Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
CONTENIDO Página I. INTRODUCCIÓN 1 II. OBJETIVOS 18 III. MATERIALES Y MÉTODOS 19 III.1 Recolecta de organismos 19 III.2 Separación y conteo celular 19 III.2.1 Muestra control 20 III.2.2 Sonicación 20 III.2.3 Electroporación 21 III.2.4 Citometría de flujo 21 III.3 Separación de células de esponja y bacterias 22 III.4 Extracción de DNA 23 III.5 PCR: Amplificación de los genes del 16S 18S 24 III.6 Clonación 25 III.7 Cultivo en placa 26 III.8 Secuenciación 26 III.9 Análisis filogenéticos 27 III.10 Búsqueda de PKS en muestras 27 IV. RESULTADOS 29 IV.1 Separación y conteo celular 29 IV.2 Separación celular por Nycodenz™ 35 IV.3 Cultivo celular 36 IV.4 Extracción de DNA 37 IV.5 PCR: Amplificación de genes ribosomales (16S, 18S) 39 IV.6 Clonación y secuenciación de genes (16S y 18S) 41 IV.7 Filogenia 42 IV.8 Búsqueda de secuencias codificando para PKS en muestras de esponjas
50
IV.9 Clonación y secuenciación de PKS 53 V. DISCUSIÓN 56 V.1 Separación y conteo celular 57 V.2 Métodos para el estudio metagenómico de invertebrados
57
V.3 Análisis filogenéticos 58 V.4 Identificación de microorganismos productores de PKS 67
CONTENIDO (continuación) VI. RECOMENDACIONES Y ESTUDIOS POSTERIORES 69 VII. REFERENCIAS 70
LISTA DE FIGURAS Figura Página
1 Morfología general de las esponjas 7 2 Homogeneizado celular a 40x 29 3 Gráfica de conteos celulares realizados a la
esponja Mycale armata
31 4 Gráfica de conteos celulares realizados a la
esponja Ectyplasia ferox
32 5 Gráfica de conteos celulares realizados a la
esponja Agelas cornifera
33 6 Gráfica de puntos obtenida por medio de
citometría de flujo
34 7 Secuencia de fotos para la realización del
gradiente de Nycodenz™
36 8 Placa de agar marino para cultivo celular 37 9 Calidad de DNA de las diferentes muestras 37 10 Regresión lineal correspondiente a la
cuantificación del DNA
38 11 Gel de agarosa antes del corte del fragmento de
DNA 16S bacterial
39 12 Gel de agarosa después del corte del fragmento
de DNA 16S bacterial
39 13 Gel de agarosa antes del corte del fragmento de
DNA 18S eucariota
40 14 Gel de agarosa después del corte del fragmento
de DNA 18S eucariota
40 15 Gel de agarosa antes del corte del fragmento de
DNA 16S arquea
41 16 Gel de agarosa después del corte del fragmento
de DNA 16S arquea
41 17 Árbol filogenético 16S bacterial de sedimentos
marinos
43 18 Árbol filogenético 18S eucariota de sedimentos
marinos
44 19 Árbol filogenético 16S bacterial de Callyspongia
vaginalis
45 20 Árbol filogenético 16S arquea de Callyspongia
vaginalis
46 21 Árbol filogenético 18S eucariota de Callyspongia
vaginalis
47 22 Árbol filogenético 16S bacterial de Mycale armata 48
LISTA DE FIGURAS (continuación)
23 Árbol filogenético 18S eucariota de Mycale armata 49 24 Gel de agarosa antes del corte de los fragmentos
de DNA amplificados por PKSI-KSL
50 25 Gel de agarosa después del corte de los
fragmentos de DNA amplificados por PKSI-KSL
51 26 Gel de agarosa antes del corte de los fragmentos
de DNA amplificados por PKSI-KSM
51 27 Gel de agarosa después del corte de los
fragmentos de DNA amplificados por PKSI-KSM
52 28 Gel de agarosa antes del corte de los fragmentos
de DNA amplificados por PKSII-KS
52 29 Gel de agarosa después del corte de los
fragmentos de DNA amplificados por PKSII-KS
53 30 Amplificaciones por PCR de PKS-I digeridas por la
enzima ECO-RI
54 31 Amplificaciones por PCR de PKS-I y II digeridas
por la enzima EcoR I
55
LISTA DE TABLAS Tabla Página
I Metabolitos secundarios asociados a esponjas marinas y su actividad
12
II Diversidad bacteriana asociada a esponjas 14 III Oligonucleótidos para amplificación de 16S y 18S 24 IV Oligonucleótidos para amplificación de genes de
PKS tipo I y II
27 V Cuantificación de DNA 38
I. INTRODUCCION
La ecología microbiana se enfoca en el estudio de aspectos
principales de la biodiversidad y la actividad microbiana. La
caracterización de la biodiversidad, incluye el aislamiento, identificación
y cuantificación de los microorganismos en diferentes tipos de hábitats y
por otro lado, la actividad microbiana se refiere al nicho ecológico, es
decir a la función que desempeña cada microorganismo en su hábitat
(Mandigan et al., 1999).
El estudio de la diversidad microbiana se ha realizado desde finales
del siglo XIX, a través del uso de métodos de aislamiento con medios
sólidos como el agar, los cuales se basan principalmente en el
aislamiento de las bacterias a través de medios de cultivo específicos
para cada grupo fisiológico. Sin embargo, estos métodos presentan
grandes limitaciones para describir las comunidades microbianas
presentes en el medio marino, debido a que la mayoría de las bacterias
(hasta un 99%) que se encuentran en este hábitat no pueden ser
cultivadas mediante las técnicas tradicionales (Pace, 1997; Mandigan et
al., 1999; Wagner-Dobler et al., 2002).
2
Consecuentemente, las colecciones bacterianas aisladas, no
representan la biodiversidad marina in situ ni la estructura de la
comunidad bacteriana. Una de las razones por la cual sólo se han
cultivado pocas especies del ambiente marino es debido a que el
aislamiento se realiza en medios relativamente ricos en nutrientes, por
lo que sólo se obtienen grupos bacterianos con altas tasas de
crecimiento que generalmente no juegan un papel importante en el
ecosistema (Mandigan et al., 1999).
TECNICAS PARA EVALUAR LA DIVERSIDAD
El enfoque molecular, ha sido utilizado para evaluar la biodiversidad
microbiana en una variedad de ambientes que cubre todos los biotopos
del planeta que van desde los polos hasta las ventilas hidrotermales
marinas. Esto ha incrementado el conocimiento de la diversidad
microbiana notablemente en los últimos años, como resultado del uso
de herramientas moleculares en microorganismos productores de
sustancias de interés comercial presentes en muestras ambientales,
principalmente mediante el uso de técnicas de extracción de ácidos
nucleicos y de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (González y
Moran, 1997; Cottrell y Kirchman, 2000).
3
Hasta el momento, las técnicas moleculares representan una forma
rápida y confiable para estudiar la diversidad microbiana incluyendo la
biodiversidad eucariota microscópica. Para esto, se utilizan los genes
ribosomales y la amplificación de estos por medio de PCR, ya que las
bacterias presentan en su genoma el gen 16S del DNA ribosomal
(DNAr), que codifica para la subunidad 16S del RNA ribosomal (16S
RNAr), por otra parte, los organismos eucariotas presentan en su
genoma el gen 18S DNAr, que codifica para la subunidad 18S del RNA
ribosomal (18S RNAr). Las secuencias de estos genes se utilizan para la
identificación y filogenia de bacterias y microorganismos eucariotas en
muestras ambientales (González y Moran, 1997; Mandigan et al., 1999;
Cottrell y Kirchman, 2000; Frischer et al., 2000).
Estas regiones fueron seleccionadas debido a que son altamente
conservadas y se encuentran en todos los organismos. Sin embargo, la
molécula del DNA presenta también regiones variables que son especie-
especificas y ayudan para realizar una identificación filogenética. Para
ello se utilizan oligonucleótidos específicos para procariotas y para
eucariotas. La amplificación por PCR y la clonación de los genes
resultantes del PCR del 16S y 18S DNAr, ha permitido estudiar la
diversidad microbiana procariota y eucariota de diferentes ecosistemas
4
sin necesidad de crecer las células en medios de cultivo (Mandigan et
al., 1999; Cottrell y Kirchman, 2000).
DIVERSIDAD BACTERIANA MARINA
El uso de técnicas moleculares tales como la extracción y
secuenciación de ácidos nucleicos, ha permitido la caracterización de la
biodiversidad bacteriana, en la que a cada secuencia de DNA
corresponde una especie bacteriana; en los océanos Atlántico y Pacífico,
la mayoría de las secuencias encontradas, se agrupan dentro de las
subclases alpha y gamma de las proteobacterias. Asimismo, se han
recuperado secuencias de bacterias marinas previamente aisladas
(Pseudomonas, Rhodobacter y Arthrobacter), sin embargo su
abundancia relativa en el medio aún no se conoce (Frischer et al.,
2000).
González y Moran en 1997 examinaron muestras de agua de mar
de regiones costeras, obteniendo aislados bacterianos y clones no
identificados del gen 16S DNAr, los cuales fueron relacionados
filogenéticamente con el grupo alpha de las proteobacterias. Sus
estudios indican que este grupo filogenético es dominante en aguas
marinas y fácilmente aislable en medios de cultivo. Asimismo, fue el
5
primer grupo bacteriano en ser identificado por técnicas moleculares.
Pinhassi et al. (1997) señalaron la presencia de proteobacterias alpha,
beta, gamma, y miembros del grupo de las Cytophaga/Flavobacteria en
muestras de agua de mar. Sus estudios fueron realizados mediante
técnicas de cultivo tradicional y mediante la secuenciación del gen 16S
DNAr de cada uno de los aislados.
ESPONJAS
Las esponjas se encuentran dentro del Phyllum Porifera, son
organismos sésiles que se les puede encontrar en el piso oceánico, en
sustratos rocosos, lodosos o como epibiontes, a su vez sirven como
hábitat a otros organismos, como peces, ofiuros y cangrejos. La mayoría
de especies de esponja vive en las zonas costeras en aguas poco
profundas y hay algunas especies de esponjas vítreas que se distribuyen
a gran profundidad, así como algunos ejemplares que habitan en agua
dulce. Su tamaño puede variar desde unos milímetros hasta 2 metros de
diámetro.
