CR. Nature 2001;414:799­806

HIPERINSULINEMIA Y RESISTENCIA A LA INSULINA PRECEDEN A LA DMT2

DeFronzo RAMed Clin N Am 2004;88:787­835

PÁNCREAS

ADIPOCITOS

MÚSCULO

HÍGADO

RESISTENCIA A LA INSULINA

CAPTACIÓN DE GLUCOSA

PRODUCCIÓN DE GLUCOSA

LIPÓLISIS

INSULINA

Kahn SE et al. Nature 2006;444:840­6

   G.  Taubes. Science 2009;325:256 ­260

MECANISMOS DE RESISTENCIA A LA INSULINA

PROCESAMIENTO PROTEOLÍTICO DE TNFα

Moss, L.M, Sklair­Tavron, L. & Nudelman R. Nat Clin Pract Rheum 2008:4:300–309

¿ES LA ACCIÓN Y REGULACIÓN DE TACE IMPORTANTE EN EL

DESARROLLO DE OBESIDAD Y DIABETES?

CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS

DELGADOS

DMT2 pOBESOS

N (M/F)

14 (7/7)

14 (7/7)

14 (7/7)

37 ± 3

42 ± 3

Edad (años)

39 ± 2

HbA1c (%)

5.1 ± 0.1 8.4 ± 0.3 ‡ 

‡<0.0015.2 ± 0.1

LDL (mg/dl)

114 ± 8

112 ± 7107 ± 8

IMC (kg/m2)

22.3 ± 0.5

31.9 ± 0.8*

30.1 ± 0.7*

*<0.001

HDL (mg/dl)

52 ± 3 36 ± 2*

43 ± 3

*<0.001

Triglicéridos (mg/dl)

92 ± 27 228 ± 34‡100 ± 13 ‡<0.05

M (mg/kg.min)

11.6 ± 0.9

3.4 ± 0.4*†

7.4 ± 0.5*

*†<0.001

Glucosa (mg/dl)

84 ± 2 162 ± 13*

94 ± 3*

*<0.001

Insulina (µU/ml)

3 ± 1 17± 2*7 ± 1* *<0.001

Ac. grasos (mg/dl)

13 ± 5 20 ± 7‡16 ± 5 ‡<0.05

   “M”= Indice de infusion de glucosa = Glucosa Metabolizada

“M”

0

120

100

80

60

40

20

8

6

4

2

0-60 -40 -20 0 40 80 120 240200160

TIEMPO (minutos)

INFU

SIÓ

N D

E G

LU

CO

SA

“M

” (

mg

/kg

min

)

GLU

CO

SA

PLA

SM

ÁTIC

A (

mg

/dl)

INS

ULI N

A P

LA

SM

ÁTIC

A (

mU

/ml)

CLAMP EUGLICÉMICO HIPERINSULINÉMICO

DISTRIBUCIÓN DE TACE, RECEPTOR A INSULINA Y TIMP3 EN MÚSCULO

ESQUELÉTICO HUMANO

merge

2X magnification of insert

TACEReceptor insulina TIMP3

20 micron

10 micron

   0

20

40

60

80

100

120

TIM

P3 (%

)

Lean Obese T2DM

*

p=0.002

0

1

2

3

4

TA

CE

RN

A

(Exp

resi

on r

ela

tiva

)

Delgados Obesos DMT2

*p=0.009 vs Delgados

*

EXPRESIÓN DE TACE/TIMP3 EN MÚSCULO ESQUELÉTICO HUMANO

0

50

100

150

200

Delgados Obesos DMT2

TA

CE

(%

)

   0 50 100 150 200

0

5000

10000

15000

20000

25000DELGADOSOBESOSDMT2

Tiempo (min)

ACTIVIDAD DE TACE EN LISADOS DE MÚSCULO

0

500

1000

1500

2000

2500

3000 *p<0.05

Delgados Obesos DMT2

*

0

50

100

150

200

250

Exp

resi

�n d

e P

ro-T

NFa (%

)

Delgados Obesos DMT2

*

*

*p<0.01

0

20

40

60

80

100

120

140

Exp

resi

�n d

e T

NF

α (%

)

Delgados Obesos DMT2

*

*p<0.01

EXPRESIÓN DE TNFα EN MÚSCULO Y SUERO

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0 p<0.05

Delgados Obesos DMT2

*

hum

an T

NF

α (p

g/m

l)

