Marquage fluorescent de protéines Représentation tridimentionnell e de DnaK Représentation tridimentionne lle de DnaJ 1 A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck Représentation tridimentionnell e Insuline
Marquage fluorescent de protéines
Représentation tridimentionnelle de
DnaK
Représentation tridimentionnelle de
DnaJ
1A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck
Représentation tridimentionnelle
Insuline
A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck
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Etude de la fonctionnalité de Dnak après marquage
• Choix du fluorophore
• Marquage
• Vérification de la fonctionnalité
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Le choix du fluorophore• Contraintes selon les groupements présents
chez les chaperones
– Groupement amine (lysine)– Groupement sulfhydryle (cystéine)
A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck
Groupement amine
Groupement sulfhydryle
A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck
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• Contraintes selon la structure tridimensionnelle de DnaK
Site de liaison de l’ATP
Emplacement de la Cystéine 15
A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck
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Emplacement des Lysines
• Contraintes selon la structure tridimensionnelle de DnaK
A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck
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Le choix du fluorophore
Avantages -1 fluorophore pour 1 protéine- Endroit précis de fixation
-Plusieurs sites de fixation -> marquage sûr
Inconvénients - Diminution de la probabilité de fixation- Proche site de fixation de l’ATP -> DnaK toujours fonctionnelle ?
-Fixation au hasard sur les sites -> Inhibition de la protéine ?- Trop de fluorescence -> Inhibition de la fluo
Cys Lys
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Marquage fluorescent de protéines
• Protéine dénaturée : Insuline
• Chaperones : DnaK et DnaJ
• Fluorophore : ALEXA FLUOR 488 (λexcitation = 480 nm ; λémission = 540 nm)
• But : - Lier covalement un fluorophore à la chaperone. - Vérification de la fonctionnalité de Dnak après marquage - Déterminer les sites de liaison de la Dnak à l’insuline gràce à la
fluorescence( microscopie optique).
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Marquage de Dnak
- Préparation de DnaK (tampon)
- Fixation du dye avec DnaK
- Vérification du marquage
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Dnak50 L
28,6*10-6 mol/L
Dye11,6 L
3,11*10-5 mol/L
Attente d’une heure et demi
Tampon TRIS10,0 L
50*10-3 mol/L
Préparation de Dnak & fixation du dye
Vérification du marquage par absorbance
• d’absorbance de la protéine : 280 nm• d’absorbance du dye : 490 nm
- tampon- dye + tampon- dye + Dnak + tampn
CDnak = 23*10-6 mol/L (20,0*10-6 mol/L initial)Cdye = 1,1*10-6 mol/L (5,0*10-6 mol/L initial)
A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck
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Vérification du marquage
A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck
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Vérification du marquage
A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck
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Vérification de la fonctionnalité de DnaK après marquage
• Particularité de l’insuline : formation de fibres amyloides
• Fonction de DnaK : réguler la formation des fibres
AgrégatDnaK
Insuline en solution Agrégat Fibre amyloïde
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Vérification de la fonctionnalité de DnaK après marquage
• Détection de la formation des fibres amyloides: deux méthodes
• Mesure de l’absorbance à 600 nanomètresReflete la turbidité de la solution
• Utilisation d’un fluorophore: la thioflavine TDeux longueurs d’onde d’excitation différentes suivant sa position
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Vérification de la fonctionnalité de DnaK après marquage
Expériences :
- plaque 96 puits - insuline- insuline + colorant- insuline + DnaK non marquée- insuline + DnaK non marquée + DnaJ- insuline + DnaK marquée (1:4)- insuline + DnaK marquée (1:3)
- mesure de l’absorbance toutes les heures
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Vérification de la fonctionnalité de DnaK après marquage
Résultats:
A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck
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Expériences futures
• Microscopie optique
• Marquage et étude de la fonctionnalité de DnaJ
• Etude cinétique
Double marquage du noyau des cellules (en bleu) et d’une protéine
(en vert)
Bibliography
A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck 18
http://www.pdb.org/pdb/home/home.do
http://expasy.org/
http://www.uniprot.org/
http://www.piercenet.com/
http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescent_labelling