Las esponjas son organismos con estructura y morfología muy
primitiva pues presentan arreglos celulares que no se encuentran
formando órganos ni tejidos, por el contrario, presentan células
6
totipotenciales que al estar en contacto entre ellas desempeñan el papel
de pseudotejidos, diferenciando claramente dos tipos celulares; los
coanocitos (células flageladas) que se encargan de propulsar el agua a
través de la cavidad de la esponja (cámara) y las células epiteliales
(figura 1) (Belarbi et al., 2003). Por lo tanto, las esponjas son
intermediarios entre una colonia de células y un organismo multicelular
verdadero. La superficie externa de la esponja está revestida de células
epiteliales, algunas de las cuales se contraen al tocarlas o como
respuesta a sustancias químicas, de modo que la esponja puede cerrar
los poros y conductos como un mecanismo de defensa (Curtis, 1985).
Figura 1.- Morfología general de las esponjas. Tomada y modificada de Curtis, 1985.
7
Existen alrededor de 15,000 especies de esponjas y de acuerdo a la
estructura esquelética que presentan se les agrupa en tres clases:
Calcárea, esqueleto formado por espículas de carbonato de calcio;
Hexactinellida, esqueleto formado por espículas de sílice fusionadas
entre sí; Demospongiae, presentan espículas de sílice no fusionadas,
una proteína queratinoide resistente llamada espongina o una
combinación de ambas.
Dentro de las esponjas de interés para este trabajo estan: Mycale
armata que es una especie altamente incrustante que forma cojines
masivos que pueden llegar hasta 1 m de diámetro y mas de 0.5 m de
ancho; presenta una coloración anaranjado-rojiza brillante. Esta especie
tiene una estructura firme pero compresible y se puede separar
fácilmente, a pesar de presentar una red de fibras de espongina y
espículas.
También se encuentra la esponja Callyspongia vaginalis es una
especie de forma ramosa, formada por un grupo de tubos o cilindros
huecos con paredes delgadas y una base común la cual se adhiere al
sustrato. La superficie en esta especie presenta proyecciones conulares
y pueden alcanzar hasta 2 mm de altura. La altura de esta especie va de
8
20 a 30 cm aunque existen algunas colonias que llegan a alcanzar 1 m
de altura. El diámetro de los tubos es de 3 a 6 cm. Esta especie
presenta una coloración dorada-amarillenta. Su consistencia es
compresible, suave y elástica con dificultad para romperla, debido a la
presencia de múltiples fibras de elastina y a las espículas que forman su
matriz.
Presentan ambos tipos de reproducción: A) Sexual, ya que son
organismos hermafroditas y tienen una larva de tipo parenquímula que
se aloja en el mesohilo hasta ser liberada para posteriormente asentarse
y formar otra esponja, y B) Asexual por medio de fragmentación.
PRODUCTOS NATURALES MARINOS
Los productos naturales han sido explotados por el hombre para
una amplia gama de propósitos, principalmente en la industria
farmacéutica, alimenticia y agrícola. Históricamente las plantas han sido
los organismos cuyos metabolitos secundarios han beneficiado de forma
considerable a la sociedad. Sin embargo, desde hace algunos años la
investigación del medio marino ha permitido conocer la enorme
biodiversidad y el gran reservorio de productos naturales (bioactivos
marinos) que este medio contiene. Esto es más claro basándonos en el
9
hecho de que más del 70% de la superficie de la tierra se encuentra
cubierta por océanos y se presume que la vida sobre la tierra tuvo su
origen en el mar (Colwell, 2002; Haefner, 2003).
En los últimos años, se han obtenido un gran número de productos
naturales marinos nuevos; compuestos con características diversas
provenientes de macroorganismos como esponjas, ascideas, corales y
briozoarios (Wagner-Dobler et al., 2002). Sin embargo, cada año el
número de moléculas bioactivas conocidas de origen marino aumenta y
con ello, la posibilidad de una proliferación en el ámbito industrial. Los
productos naturales marinos son utilizados como herramientas en la
investigación básica, ya que hay un número elevado de compuestos que
son utilizados como reactivos en biología celular, con efectos como
inhibición de proteínas, vesicularización del aparato de Golgi entre otros
(Faulkner, 2000). También se utilizan como modelos de estudio de
nuevas rutas biosintéticas, para la generación de bancos de datos de
nuevas estructuras químicas así como también en biotecnología.
Algunos de estos metabolitos secundarios de origen marino poseen
características únicas, que no se encuentran en ningún otro compuesto
terrestre, por ejemplo la presencia de terpenoides, alcaloides,
10
poliéteres, entre otros compuestos orgánicos. El papel de estos
metabolitos secundarios está ligado al modo de vida de los organismos
que los poseen. Un ejemplo son los organismos marinos con cuerpos
blandos de vida sedentaria, requiriendo de mecanismos químicos de
defensa a través de metabolitos secundarios que los hacen menos
palatables o incluso tóxicos a los posibles predadores, permitiéndoles
también regular o seleccionar el tipo de epibiontes que los colonizará.
Estos compuestos ayudan a los organismos a evitar ser depredados, a
alejar a sus competidores y a paralizar a sus presas (Aneiros y Garateix,
2004; Haefner, 2003; Harder et al., 2004; Mueller et al., 2004). Una
clase de productos naturales marinos esta formada por las enzimas
policetido sintetasas, las cuales son complejos multienzimaticos que se
encargan de catalizar la biosíntesis de ácidos grasos
RELACION BACTERIA-INVERTEBRADOS
La producción de metabolitos secundarios, muchas veces se ha
encontrado íntimamente ligada con la presencia de microorganismos
simbiontes (Belarbi et al., 2003; Davidson et al., 2001; Kelly et
al.,2003; Ramm et al., 2004), como el caso de la producción de
briostatina, producida por el briozoario Bugula neritina y que en estudios
posteriores se ha encontrado evidencia que sugiere que el organismo
11
encargado de la producción de la briostatina es la proteobacteria
Candidatus Endobugula sertula (Davidson et al., 2001). Esta
proteobacteria, al igual que muchas otras no ha sido aun cultivada, por
lo que su papel en la biosíntesis de briostatina no ha sido aun
demostrado. Otro ejemplo es el que presenta la esponja Dysidea
herbacea la cual se creía que producía una sustancia antibiótica pero
posteriormente se encontró que la encargada de la producción de dicho
metabolito era la cianobacteria Oscillatoria spongeliae asociada a la
esponja (Belarbi et al., 2003).
Se ha demostrado recientemente que muchos de los compuestos
activos producidos por invertebrados pueden provenir de bacterias
asociadas a ellos (Colwell, 2002; Davidson et al., 2001; Kelly et
al.,2003; Wagner-Dobler et al., 2002) (Tabla I). A la vez que se han
incrementado los reportes de nuevos metabolitos producidos por
bacterias marinas, de los géneros Pseudoalteromonas, Alteromonas,
Micrococcus, Bacillus, Acinetobacter, Agrobacterium y Pseudomonas y
otras bacterias no identificadas (Wagner-Dobler et al., 2002).
12
Tabla I.- Metabolitos secundarios asociados a esponjas marinas y su actividad.
ACTIVIDAD PRODUCTO ESPECIE REFERENCIA
Antiviral
Citostática
Antimicrobiana
Avarol
Policetidos
Análogos de Nucleósidos
Müller, 2004
Inhibidora de fosfatasa
Furanoterpenoides
Furosponginas
Furospinosulinas
Spongia officinalis
Iricnia spinulosa
Iricnia muscarum
Erdogan-Orhan et al., 2004
Anti-HIV
Avarol
Avarona
Ilimaquinona
Floroglucinoles
Tziveleka, 2003
Antioxidante
Curcufenol
Aaptamina
Isoaaptamina
Curcudiol
Takamatsu, 2003
Antibacterial
Antifouling Ircinia racemosa Thakur y Anil, 2000
Antifúngica
Antibacterial
Anticancer
Extractos crudos de esponjas
Reniochalina sp.
Acanthella acuta
Haliclona perleve
Xue et al., 2004
Anticancer
Antifúngica Microsclerodermina Microscleroderma sp. Qureshi et al., 2000
Antifouling Haliclonamidas Haliclona sp. Sera et al., 2002
Anticancer
Citotóxica Alteramida A Halichondria okadai Colwell, 2002
Anticancer
Antiinflamatoria
Antiasma
KRN7000
IPL576092
Manoalide
Agelas mauritianus
Petrosia contignata
Luffariella variabilis
Proksch et al., 2002
Citotóxica Latrunculina Latrunculia magnifica Faulkner, 1999
Antiartritis Homo-Plakotenina
Nor-Plakotenina Plakortis lita Qureshi et al., 1999
Antiinflamatoria
Analgésica Sesquiterpeno Luffariella variabilis Haefner, 2003
Anticancer Halicondrina
Isohomohalicondrina Lissodendoryx sp. Munro et al., 1999
Antibiótica Eter bifenol polibrominado Dysidea herbacea Belarbi et al., 2003
13
RELACION BACTERIA- ESPONJA
Una de las características de las esponjas es la colonización de
diferentes grupos de microorganismos incluyendo fotótrofos y
heterótrofos. Debido a la gran cantidad de comunidades comensales
bacterianas que habitan en el tejido epitelial de las esponjas, se ha
sugerido la creación de un nuevo Phyllum bacteriano “Poribacteria”, el
cual represente la afiliación de las nuevas bacterias a los tejidos de la
esponja (Fieseler et al., 2004).
Las esponjas existen desde hace 600 millones de años, lo que nos
hace pensar que las bacterias y las esponjas han coevolucionado
adquiriendo un metabolismo complejo, perdiendo la posibilidad de
crecer por separado (Belarbi et al., 2003; Fieseler et al., 2004; Kelly et
al., 2003 Mueller et al., 2004). De acuerdo a Thakur y Anil (2000) y a
Hentschel y colaboradores (2002), las poblaciones bacterianas van a
presentar variaciones en su modo de vida, catalogándolas en tres tipos:
las bacterias generalistas, aquellas que se encuentran tanto en la
esponja como en el agua; las bacterias asociadas a esponjas, aquellas
bacterias que únicamente se encuentran en las esponjas y no libres en
el medio; y las especialistas, aquellas que se localizan únicamente
adheridas a un tipo de esponjas sin importar la localidad.
14
El estudio y caracterización de las bacterias asociadas a esponjas es
relativamente complejo, ya que existe una gran diversidad de bacterias
asociadas, así como en el agua de mar que la rodea, muchas de estas
bacterias no se pueden cultivar fácilmente con un solo medio de cultivo
(Wagner-Dobler et al., 2002) (Tabla II).