NIVELES EN SUERO DE LOS RECEPTORES DE IL-6 Y TNFα

0

10000

20000

30000

40000

50000 *p=0.003 vs Delgados

hum

an IL

-6 s

R (p

g/m

l)

Delgados Obesos DMT2

*

0

500

1000

1500

2000 *p=0.04 vs Delgados

Delgados Obesos DMT2

*

hum

an s

TN

F R

II (pg/m

l)

0

100

200

300

400

Delgados Obesos DMT2

hum

an s

VC

AM

-1 (ng/m

l)

0

100

200

300

400

Delgados Obesos DMT2

hum

an s

ICA

M-1

(ng

/ml)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400 *p=0.007 vs Delgados *

Delgados Obesos DMT2

hum

an s

TN

F R

1 (pg/m

l)

CORRELACIÓN ENTRE FACTORES SOLUBLES Y PARÁMETROS METABÓLICOS

M (mg/kg.min)

HbA1C (%)

r p

sTNFR1

-0.519

0.680

0.003 <0.0001

sTNFRII

-0.262 0.3540.16 0.047

sIL-6R

-0.441

0.3760.015

0.034

sVCAM

-0.271 0.2200.15 0.23

sICAM

-0.215 0.0580.25 0.75

r p

TNFα

-0.451

0.672

0.014 <0.0001

Ac. grasos -0.384

0.331

0.017 0.04

IMC (kg/m2)

r p

0.502 0.001

0.204 0.22

0.341 0.04

0.127 0.45

0.235 0.16

0.467 0.009

0.117 0.479

M (m

g/k

g. m

in)

0

2

4

6

8

10

12

*

*p<0.001

SALINO L�PIDOS

SENSIBILIDAD A LA INSULINA Y NIVELES DE TNFα DESPUÉS DE INFUSIÓN DE LÍPIDOS

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

hum

an T

NF

α (p

g/m

l)

LIPIDOSSALINO

**p<0.015

EXPRESIÓN DE TACE/TIMP3 DESPUÉS DE INFUSIÓN DE LÍPIDOS

0

1

2

3

4

5

6

TA

CE

RN

A

(Exp

resi

�n r

ela

tiva

)

SALINO L�PIDOS

*

*p<0.05

BASAL

INFUSI�N

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

TIM

P3 R

NA

(E

xpre

si�n r

ela

tiva

)

SALINO L�PIDOS

*

*p<0.01

BASAL

INFUSI�N

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

IRS

1 R

NA

(E

xpre

si�n r

ela

tiva

)

SALINO L�PIDOS

*

*p<0.001

BASAL

INFUSI�N

EXPRESIÓN DE IRS1 Y AKT1 DESPUÉS DE INFUSIÓN DE LÍPIDOS

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

AK

T1 R

NA

(E

xpre

sion r

ela

tiva

)

SALINO LIPIDOS

INFUSION

BASAL

*

*p<0.01

NIVELES DEL RECEPTOR DE INTERLEUCINA 6 SOLUBLE DURANTE LA INFUSIÓN DE

LÍPIDOS

hum

an IL

-6 s

R (pg/m

l)

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

Basal 2h lipid 4h lipid 6 h lipid 2h insulin clamp

*

*p< 0.02 vs Basal

**

*

TACE

TN

Fα

TN

FRT

NF

α

TACE TIMP3

TN

Fα

Ac. grasos

IRS P

Insulin

   Schenk S et al. J Clin Invest  2008;118:2992­3002

OXIDACIÓN DE AC. GRASOS, DISFUNCIÓN MITOCONDRIAL Y RESISTENCIA A LA INSULINA

¿ES POSIBLE IDENTIFICAR MARCADORES PROTEÍCOS DE

DISFUNCIÓN MITOCONDRIAL EN OBESIDAD Y DIABETES?

2.7 ± 1.3 Duración Diabetes

Insulina (pg/ ml) 9.7 ± 1.9

CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS

NGT T2DM

M/F 4/4 4/4

IMC (kg/m2)

36± 5 50 ± 3Edad (años)

25.6 ± 1.7

35.6 ± 1.9

HbA1c (%) 5.1 ± 0.1 9.0 ± 0.7

M (mg/kg.min) 9.8 ± 1.1 2.9± 0.5

5.16± 1.5

HOMOGENADO TOTAL

Centrifugar 700xg 10 min 4ºC

Sobrenadante

Botón(Nucleo, Membranas y deshechos celulares)