Tabla II.- Diversidad bacteriana asociada a esponjas ESPONJAS GRUPOS ASOCIADOS REFERENCIA
Aplysina aerophoba Gran cantidad de bacterias Friedrich et al., 2001
Rhopaloeides odorabile
Actinobacteria
Bacteria Gram-positiva
Beta y gamma proteobacteria
Bacteria verde sulfurosa y no
sulfurosa
Webster et al., 2001
Cymbastela concentrica
Callyspongia sp.
Stylinos sp.
Presentan variación intraespecifica Taylor, 2004
Kirkpatrickia varialosa
Latrunculia apicalis
Homaxinella balfourensis
Mycale acerata
Sphaerotylus antarcticus
Alpha y gamma proteobacteria
Cytophaga/Flavobacterium Webster, 2004
15
ESTRATEGIAS PARA OBTENCION DE PRODUCTOS
NATURALES MARINOS
Existen 5 estrategias de obtención de productos naturales marinos:
a) Recolecta directa y obtención de extractos; b) Acuicultura de
organismos productores; c) Síntesis química; d) Cultivo de
microorganismos asociados a esponjas; e) Utilización de técnicas de
DNA recombinante (Colwell, 2002).
Trabajos previos han demostrado las dificultades que existen para
obtener productos provenientes de animales marinos. Entre ellos esta la
elevada cantidad de biomasa requerida para satisfacer la demanda de
extracción lo que pone en peligro la sustentabilidad del recurso (Colwell,
2002; Monks et al., 2002).
Existen pocos ejemplos de cultivos intensivos para la producción de
metabolitos secundarios, uno de ellos es el que realiza la compañía
CalBio Marine en San Diego con el briozoario Bugula neritina para la
producción de briostatina, la cual se usa como anticancerígeno1.
1 www.calbiomarine.com
16
La síntesis química de algunos productos naturales marinos ha
resultado ser en extremo compleja, como es el caso de algunos
pequeños compuestos polihalogenados, debido a la complejidad
estructural característica de los productos naturales marinos (Faulkner,
1999).
Una forma de utilizar el potencial bioactivo de los microorganismos
es a través de técnicas metagenomicas de DNA recombinante por medio
de la clonación y expresión heterologa de genes que codifican para
enzimas que están involucradas en el metabolismo secundario como las
enzimas policetido sintetasas (PKS), encargadas de la síntesis de
metabolitos secundarios con estructuras complejas (policétidos). El uso
de estas técnicas presenta varias ventajas, como tener acceso a
genomas de microorganismos sin cultivar, un bajo impacto ambiental y
el descubrimiento de nuevas moléculas (Mueller et al., 2004; Seow et
al., 1997). Se le llama “metagenoma” al DNA de todo un conjunto de
microorganismos que es extraído de una fuente natural (terrestre o
acuática) el cual puede ser utilizado para la búsqueda de nuevas
moléculas (Ginolhac et al., 2004).
17
Dada la importancia actual de la extracción y purificación de
metabolitos secundarios de origen marino para uso industrial y
farmacéutico (Faulkner, 2000) y tomando en cuenta la necesidad de
evaluar la diversidad microbiana asociada a las esponjas marinas
(simbiontes) (Tabla I). Este trabajo se plantea el llevar a cabo la
evaluación de la diversidad microbiana presente en esponjas de
diferentes localidades de Hawaii con el fin de describir dicha diversidad
así como realizar la búsqueda de aquellos genes que pudieran codificar
para la producción de metabolitos secundarios de interés comercial,
implementando y optimizando a su vez las técnicas más utilizadas para
la separación de microorganismos de células de esponjas, debido a las
características físicas y fisiológicas que presentan, a que no se han
explotado en su totalidad y a que actualmente se cuenta con pocos
trabajos de esta índole.
18
II. OBJETIVOS
• Describir la comunidad microbiana (Bacteria, Arquea, Eukarya)
asociada a las esponjas marinas Mycale armata y Callyspongia vaginalis
colectadas en la bahía Kaneohe en Hawaii a través de genes
ribosomales.
• Probar 3 diferentes metodologías para separar bacterias marinas
asociadas a esponjas, utilizando: Electroporación, sonicación y
gradientes de Nycodenz™.
• Realizar la búsqueda de genes involucrados en la producción de
metabolitos secundarios, Policetido sintetasas (PKS) de tipo I y II.
19
III. METODOLOGIA
III.1 RECOLECTA DE ORGANISMOS
Se recolectaron individuos de las esponjas Mycale armata y
Callyspongia vaginalis procedentes de la bahía Kaneohe en Oahu Hawaii.
La recolecta se llevo a cabo por personal de Diversa Corporation y la
Universidad de Hawaii. Se utilizaron aproximadamente 400 gr. de cada
organismo para realizar los experimentos que se describen a
continuación.
III.2 SEPARACION Y CONTEO CELULAR
Se buscó optimizar las técnicas existentes de separación de células
de esponjas de células microbianas, utilizando: sonicación y
electroporación. Para esto, se utilizaron 3 especies de esponjas
diferentes; Mycale armata, Ectyplasia ferox y Agelas cornifera, de las
cuales se tomaron 100 g de material fresco de cada una, se cortó en
pequeños trozos de aproximadamente 2 cm. de espesor y fueron
colocados durante 1 h en agua de mar libre de calcio y magnesio para
evitar la comunicación entre células de esponja, evitando así la
formación de aglomerados celulares. Una vez transcurrido ese lapso, se
colocaron los trozos de esponja en una gasa y se exprimieron a través
20
de la gasa para obtener un homogeneizado celular, del cual se tomaron
4 alícuotas, utilizando una de ellas como control.
III.2.1 Muestra Control:
Se revisó la muestra al microscopio para hacer conteos de la
cantidad de bacterias libres, a través de contraste de fases y
fluorescencia utilizando SYBR® Green (Invitrogen), el cual se conjuga
con DNA de doble cadena. Se realizaron los conteos correspondientes a
la proporción de células bacterianas y células de esponja halladas en la
muestra. Posteriormente se fotografiaron y contaron la cantidad de
bacterias libres en la muestra y las células de esponja.
III.2.2 Sonicación:
La muestra fué dividida en 3 porciones iguales: la primer alícuota
fué sometida a un tratamiento con un tiempo de sonicación de 10 min.,
la segunda fué sometida a sonicación durante 20 min. y la tercera fué
sonicada durante 30 min. en un sonicador marca Fisher Scientific
modelo FS-20 que constaba de un baño de agua a través del cual
pasaban las vibraciones.
21
Una vez transcurridos los tratamientos, se tomaron muestras, se
tiñeron con SYBR® Green y se observaron al microscopio bajo
fluorescencia y contraste de fases, realizando los conteos celulares,
comparando a su vez con la muestra control.
III.2.3 Electroporación:
La muestra fue dividida en 2 porciones iguales. La primer alícuota
fue sometida a un pulso de corriente eléctrica de 330 μF y la segunda se
sometió a 800 μF. Para esto se utilizó un electroporador de cubeta
marca Life Technologies modelo Cell-Porator que constaba de una
cubeta con hielo y 2 electrodos a través de los cuales pasaba la
corriente eléctrica, el cual estaba conectado a una fuente de poder con
un amplificador de corriente.
III.2.4 Citometría de Flujo:
Se utilizó un clitómetro de flujo MoFlo (Cytomation) para realizar
conteos celulares y comparar con los conteos bajo el microscopio en
fluorescencia y en contraste de fases. Se colectó una alícuota de la
muestra y se analizó durante 30 segundos manteniendo una presión
constante. El citómetro se basa en la refracción y difracción que capta
después de emitir un láser sobre las partículas obteniendo una grafica
22
en un plano; indicando la densidad y el tamaño de la partícula. Se
analizó el control y los diferentes experimentos corroborando los datos
obtenidos en el microscopio. Las muestras fueron teñidas con SYBR®
Green usando una dilución 1/1000 en un volumen final de 1 ml y
analizadas en un citómetro MoFlo (Cytomation). Los parámetros
“Forward Scatter”, “Side scatter”, y la fluorescencia en los canales de
FL1 (correspondiente al tamaño, densidad y fluorescencia verde de las
partículas respectivamente) fueron determinados y analizados en un
diagrama de densidad.
III.3 SEPARACIÓN DE CÉLULAS DE ESPONJA Y BACTERIAS.
Para realizar la separación de las células bacterianas de las células
de esponjas, se tomaron 100 gr. de esponja fresca y se cortaron en
pequeños pedazos de entre 2 y 3 cm. de espesor, estos fueron
colocados en un vaso de precipitado con agua de mar libre de calcio y
magnesio durante 1 h, con el fin de evitar la comunicación celular que
existe entre las células de esponja, disminuyendo con esto la formación
de aglomeraciones celulares.
23
Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se sacaron los
fragmentos de esponja y se colocaron en un trozo de gasa esterilizada
para posteriormente exprimirlos a través de la gasa obteniendo así un
homogenado celular.
Posteriormente se centrifugó el homogeneizado y se resuspendió en
20 ml de agua de mar libre de calcio y magnesio, colocándolos en un
tubo de centrifuga al que se le añadió la solución de Nycodenz™
previamente preparada sirviendo como cojín al fondo del tubo por
debajo de la muestra, para después centrifugar la muestra. Esto resultó
en una o varias bandas, las cuales fueron observadas al microscopio de
fluorescencia y de contraste para observar la banda con la mayor
concentración celular y la mejor proporción de células de bacteria-
esponja.
III.4 EXTRACCIÓN DE DNA
Usando muestras frescas de esponjas se realizó la extracción de
ácidos nucléicos de un tamaño aproximado de 10 Kb usando el kit
comercial de la compañía (Mo Bio) soil DNA siguiendo las
recomendaciones del fabricante.
24
III.5 PCR: AMPLIFICACION DE LOS GENES DEL 16S Y 18S
Para la amplificación por PCR de los genes del 16S bacteria, 16S
Arquea y 18S se utilizo el kit comercial de Qiagen “HotStart Taq Master
Mix”, siguiendo las instrucciones del fabricante, utilizando los siguientes
oligonucleótidos (Tabla III):
Tabla III.- Oligonucleótidos para amplificación de 16S y 18S.
Nombre Secuencia Referencia
Eucariota Euk515 fwd 5’CCA GCM GCC GCG GTA A Lane, 1991
Eucariota Euk1195 rev 5’CAT CAC AGA CCT G Giovannoni et al., 1988
Bacteria UN 357 fwd 5’CTC CTA CGG GAG GCA GCA G Muyzer y Uitterlinden, 1993
Bacteria UN 907 rev 5’CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT Lane et al., 1985
Arquea 21 fwd 5’TTC CGG TTG ATC CYG CCG GA DeLong, 1992
Arquea 958 rev 5’YCC GGC GTT GAM TCC AAT T DeLong, 1992
Las reacciones de PCR se prepararon agregando:
25 l de HotStart master mix 0.5 l oligonucleótido sentido (50 μM)
0.5 l oligonucleótido antisentido (50 μM) 23 l agua libre de nucleasas
Añadiendo 49 l por reacción mas 1 l del DNA de la muestra.
Se centrifugaron los tubos y se programó el termociclador como se
indica a continuación:
25
95°C 10 min activación del HotStart 95°C 30 seg Desnaturalización
55°C 45 seg Alineamiento 72°C 1.45 min Extensión
25 ciclos 72°C 10 min Extensión final
4°C constantes
Una vez concluido el ciclo de PCR, se analizó el producto resultante
en un gel de agarosa para corroborar la amplificación de los genes del
16S y 18S. Se continuó con el corte del fragmento que presentaba el
tamaño deseado, purificando la banda con el kit de Qiagen “QIAquick
Gel extraction” y se procedió con la preparación de la reacción de
transformación (clonación).
III.6 CLONACIÓN
Para la preparación de la reacción de clonación se utilizó el kit
comercial de Invitrogen “TOPO-TA Cloning kit” siguiendo las
recomendaciones del fabricante. Se utilizaron las células súper
competentes “Omnimax strip well cells” para obtener un mejor número
de colonias, estas fueron colocadas en placas con kanamicina 50 g/ml
con X-gal a 37°C. Una vez que se incubaron, se picaron las colonias
individualmente y se colocaron en placas de 96 pozos con medio liquido
26
LB kanamicina 50 g/ml y se incubaron a 37°C durante 17 hr para su
posterior análisis, por secuenciación y la verificación del inserto
utilizando enzimas de restricción.
III.7 CULTIVO EN PLACA
Para el cultivo de bacterias marinas se utilizaron 100 l del
homogenado celular y se colocaron en placas con agar marino y medio
SN para cianobacterias, estas se incubaron a 25°C hasta observar
crecimiento de colonias. Una vez que crecieron las colonias se realizó un
estriado para corroborar que se trataba de una sola especie y que el
cultivo era puro.
III.8 SECUENCIACIÓN
Se extrajo el DNA de cada cultivo y las diferentes colonias fueron
secuenciadas por personal de DIVERSA, una vez obtenidas las
secuencias se realizaron BLAST en la página de la NCBI con cada una de
las secuencias encontradas, para construir los diferentes árboles
filogenéticos.
27
III.9 ANÁLISIS FILOGENÉTICOS
Utilizando las secuencias obtenidas de los diferentes experimentos
(Cultivo en placa, 16S y 18S), se construyeron árboles filogenéticos de
máxima parsimonia y de neighbor-joining correspondientes a los
microorganismos asociados a las esponjas marinas usando los
programas Bioedit, Clustal W, MEGA 3 y PHYLIP.
III.10 BÚSQUEDA DE PKS EN MUESTRAS
Se realizaron búsquedas mediante PCR y secuenciación de clonas
que tuvieran genes que codificaran para las policétido sintetasas. Para
ello se utilizaron oligonucleótidos (Tabla IV) para amplificar las regiones
de PKS tipo I y II presentes en las muestras.
Tabla IV.- Oligonucleótidos para amplificación de genes de PKS tipo I y II.
Nombre Secuencia Referencia
Control
Sponge3 fwd
5’TGGAGCTCAGTTGGCAGGTA Piel, 2004
Control
Sponge3 rev
5’TGGTTTCAACAGCAGCATCAC Piel, 2004
Control
spong11 fwd
5’GCATGATGCTGGAGACGAGCTG Piel, 2004
Control
spong11 rev
5’CGTCGAACGCCTTGCACTGC Piel, 2004
PKS I
KSLF fwd
5’CCSCAGSAGCGCSTSYTSCTSGA Ginolhac, 2004
PKS I
KSLR rev
5’GTSCCSGTSCCGTGSGYSTCSA Ginolhac, 2004
28
PKS I
KSMA-F fwd
TS GCS ATG GAC CCS CAG CAG Izumikawa, 2003
PKS I
KSMB-R rev
CC SGT SCC GTG SGC CTC SAC Izumikawa, 2003
PKSII fwd 5'TSGCSTGCTTCGAYGCSATC Metsä-Ketelä, 1999
PKSII rev 5'TGGAANCCGCCGAABCCGCT Metsä-Ketelä, 1999
Las reacciones de PCR se prepararon agregando:
25 l de HotStart master mix 0.5 l oligonucleótido sentido (50 μM)
0.5 l oligonucleótido antisentido (50 μM) 23 l agua libre de nucleasas
Añadiendo 49 l por reacción mas 1 l del DNA de la muestra.
Se centrifugaron los tubos y se programó el termociclador como se
indica a continuación:
95°C 10 min activación del HotStart 95°C 30 seg Desnaturalización
55°C 45 seg Alineamiento 72°C 1.45 min Extensión
25 ciclos 72°C 10 min Extensión final
4°C constantes
Una vez concluido el ciclo de PCR, se corrió un gel de agarosa al
1% para corroborar la amplificación de los genes de PKS tipo I y II y se
procedió a cortar el fragmento que presentaba el tamaño deseado,
purificando la banda con el kit de Qiagen “QIAquick Gel extraction”, para
29
posteriormente clonar los fragmentos purificados. También se utilizó un
programa de condiciones astringentes de temperatura para buscar un
mejor resultado en la amplificación de PKS.
IV. RESULTADOS
IV.1 SEPARACION Y CONTEO CELULAR
Al procesar los homogeneizados celulares en los diferentes
tratamientos, que comprendían el empleo de técnicas de sonicación,
electroporación, así como la utilización de una muestra control para la
separación celular se encontró lo siguiente:
Para los conteos celulares con el microscopio, se contaron 6 campos
visuales seleccionados aleatoriamente en cada muestra, tomando en
cuenta el campo de visión a 40X como se muestra en la figura 2.
Figura 2.- Homogeneizado celular a 40x: a la izquierda por contraste de fases y a la derecha utilizando fluorescencia con SYBR® Green.
30
Los conteos se realizaron por triplicado y posteriormente se
realizaron los análisis estadísticos (ANOVAS) con los programas
SigmaSTAT y SigmaPLOT, graficando como se muestra a continuación:
31
Mycale armata
Figura 3.- Gráfica de cajas con intervalos de confianza (sombreados) de los conteos celulares correspondientes a la cantidad de bacterias libres (izquierda) y la cantidad de células de esponja libres en la muestra (derecha): Control (c), sonicación 10 min (S10), sonicación 20 min (S20), sonicación 30 min (S30), electroporación 330 F (EP 330), electroporación 800 F (EP 800) correspondiente a los diferentes tratamientos realizados a la esponja Mycale armata (abajo).
32
Ectyplasia ferox
Figura 4.- Gráfica de cajas con intervalos de confianza (sombreados) de los conteos celulares correspondientes a la cantidad de bacterias libres (izquierda) y la cantidad de células de esponja libres en la muestra (derecha): Control (c), sonicación 10 min (S10), sonicación 20 min (S20), sonicación 30 min (S30), electroporación 330 F (EP 330), electroporación 800 F (EP 800) correspondiente a los diferentes tratamientos realizados a la esponja Ectyplasia ferox (abajo).
33
Agelas cornifera
Figura 5.- Gráfica de cajas con intervalos de confianza (sombreados) de los conteos celulares correspondientes a la cantidad de bacterias libres (izquierda) y la cantidad de células de esponja libres en la muestra (derecha): Control (c), sonicación 10 min (S10), sonicación 20 min (S20), sonicación 30 min (S30), electroporación 330 F (EP 330), electroporación 800 F (EP 800) correspondiente a los diferentes tratamientos realizados a la esponja Agelas cornifera (abajo).
34
En el caso de las 3 especies de esponjas analizadas por medio de
análisis de variancia de una vía, no se registraron diferencias
significativas en cuanto a la cantidad de bacteria libre existente en la
muestra una vez realizados los diferentes experimentos de sonicación y
electroporación. Una vez concluidos los conteos en microscopio, se
procedió a la corroboración de los resultados obtenidos utilizando
citometría de flujo para cada una de las muestras, a continuación se
muestra un ejemplo de una gráfica de puntos, señalando las áreas
donde se encontraban la mayor cantidad de células bacterianas (A1) y
de células de esponja (A2) como se indica en la siguiente figura.
Figura 6.- Gráfica de puntos obtenida por medio de citometría de flujo de los conteos celulares de bacterias y de esponja de las muestras antes mencionadas, FL1= fuorescencia verde (excitación a 488 y emisión a 530 nm), SSC= densidad de la partícula, FSC= tamaño de la partícula.
FSC SSC
FL
1
SS
C
A2
A1
35
Se pretendía obtener un incremento notable en la relación bacteria-
células de esponja para facilitar la extracción de ácidos nucleicos, así
como la identificación y el cultivo celular bacteriano por medio de la
implementación de técnicas de electroporación y de sonicación. Sin
embargo, no fue así, ya que se obtuvieron variaciones mínimas no
congruentes en cuanto a el tipo de muestra y el método a seguir para
aumentar esta relación.
IV.2 SEPARACIÓN CELULAR POR NYCODENZ™
Se preparó un gradiente de Nycodenz™ utilizando los
homogeneizados celulares de las esponjas Mycale armata y Callyspongia
vaginalis, utilizando una centrifuga Beckman avanti J-301 para correr el
gradiente, obteniendo las bandas que se ilustran en las siguientes
imágenes, las cuales contenían células de esponja y bacterias (figura
7):
36
Figura 7.- Secuencia de fotos de izquierda a derecha y de arriba abajo para la realización del gradiente de Nycodenz™, que pasa de ser un homogenado disperso (3) a una banda que contiene las células bacterianas y de esponja (4).
IV.3 CULTIVO CELULAR
Se realizaron cultivos celulares en agar marino (figura 8),
obteniendo 9 especies bacterianas diferentes, las cuales se identificaron
por medio de 16S y se indican en la tabla V.