Resuspender en sol. Sacarosa IColocar sobre sol. sacarosa II

30,000xg 45 min. 4ºC

Botón

NúcleoInterfase

Membrana Plasmática

Sobrenadante Fracción post­mitocondrial

(citoplasma, ER, lisosomas)100,000xg 1h 4ºC

Botón (Núcleo, Membranas y  deshechos celulares)Re­Homogenizar en un homogenizador de Dounce (II)   

Centrifugar 700xg 10 min. 4ºC

Botón10,000xg 30 min. 4ºC

BotónResuspender en sol. homogenización

Colocar en gradiente de Sacarosa  1.0m/1.5M

80,000xg 1 h 4ºC

Recuperar interfaseLavar con sol. homogenización

Mitocondria 

Sobranadante 

CitoplasmaBotón

10,000xg 10 min. 4ºC

Membranas Intracelulares

FRACCIONAMIENTO CELULAR DE MUESTRAS DE MÚSCULO HUMANO

Membrana Plasmática Núcleo

Mitocondria Membranas Intracelulares

Homogenado Total Citoplasma

FRACCIONES CELULARES DE MÚSCULO HUMANO

3 10

IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS MITOCONDRIALES DE MÚSCULO HUMANO EN GELES 2D

COX5A

LEG1

ACTB

UQCR1

ATPA

KCRS

FUMH

ACADM

HCDH

MYG

COX5B

CX6B1

SODM

ATPO

HBB

HBA UCR6

N5BM

NDUS4

NUPM

CRYAB

PEPB

ACON

ABCD1ACAD

S

IMMT

ALBU

ALBU

ABCD1

ETFD

NDUS1

GRP75 ODP2

ABCD1

SCOT

AL4A1

DLDH

ABCD1

ECH1 ECH1

ACADS

VDAC1

CAH3

UCRIHUHM

D3D2

HUHM

ATP5H

HSPB1

NUGM

ECHM

HUHMMLE1

MLE1

NUIM

ATP5H

ABCD1

MLRVABCD1

MLRV

ABCD1

ABCD1

ATPD

MLE1

ABCD1

MLRV

TPM2

TPM2ODP2 VDAC

2

ES1

ABCD1

PRDX3 VDAC1

TRIS

NUBM

TRIS

ODO2

ATP5I

DHE3ALDH2

ADT1

3HIDH ETFA

THIL

VDAC1

ATPA

ODPX

KPYM

VADC2

CASQ1

NUBMATPA

ATPA

KCRM

UQCR2

ALDOA

IDHP

MDHM

CHCH3

NIDM

KAD3

EFTUECHB

MYH2

UQCR1

ECHBCAH1

HCDH

NUFM

ODPX

ES1 HCD2

NUYM

NGT DMT2

IMMT IMMT

CX6B1

CX6B1

ODPX ODPX

KAD3 KAD3

EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE PROTEÍNAS MITOCONDRIALES EN

DMT2

NGT T2DM p

Mitofilina 3.5±0.9 2±0.4 <0.01

Piruvato deshidrogenasa proteina X

7±1.8 4±1 <0.05

Citocromo C oxidasa subunidad VIb

1.6±0.4 1±0.2 <0.05

Adenilato cinasa 3 5.9±1.6 8.9±2.5 <0.01

EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE PROTEÍNAS MITOCONDRIALES EN

DMT2

4/0

45± 11

26.7 ± 1.8

5.7 ± 0.05

8.2 ± 1.7

5.57 ± 0.95

Insulina (pg/ ml)

CARACTERISTICAS CLÍNICAS

M/F

IMC (kg/m2)

Edad (años)

HbA1c (%)

M (mg/kg.min)

CF 240’ CF 240’

Proteínas fosforiladas(Pro-Q Diamond)

Proteínas totales(Sypro Ruby)

RESULTADOS

FOSFORILACIÓN/DEFOSFORILACIÓN ESTIMULADA POR INSULINA

Basal

b

a

Q1-CF

240’ Insulina a

b

cd

Q1-CF

cd

Basal

240’ Insulina

Tropomiosina cadena β

Tropomiosina cadena α

Regulador Miosina cadena ligera

TIMHspβ1

Aldosa reductasa

Creatina cinasa tipo M 

Fructosa bifosfato aldolasa A

GAPDH

Mioglobina

Cofilina

FOSFORILACIÓN ESTIMULADA POR INSULINA

FUTUROS PROYECTOS

• Modificación del estado de fosforilación de proteínas mitocondriales en células β estimuladas con insulina