2
1
3 4
37
Figura 8.- Placa de agar marino en las que se realizó el aislamiento de las cepas donde se puede observar un estriado.
IV.4 EXTRACCIÓN DE DNA
Se realizó la extracción de DNA con el kit soil DNA (Mo Bio),
posteriormente se revisó la calidad utilizando geles de agarosa 1%
(figura 9) y se cuantificó por medio de un espectrofluorometro
(excitación a 480 nm y emisión a 516 nm) obteniendo con esto una
estimación de la cantidad de DNA presente en la muestra (tabla V).
Figura 9.- Calidad de DNA de las diferentes muestras que se corrieron (pozos del 1 al 9) en un gel de agarosa al 1%.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
38
Tabla V.- Valores obtenidos en la cuantificación de DNA por espectrofotometria correspondientes al gel de agarosa anterior (figura 9).
DNA ng/μ l Pozo Muestra
0 1 Shewanella oneidensis
1 2 Shewanella frigidimarina
30 3 Shewanella massilia
28 4 Bacillus methanolicus
0 5 Pseudomonas putida
2 6 Shewanella frigidimarina
0 7 Bacillus methanolicus
2 8 Psychrobacter pacificensis
1 9 Psychrobacter glacincola
Figura 10.- Regresión lineal obtenida con el espectrofotómetro para la cuantificación del DNA de la tabla anterior usando el kit Picogreen (Invitrogen).
39
IV.5 PCR: AMPLIFICACIÓN DE GENES RIBOSOMALES (16S,
18S).
A continuación se presentan algunos geles de agarosa al 1%
representativos que corresponden a los 3 pares de oligonucleótidos
utilizados, 16S Bacterial (figuras 11 y 12), 18S Eucariota (figuras 13 y
14) y 16S Arquea (figuras 15 y 16).
Figura 11.- Gel de agarosa al 1% antes del corte del fragmento de DNA amplificado correspondiente a un tamaño de 600 pb. mediante los oligonucleótidos para el 16S bacterial.
Figura 12.- Gel de agarosa al 1% después del corte del fragmento de DNA amplificado correspondiente a 600 pb. para su posterior purificación; el fragmento cortado se puede observar en los tubos del costado derecho.
600pb
600pb
40
Figura 13.- Gel de agarosa al 1% antes del corte del fragmento de DNA amplificado correspondiente a un tamaño de 600 pb. mediante los oligonucleótidos para el 18S eucariota.
Figura 14.- Gel de agarosa al 1% después del corte del fragmento de DNA amplificado correspondiente a 600 pb. para su posterior purificación.
600pb
600pb
41
Figura 15.- Gel de agarosa al 1% antes del corte del fragmento de DNA amplificado correspondiente a un tamaño de 900 pb. mediante los oligonucleótidos para el 16S arquea.
Figura 16.- Gel de agarosa al 1% después del corte del fragmento de DNA amplificado correspondiente a 900 pb. para su posterior purificación.
IV.6 CLONACIÓN Y SECUENCIACIÓN DE GENES (16S Y 18S)
Una vez purificados los fragmentos resultantes de la amplificación
por PCR de los diferentes genes del 16S y 18S, se clonaron en el vector
TOPO-TA y se expresaron en E. coli, las reacciones se colocaron en
placas de agar con X-gal y en presencia de kanamicina 50 μg/ml. Una
900pb
900pb
42
vez que se dejaron crecer durante la noche, se picaron las colonias
resultantes, fueron colocadas en medio LB con kanamicina 50 μg/ml e
incubadas durante 16 h. para posteriormente secuenciar los clones,
obteniendo así las secuencias que se utilizaron para construir los
diferentes árboles filogenéticos.
IV.7 FILOGENIA
Una vez obtenidas las secuencias procedentes de la amplificación
de los genes del 16S Bacteria, 16S Arquea y 18S Eucariota de los 2
tratamientos, tanto el crudo como el Nycodenz™, de las diferentes
muestras, se realizaron los árboles filogenéticos de máxima parsimonia
y de neighbor-joining que se presentan a continuación de la figura 17 a
la 23. En ellos se pueden observar los diferentes grupos bacterianos
encontrados, así como en azul aquellas secuencias que se encontraron
por medio del análisis de las muestras en crudo y en rojo se pueden
identificar las muestras procesadas por medio del gradiente de
Nycodenz™.
43
Sedimentos Marinos 16S bacterial:
Figura 17 .- Árbol filogenético de Neighbor-joining correspondiente a los genes del 16S bacterianos amplificados de sedimentos marinos, en azul se observan las muestras de la extracción en crudo y de rojo se pueden notar las muestras obtenidas de la extracción posterior al gradiente de Nycodenz™. Muestra los valores de bootstrap obtenidos por Neighbor-joining (arriba) y por Maxima parsimonia (abajo).
44
Sedimentos Marinos 18S eucariota:
Figura 18.- Árbol filogenético de Neighbor-joining correspondiente a los genes del 18S eucariota amplificados de sedimentos marinos, en azul se observan las muestras de la extracción en crudo y de rojo se pueden notar las muestras obtenidas de la extracción posterior al gradiente de Nycodenz™. Muestra los valores de bootstrap obtenidos por Neighbor-joining (arriba) y por Maxima parsimonia (abajo).
45
Callyspongia vaginalis 16S bacterial:
Figura 19.- Árbol filogenético de Neighbor-joining correspondiente a los genes del 16S bacterianos amplificados de Callyspongia vaginalis, en azul se observan las muestras de la extracción en crudo y de rojo se pueden notar las muestras obtenidas de la extracción posterior al gradiente de Nycodenz™. Muestra los valores de bootstrap obtenidos por Neighbor-joining (arriba) y por Maxima parsimonia (abajo).
46
Callyspongia vaginalis 16S Arquea:
Figura 20.- Árbol filogenético de Neighbor-joining correspondiente a los genes del 16S Arquea amplificados de Callyspongia vaginalis, en azul se observan las muestras de la extracción en crudo y de rojo se pueden notar las muestras obtenidas de la extracción posterior al gradiente de Nycodenz™. Muestra los valores de bootstrap obtenidos por Neighbor-joining (arriba) y por Maxima parsimonia (abajo).
47
Callyspongia vaginalis 18S eucariota:
Figura 21.- Árbol filogenético de Neighbor-joining correspondiente a los genes del 18S eucariota amplificados de Callyspongia vaginalis, en azul se observan las muestras de la extracción en crudo y de rojo se pueden notar las muestras obtenidas de la extracción posterior al gradiente de Nycodenz™. Muestra los valores de bootstrap obtenidos por Neighbor-joining (arriba) y por Maxima parsimonia (abajo).
48
Mycale armata 16S bacterial:
Figura 22.- Árbol filogenético de Neighbor-joining correspondiente a los genes del 16S bacterianos amplificados de Mycale armata, en azul se observan las muestras de la extracción en crudo y de rojo se pueden notar las muestras obtenidas de la extracción posterior al gradiente de Nycodenz™. Muestra los valores de bootstrap obtenidos por Neighbor-joining (arriba) y por Maxima parsimonia (abajo).
49
Mycale armata 18S eucariota:
Figura 23.- Árbol filogenético de Neighbor-joining correspondiente a los genes del 18S eucariota amplificados de Mycale armata, en azul se observan las muestras de la extracción en crudo y de rojo se pueden notar las muestras obtenidas de la extracción posterior al gradiente de Nycodenz™. Muestra los valores de bootstrap obtenidos por Neighbor-joining (arriba) y por Maxima parsimonia (abajo).
50
IV.8 BÚSQUEDA DE SECUENCIAS CODIFICANDO PARA PKS
EN MUESTRAS DE ESPONJAS
Se realizó la búsqueda de PKS de tipo I y II por medio de PCR como
se indicó en la metodología aquí descrita, obteniendo los siguientes
geles de agarosa al 1% que corresponden a los 3 pares de
oligonucleótidos utilizados, KSL-PKSI (figuras 24 y 25), KSM-PKSI
(figuras 26 y 27) y KS-PKSII (figuras 28 y 29); en las cuales se observa
un patrón de bandeo irregular, por lo que se procedió a cortar
únicamente los fragmentos que presentaban el tamaño esperado.
Figura 24.- Gel de agarosa al 1% antes del corte de los fragmentos de DNA amplificado correspondientes a un tamaño de 600 pb. mediante los oligonucleótidos para el PKSI-KSL.
600pb
51
Figura 25.- Gel de agarosa al 1% después del corte de los fragmentos de DNA amplificado correspondientes a un tamaño de 600 pb. mediante los oligonucleótidos para el PKSI-KSL.
Figura 26.- Gel de agarosa al 1% antes del corte de los fragmentos de DNA amplificado correspondientes a un tamaño de 600 pb. mediante los oligonucleótidos para el PKSI-KSM.
600pb
600pb
52
Figura 27.- Gel de agarosa al 1% después del corte de los fragmentos de DNA amplificado correspondientes a un tamaño de 600 pb. mediante los oligonucleótidos para el PKSI-KSM.
Figura 28.- Gel de agarosa al 1% antes del corte de los fragmentos de DNA amplificado correspondientes a un tamaño de 600 pb. mediante los oligonucleótidos para el PKSII-KS.
600pb
600pb
53
Figura 29.- Gel de agarosa al 1% después del corte de los fragmentos de DNA amplificado correspondientes a un tamaño de 600 pb. mediante los oligonucleótidos para el PKSII-KS.
IV.9 CLONACION Y SECUENCIACION DE PKS
Una vez que se obtuvieron las secuencias, se compararon con la
base de datos de la NCBI mediante el programa BLAST. Las secuencias
analizadas no mostraron identidad con ninguna policetido sintetasa
(PKS). Debido a esto se probaron los diferentes pares de
oligonucleótidos y los 2 tipos de programas en el termociclador, uno de
un modo normal de 25 ciclos y el otro bajo condiciones astringentes
pero con ninguna de las secuencias de los clones se tuvieron resultados
positivos, a pesar de que se observó un patrón de bandeo con bandas
de 600 pb de tamaño y se purificó por gel.
600pb
54
Para corroborar la presencia de los insertos de 600 pb, se realizó
una digestión de los plásmidos con la enzima de restricción EcoR I
obteniendo los siguientes geles (figuras 30 y 31), en donde se observó
que sí se encontraban los insertos de 600 pb (banda inferior) así como
una banda en la parte superior del gel correspondiente a los plásmidos.
Figura 30.- Gel con 18 muestras de amplificaciones por PCR de PKS tipo I cortadas con la enzima de restricción EcoR I, se pueden observar dos bandas, una de aproximadamente 600 pb, tamaño esperado de nuestro producto de PCR y otra mayor correspondiente al vector.
600pb
55
Figura 31.- Gel con 18 muestras de amplificaciones por PCR de PKS tipo I y II cortadas con la enzima de restricción EcoR I, se pueden observar dos bandas, una de aproximadamente 600 pb, tamaño esperado de nuestro producto de PCR y otra mayor correspondiente al vector.
600pb
56
V. DISCUSION
Los ecosistemas marinos muestran una gran diversidad de
condiciones ambientales que favorecen el establecimiento de
poblaciones microbianas adaptadas a nichos específicos. A través del
uso extensivo de la secuencias de 16S para estudiar la diversidad in situ
se ha demostrado que el potencial de biodiversidad es muy grande
(Pace, 1997). Las esponjas marinas no son una excepción. Se ha
demostrado que existe una gran diversidad microbiana en comunidades
asociadas y que pueden ser colonizadas por microorganismos de los
dominios Bacteria, Arquea y Eukarya. El estudio de las poblaciones de
bacterias cobra importancia en la búsqueda y descubrimiento de nuevas
moléculas o metabolitos secundarios con potencial terapéutico. Por
ejemplo, los compuestos furanoterpenoides, furosponginas y
furospinosulinas (tabla I) son derivados de esponjas y si su origen es
microbiano existe la posibilidad de producción comercial a través de
técnicas de DNA recombiante. Desde el punto de vista de ciencia básica,
el estudio de las poblaciones de microorganismos asociados a esponjas
contribuye a la elaboración de inventarios taxonómicos moleculares y
puede proporcionar bases comparativas con otras especies de esponjas
de Hawaii o también de las mismas especies en otras zona
biogeográficas. Este estudio ha permitido evaluar la hipótesis de la
57
composición taxonómica de bacterias asociadas a las esponjas Mycale y
Callyspongia. Desde el punto de vista biotecnológico, la identificación de
especies productoras de metabolitos secundarios y la búsqueda de PKS
puede generar interés comercial. A continuación se discuten los
resultados en contraste con la literatura relevante.
V.1 SEPARACION Y CONTEO CELULAR
La separación de células es necesaria para el estudio de
comunidades complejas formadas por células procariotas y eucariotas
en ambientes como esponjas, ascideas y también puede ser aplicado
para estudiar el tracto digestivo de insectos tales como termitas2.
V.2 METODOS PARA EL ESTUDIO METAGENOMICO DE
INVERTEBRADOS.
Los experimentos reportados en esta tesis indican que los
tratamientos con sonicación y electroporación no son eficientes para
separar las células de esponja y en su lugar otros métodos deben ser
utilizados. Por ejemplo el uso de enzimas específicas para la membrana
eucariótica o agentes que ataquen el citoesqueleto. De manera
alternativa para estudios metagenomicos se pueden fraccionar el DNA
2 http://www.eastbayexpress.com/issues/2005-09-07/news/feature.html
58
por medio de G+C con bizbenzamida para su posterior clonación en
vectores de expresión (Ferrer et al., 2005). A su vez, estudios de
proteómica y microarreglos pueden otorgar ayuda valiosa para evaluar
la expresión y la bioquímica de compuestos bioactivos (Li y Qin, 2005).
A pesar de que no se lograron separar completamente las células
de esponja de las bacterias por sonicación y electroporación el uso y
optimización del Nycondenz™ enriqueció la muestra con células de
bacteria y la combinación de separación parcial con la de DNA puede
resultar en DNA y células bacterianas libres de eucariota.
V.3 ANALISIS FILOGENETICOS
Los estudios de diversidad microbiana in situ a través de secuencias
ribosomales en las esponjas Mycale y Callyspongia mostraron que están
principalmente colonizadas por proteobacterias de los grupos alpha y
gamma como se esperaba debido a lo reportado anteriormente por
Webster y colaboradores en el 2004 para otras esponjas. Las secuencias
encontradas en las esponjas son diferentes entre Mycale y Callyspongia
y estas a su vez son diferentes a la diversidad encontrada en
sedimentos. Además de las proteobacterias se detectaron secuencias del
grupo de bacteroidetes en las tres muestras indicando que son un grupo
59
abundante en el ambiente marino pero no especifico de las esponjas.
Basándonos en los trabajos de Dang y Lovell (2002) y de Webster y
Hill (2001), en los que mencionan que el grupo de las alpha
proteobacterias se encuentra muy bien representado podemos
mencionar que los resultados obtenidos en los diferentes árboles
filogenéticos construidos en este estudio coinciden en el caso de las
esponjas analizadas, siendo muy notable en la esponja Mycale armata
(fig. 22), que presentó mas de 40 secuencias que corresponden a esta
subclase de las proteobacterias. A pesar de que la esponja Callyspongia
vaginalis (fig. 19) presentó únicamente 4 secuencias de este tipo, estas
secuencias fueron obtenidas tanto de la muestra cruda como de la
muestra previamente procesada por un gradiente de Nycodenz™, lo que
confirma lo anterior y corrobora la dominancia numérica sugerida por
González y Moran en 1997. Sin embargo, esto también significa que
puede existir sesgo en el proceso de separación celular y extracción de
ácidos nucleicos de las esponjas o también que exista sesgo en el
proceso de amplificación de los genes ribosomales. Para responder a
estas preguntas sería necesario realizar experimentos con muestras
artificiales de diferentes cultivos bacterianos de proteobacterias alpha y
gamma y estudiar si existe sesgo en el proceso de separación debido a
diferencias en el tamaño celular o facilidad de extracción de ácidos
60
nucleicos. Para estudiar las abundancias relativas se pueden realizar
amplificaciones cuantitativas con oligonucleótidos específicos para cada
grupo con instrumentos para PCR en tiempo real.
En relación a la subclase gamma de las proteobacterias, se
identificaron varias secuencias pertenecientes a miembros de este
grupo, particularmente en la esponja Callyspongia vaginalis (fig. 19)
(Taylor et al., 2004), ya que se obtuvieron secuencias de gamma
proteobacterias por ambos métodos, tanto por la extracción en crudo
como la de Nycodenz™, sin embargo, la cantidad de secuencias
obtenidas por la extracción en crudo fue notablemente mayor,
identificando 16 secuencias por este método contra únicamente 3 por el
método de Nycodenz™. A su vez, como se puede observar en la figura
22, el grupo de las gamma proteobacterias no se encontró representado
en la esponja Mycale armata, ya que no se obtuvieron secuencias por
ninguno de los métodos realizados, sugiriendo la probabilidad de algún
grado de especificidad huésped-bacteria, no siendo así en Callyspongia
vaginalis (Taylor et al., 2004).
El grupo de las gamma proteobacterias también se encontró
representado por secuencias obtenidas tanto de la extracción en crudo
61
como la de Nycodenz™ en los sedimentos marinos de la localidad,
presentando solo 6 secuencias (fig. 17).
A diferencia de lo reportado por Fieseler y colaboradores (2004), en
este estudio no se registraron secuencias emparentadas con la subclase
Delta de las proteobacterias en ninguna de las especies de esponja
analizadas. Sin embargo, se encontraron algunas secuencias
representantes de este grupo en la muestra de sedimentos marinos y se
obtuvieron por ambos métodos (fig. 17 vs 19 y 22). La presencia de
proteobacterias delta en sedimentos se explica por que este grupo de
bacterias es de vida anaerobia y los sedimentos pueden proporcionar
ambientes anóxicos que favorecen el crecimiento de delta
proteobacteria y otros grupos anaeróbicos. Algunas esponjas también
pueden alojar poblaciones microbianas anaeróbicas, especialmente
aquellas especies de esponjas con simbiontes intracelulares o con
poblaciones densas de microorganismos que inhiban la difusión de
oxígeno dentro de la colonia de bacteria generando micro ambientes
anaeróbicos. Este aspecto puede ser estudiado a través de el
establecimiento de cultivos anaeróbicos de bacterias procedentes de
esponjas. La presencia de anaerobiosis puede jugar un papel importante
en la producción de metabolitos secundarios pues muchas de las
62
reacciones de dehalogenación durante la síntesis de moléculas
bioactivas se reconocen ocurrir en ambientes anaeróbicos.
Para el grupo de las Citofaga-Flavobacteria-Bacteroidetes (CFB),
Pinhassi y colaboradores (1997) analizaron muestras de agua de mar y
encontraron varias secuencias correspondientes a este grupo, por otra
parte, en este trabajo se encontró una buena representación del grupo
CFB en las esponjas marinas analizadas en este estudio, presentando 9
secuencias de este grupo para la esponja Callyspongia vaginalis (fig. 19)
y 4 secuencias en la esponja Mycale armata (fig. 22). De forma
particular, casi todas las secuencias obtenidas en este estudio se
obtuvieron en las muestras analizadas por Nycodenz™, sugiriendo que si
se pretenden realizar búsquedas o estudios enfocados al grupo CFB, se
obtendrían mejores resultados si se realizan las extracciones de DNA
posteriores a los gradientes de Nycodenz™.
En lo correspondiente a las cianobacterias, en este estudio
únicamente fueron encontradas 2 secuencias de este grupo Estas se
encontraron en la muestra de Callyspongia vaginalis procesada en crudo
(fig. 19), lo que sugiere la probabilidad de que estas cianobacterias se
encontraban pegadas superficialmente a la esponja o bien en el agua
63
circundante. El estudio de poblaciones de cianobacterias es importante
por el papel que pueden jugar en simbiosis con las esponjas, sin
embargo metodológicamente es muy difícil el poder establecer el sitio de
colonización y la interacción simbiótica entre la esponja y poblaciones de
cianobacterias por técnicas microscópicas o estudios poblacionales tales
como en este trabajo. Para analizar este aspecto metodológicamente
seria necesario el establecer cultivos en el laboratorio de esponjas
colonizadas por cianobacterias e inhibir el metabolismo fotosintético
mediante oscuridad y observar el efecto en la esponja. Otra manera
seria a través del uso de marcadores tales como 14C que pudiera ser
fijado por la cianobacteria y translocado a la esponja en forma de algún
metabolito o exudado que pueda ser detectado en el tejido de la
esponja.
De manera similar en varios estudios se ha encontrado que la
presencia de compuestos que han sido aislados de macroorganismos
como esponjas y tunicados ha estado íntimamente ligada a la presencia
(simbiosis) o a la alimentación de estos macroorganismos de otros
microorganismos (Aneiros y Garateix, 2004). Este trabajo se enfocó a
evaluar la presencia de esos microorganismos asociados a las especies
de esponjas antes mencionadas, proponiendo un punto de partida para
64
la búsqueda de microorganismos específicos, abordándolo a través de su
filogenia y la capacidad de estos de producir sustancias activas. Así
mismo la diversidad bacteriana, va a estar íntimamente relacionada con
las condiciones ambientales, ecológicas, así como la dinámica de las
diferentes especies tanto bacterianas como la asociación de otros
invertebrados y microorganismos (Hentschel et al., 2002).
En general, la filogenia microbiana in situ descrita en este estudio,
concuerda con lo publicado por (Hentschel et al., 2002). Ellos
concluyeron que las bacterias asociadas a invertebrados marinos tales
como las esponjas marinas, son filogenéticamente distintas y que existe
una gran diversidad entre éstas.
Existen trabajos con otras especies donde se han encontrado
poblaciones bacterianas estructuradas y consistentes en diferentes
organismos (Schirmer et al., 2005), como es el caso de la briostatina en
el briozoario Bugula neritina, que se pretende cultivar en la costa de
California (Davidson, 2001; Taylor et al., 2004). Esto sugiere que los
invertebrados marinos han coevolucionado con especies microbianas y
que las asociaciones entre micro y macrobiota sean muy especificas e
interdependientes en procesos tales como la síntesis de compuestos
65
bioactivos en bacterias como mecanismos de defensa en los
invertebrados colonizados. Este tema es muy importante en la búsqueda
y descubrimiento de nuevos productos naturales marinos (Schirmer et
al., 2005).
En cuanto a las secuencias eucariotas encontradas por el análisis
del 18S ribosomal, se encontraron secuencias de representantes
diversos tales como ascideas, poliquetos, diatomeas y esponjas. Sin
embargo, no se encontró ningún patrón de ocupación por parte de
estos y fueron encontradas por ambos métodos tanto en crudo como
por Nycodenz™ (fig. 18, 21 y 23), coincidiendo con los resultados de
Taylor y colaboradores (2004), ya que la mayoría de las especies
eucariotas viven en una asociación intima con otros eucariotas,
usándolos como hospederos o huéspedes.
También se ha reportado la presencia de otras especies de
invertebrados marinos tales como organismos del género Ophiactis
familia Ofiuroidea, estos, utilizan a las esponjas como un medio de
protección ante otros depredadores y como microhabitat en estadios
juveniles (Bejarano-Chavarro, 2002; Henkel y Pawlik, 2005).
66
En cuanto a la esponja Callyspongia vaginalis, se puede mencionar
también su ocupación por miembros de la familia Ophiuroidea, así como
su amplia distribución a nivel mundial (Caballero et al., 2004; Henkel y
Pawlik, 2005). Esto se observo en ambas especies pero fue muy notable
en la esponja Mycale armata sin embargo, no se reportaron secuencias
de miembros de esta familia en este trabajo (fig. 21), indicando que son
los organismos juveniles los que llegan a colonizar una vez
metamorfizados.
De manera alternativa las bases de datos de 18S no son tan
grandes como las de 16S y puede ser que la similitud en las secuencias
sea un artefacto debido a la carencia de secuencias representativas en
los grupos buscados.
La biodiversidad asociada a esponjas se puede estudiar a través de
técnicas moleculares y también por medio de cultivos de
microorganismos en el laboratorio. Al respecto en este estudio
encontramos 9 cepas utilizando el medio caldo marino. Esto indica que
la diversidad de microorganismos cultivables es mucho menor que la
que existe in situ y que esta sesgada por la facilidad de algunas especies
de crecer muy rápidamente en medios de cultivo con cantidades muy
67
elevadas de carbono en comparación con las concentraciones en el
medio natural. Un método alterno al cultivo en placas de agar es
mediante la técnica de microcápsulas conocida como “High Throughput
Cultivation” (Zengler et al., 2002) con la cual células individuales son
encapsuladas en una matriz de agarosa e incubadas en columnas con
medio de cultivo en concentraciones similares a las que se observan en
el ambiente natural. Este método ha sido utilizado para aislar nuevas
especies de bacterias y también para la búsqueda de productos
naturales marinos (Toledo et al., 2006).
V.4 IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS
PRODUCTORES DE PKS
La industria farmacéutica ha buscado nuevas moléculas
recientemente en fuentes marinas debido a que las fuentes terrestres
han sido explotadas extensivamente y en el caso de moléculas pequeñas
una fuente importante son cepas de actinomicetos.
Los actinomicetos marinos en cultivo han resultado ser una fuente
rica de compuestos bioactivos anticancerígenos, antibacterianos y
fungicidas (Mincer et al., 2002). Muchas de las moléculas bioactivas son
codificadas por operones PKS y por lo tanto la búsqueda y
68
descubrimiento de estos en muestras metagenomicas puede abrir la
puerta para la explotación recombinante (Schirmer et al., 2005).
En este trabajo, no se pudo encontrar ninguna secuencia que
presentara parentesco con el dominio KS de las policetidosintetasas de
tipo I y II en ninguna de las esponjas antes mencionadas.
Se encontró un patrón de bandeo indicando inespecificidad por
parte de los oligonucleótidos utilizados en este trabajo, ya que al
secuenciar las reacciones una vez clonadas, únicamente se obtuvieron
artificios nada específicos. Un problema probable pudo haber sido la
preferencia de los oligonucleótidos para amplificar la región KS dentro
del grupo de los streptomicetos, no identificando ninguna secuencia de
este tipo en este trabajo. De manera alternativa los actinomicetos
marinos no fueron detectados en las muestras de esponjas debido a que
las células de actinomicetos son mas difíciles de extraer el DNA y por lo
tanto no se pudo amplificar el 16S o PKS.
69
VI. RECOMENDACIONES Y ESTUDIOS POSTERIORES
Para estudios posteriores se pueden usar oligonucleótidos
específicos para PKS de proteobacterias y buscar genes de estas en el
DNA metagenomico o en DNA de cepas aisladas.
Recolectar otras esponjas en las que se haya reportado la presencia
de metabolitos secundarios tales como los enlistados en la tabla I.
Investigar a través de inventarios taxonómicos moleculares la
presencia de arqueas y el posible papel que desempeñan y evaluar si se
encuentran involucradas en la producción de metabolitos secundarios de
interés comercial.
70
VII. REFERENCIAS
Allen, E.E., Bartlett, D.H. 2002. Structure and regulation of the omega-3
polyunsaturated fatty acid synthase genes from the deep-sea bacterium
Photobacterium profundum strain SS9. Microbiol. 148: 1903-1913 p.
Aneiros A., Garateix A. 2004. Bioactive peptides from marine sources:
Pharmacological properties and isolation procedures. J of
Chromatography. 803: 41-53 p.
Bejarano Chavarro S., Zea S., Diaz J.M. 2004. Esponjas y otros microhábitats
de oxiuros (Ophiuroidea: Echinodermata) en ambientes arrecifales del
archipiélago de San Bernardo (Caribe Colombiano). Bol. Invest. Mar.
Cost. 33: 29-47 p.
Belarbi E.H., Gómez A.C., Chisti Y., García-Camacho F., Molina-Grima E. 2003.
Producing drugs from marine sponges. Biotechnol. Adv. 21: 585–598 p.
Caballero H., Chevalier P.P., Varona G., Cárdenas A.L., Pastor L., Pérez-
Hernández A., García Y. 2004. Componentes más comunes de la fauna
del arrecife de coral de la costa oriental de bahía de Cochinos, Cuba:
corales, esponjas, gorgonaceos y peces. Rev. Invest. Mar. 25(1): 37-44
p.
Coles S.L., DeFelice R.C., Eldredge G. 2002. Nonindigenous marine species in
Kaneohe bay, Oahu, Hawaii. Bishop Museum Press. USA. 353 pp.
71
Colwell R.R. 2002. Fulfilling the promise of biotechnology. Biotechnol. Adv. 20:
215-228 p.
Cottrell M.T., Kirchman D.L. 2000. Community Composition of Marine
Bacterioplankton Determined by 16S rRNA Gene Clone Libraries and
Fluorescence In Situ Hybridization. Appl. Environ. Microbiol. 66: 5116-
5122 p.
Cottrell M.T., Wood D.N., Yu L., Kirchman D.L. 2000. Selected Chitinase Genes
in Cultured and Uncultured Marine Bacteria in the alpha - and gamma -
Subclasses of the Proteobacteria. Appl. Environ. Microbiol. 66: 1195-
1201 p.
Curtis H. 1985. Biología. Editorial Medica Panamericana. Mexico D.F. 1255 pp.
Dang H., Lovell C.R. 2002. Numerical Dominance and Phylotype Diversity of
Marine Rhodobacter Species during Early Colonization of Submerged
Surfaces in Coastal Marine Waters as Determined by 16S Ribosomal
DNA Sequence Analysis and Fluorescence In Situ Hybridization. Appl.
Environ. Microbiol. 68: 496-504 p.
Davidson S.K., Allen S.W., Lim G.E., Anderson C.M., Haygood M.G. 2001.
Evidence for the biosynthesis of bryostatins by the bacterial symbiont
“Candidatus Endobugula sertula” of the bryozoan Bugula neritina. Appl.
Environ. Microbiol. 67: 4531-4537 p.
DeLong E.F. 1992. Archaea in coastal marine environments. Proc Natl Acad Sci
USA. 89: 5685-5689 p.
72
Erdogan-Orhan I., Sener B., De Rosa S., Perez-Baz J., Lozach O., Leost M.,
Rakhilin S., Meijer L. 2004. Polyprenyl-hydroquinones and-furans from
three marine sponges inhibit the cell cycle regulating phosphatase
CDC25A. Nat. Prod. Research. 18: 1-9 p.
Faulkner J. 2000. Highlights of marine natural products chemistry (1972-1999).
Nat. Prod. Report. 17: 1-6 p.
Ferrer M., Martinez-Abarca F., Golyshin P.N. 2005. Mining genomes and
‘metagenomes’ for novel catalysts. Current Opinion in Biotechnology.
16:1–6 p.
Fieseler L., Horn M., Wagner M., Hentschel U. 2004. Discovery of the novel
candidate phylum “poribacteria” in marine sponges. Appl. Environ.
Microbiol. 70: 3724-3732 p.
Friedrich A.B., Fischer I., Proksch P., Hacker J., Hentschel U. 2001. Temporal
variation of the microbial community associated with the Mediterranean
sponge Aplysina aerophoba. Microbiol. Ecol. 38: 2-3 p.
Frischer M.E., Danforth J.M., Healy M.A., Newton S.F. Michael. 2000. Whole-
Cell versus Total RNA Extraction for Analysis of Microbial Community
Structure with 16S rRNA-Targeted Oligonucleotide Probes in Salt Marsh
Sediments. Appl. Environ. Microbiol. 66: 3037-3043 p.
Ginolhac A., Jarrin C., Gillet B., Robe P., Pujic P., Tuphile K., Bertrand H., Vogel
T.M., Perriere G., Simonet P., Nalin R. 2004. Phylogenetic Analysis of
Polyketide Synthase I Domains from Soil Metagenomic Libraries Allows
73
Selection of Promising Clones. Appl. Environ. Microbiol. 70: 5522-5527
p.
Giovannoni S.J., DeLong E.F., Olsen G.J., Pace N.R. 1988. Phylogenetic group-
specific oligodeoxynucleotide probes for identification of single microbial
cells. J. Bacteriol. 170: 720-726 p.
Gonzalez J.M., Moran M.A. 1997. Numerical dominance of a group of marine
bacteria in the alpha-subclass of the class proteobacteria in coastal
seawater. Appl. Environ. Microbiol. 63: 4237-4242 p.
Haefner B. 2003. Drugs from the deep: marine natural products as drug
candidates. Research focus reviews. 8: 536-544 p.
Harder T., Lau S.C., Tam W.Y., Qian P.Y. 2004. A bacterial culture-independent
method to investigate chemically mediated control of bacterial epibiosis
in marine invertebrates by using TRFLP analysis and natural bacterial
populations. Microbiol. Ecol. 47: 93-99 p.
Heidelberg J.F., O'Neill K.R., Jacobs D., Colwell R.R. 1993. Enumeration of
Vibrio vulnificus on Membrane Filters with a Fluorescently Labeled
Oligonucleotide Probe Specific for Kingdom-Level 16S rRNA Sequences.
Appl. Environ. Microbiol. 59: 3474-3476 p.
Henkel T.P., Pawlik J.R. 2005. Habitat use by sponge-dwelling brittlestars. Mar.
Biol. 146: 301–313 p.
74
Hentschel U., Hopke J., Horn M., Friedrich A. B., Wagner M., Hacker J., Moore
B. S. 2002. Molecular Evidence for a Uniform Microbial Community in
Sponges from Different Oceans. Appl. Environ. Microbiol. 68: 4431-
4440 p.
Kelly S.R., Jensen P.R., Henkel T.P., Fenical W., Pawlik J.R. 2003. Effects of
Caribbean sponge extracts on bacterial attachment. Aquat. Microb. Ecol.
31: 175–182 p.
Lane D.J., Pace B., Olsen G.J., Stahl D.A., Sogin M.L., Pace N.R. 1985. Rapid
Determination of 16S Ribosomal RNA Sequences for Phylogenetic
Analyses PNAS 82: 6955-6959 p.
Lane D.J. 1991. 16S, 23S rRNA sequencing. En: Stackebrandt E., Goodfellow
M. (eds). Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. John Wiley
and Sons, New York. 115-175 p.
Mandigan M.T., Martinko J.M., Parker J. 1999. BROCK: Biología de los
Microorganismos. Octava Edición. Prentice Hall. Madrid. 1064 pp.
Mincer T.J., Jensen P.R., Kauffman C.A., Fenical W. 2002.Widespread and
Persistent Populations of a Major New Marine Actinomycete Taxon in
Ocean Sediments Appl. Environ. Microbiol. 68: 5005–5011 p.
Monks N.R., Lerner C., Henriques A.T., Farias F.M., Schapoval E.E., Suyenaga
E.S., Rocha A.B., Schartsmann G., Mothes B. 2002. Anticancer,
antichemostatic and antimicrobial activities of marine sponges collected
75
off the coast of Santa Catarina, southern Brazil. J of Exp. Mar. Biol. and
Ecol. 281: 1-12 p.
Müller W.E., Grebenjuk V.A., Le Pennec G., Schroeder H.C., Brummer F.,
Hentschel U., Müller I.M., Breter H.J. 2004. Sustainable production of
bioactive compounds by sponges-cell culture and gene cluster approach:
A Review. Mar. Biotechnol. 6: 105-117 p.
Müller W.E., Brummer F., Batel R., Müller I.M., Schroder H.C. 2003. Molecular
biodiversity. Case study: Porifera (sponges). Naturwissenschaften. 90:
103-120 p.
Munro M.H., Blunt J.W., Dumdei E.J., Hickford S.J., Lill R.E., Li S., Battershill
C.N., Duckworth A.R. 1999. The discovery and development of marine
compounds with pharmaceutical potential. J of Biotech. 70: 15-25 p.
Muyzer G., de Waal E.C., Uitterlinden A.G. 1993. Profiling of complex microbial
populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of
polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl.
Environ. Microbiol. 59: 695-700 p.
Pace N.R., 1997. A molecular view of microbial diversity and the biosphere.
Science. 276: 734-740 p.
Pinhassi J., Zweifel U.L., Hagstrom A. 1997. Dominant marine bacterioplankton
species found among colony-forming bacteria. Appl. Environ. Microbiol.
63: 3359-3366 p.
76
Proksch P., Edrada R.A., Ebel R. 2002. Drugs from the seas- current status and
microbiological implications. Microbiology Biotechnology. 59: 125-134 p.
Qureshi A., Stevenson C.S., Albert C.L., Jacobs R.S., Faulkner J. 1999. Homo-
and Nor-Plakotenin, new carboxylic acids from the Palauan sponge
Plakortis lita. Journal of Natural Products. 62: 1205-1207 p.
Qureshi A., Colin P.L., Faulkner J. 2000. Microsclerodermins F-I, antitumor and
antifungal cyclic peptides from the lithistid sponge Microscleroderma sp.
Tetrahedron. 56: 3679-3685 p.
Ramm W., Schatton W., Wagner-Dobler I., Wray V., Nimtz M., Tokuda H.,
Enjyo F., Nishino H., Beil W., Heckmann R., Lang S. 2004. Diglucosyl-
glycerolipids from the marine sponge-associated Bacillus pumilus strain
AAS3: their production, enzymatic modification and properties. Appl.
Environ. Microbiol. 64: 497-504 p.
Santavy D.L., Willenz P., Colwell R.R. 1990. Phenotypic study of bacteria
associated with the Caribbean sclerosponge, Ceratoporella nicholsoni.
Appl. Environ. Microbiol. 56: 1750-1762 p.
Schirmer A., Gadkari R., Reeves C.D., Ibrahim F., DeLong E.F., and
Hutchinson C.R. 2005. Metagenomic Analysis Reveals Diverse Polyketide
Synthase Gene Clusters in Microorganisms Associated with the Marine
Sponge Discodermia dissolute. Appl. Environ. Microbiol. 71: 4840-4849
p.
77
Seow K.T., Meurer G., Gerlitz M., Wendt-Pienkowski E., Hutchinson R., Davies
J. 1997. A Study of Iterative Type II Polyketide Synthases, Using
Bacterial Genes Cloned from Soil DNA: a Means To Access and Use
Genes from Uncultured Microorganisms. J of Bacteriol. 179: 7360-7368
p.
Sera Y., Adachi K., Fujii K., Shizuri Y. 2002. Isolation of Haliclonamides: new
peptides as antifuling substances from a marine sponge species,
Haliclona. Mar. Biotech. 3: 441-446 p.
Suzuki M.T., Rappé M.S., Haimberger Z.W., Winfield H., Adair N., Strobel J.,
Giovannoni S.J. 1997. Bacterial diversity among small-subunit rRNA
gene clones and cellular isolates from the same seawater sample. Appl.
Environ. Microbiol. 63: 983-989 p.
Takamatsu S., Hodges T.W., Rajbhandari I., Gerwick W.H., Hamann M.T.,
Nagle D.G. 2003. Marine natural products as novel antioxidant
prototypes. J of Nat. Prod. 66: 605-8 p.
Taylor M.W., Schupp P.J., Dahllof I., Kjelleberg S., Steinberg P.D. 2004. Host
specificity in marine sponge-associated bacteria, and potential
implications for marine microbial diversity. Environ. Microbiol.. 6: 121-
30 p.
Teske A., Hinrichs K., Edgcomb V., de Vera Gomez A., Kysela D., Sylva Sogin,
S.P., Mitchell L., Jannasch, Holger W. 2002. Microbial Diversity of
Hydrothermal Sediments in the Guaymas Basin: Evidence for Anaerobic
78
Methanotrophic Communities. Appl. Environ. Microbiol. 68: 1994-2007
p.
Thakur N.L., Anil A.C. 2000. Antibacterial activity of the sponge Iricnia ramosa:
Importance of its surface- associated bacteria. J of Chem. Ecol. 26: 57-
72 p.
Toledo G., Green W., González R.A., Christoffersen L., Podar M., Chang H.W.,
Hemscheidt T., Trapido-Rosenthal H., Short J.M., Bidigare R.R., Mathur
E.J. 2006. High Throughput Cultivation for Isolation of Novel Marine
Microorganisms. Oceanography. 19: 100-105 p.
Tziveleka L.A., Vagias C., Roussis V. 2003. Natural products with anti-HIV
activity from marine organisms. Curr. Top Med Chem. 3: 1512-35 p.
Wagner-Dobler I., Beil W., Lang S., Meiners M., Laatsch H. 2002. Integrated
approach to explore the potential of marine microorganisms for the
production of bioactive metabolites. Adv. in Biochem.
Engineering/Biotechnology. 74: 209-238 p.
Webster N.S., Negri A.P., Munro M.M., Battershill C.N. 2004. Diverse microbial
communities inhabit Antarctic sponges. Environ. Microbiol. 6: 288-300
p.
Webster N.S., Wilson K.J., Blackall L.L., Hill R.T. 2001. Phylogenetic diversity of
bacteria associated with the marine sponge Rhopaloeides odorabile.
Appl. Environ. Microbiol. 67: 434-444 p.
79
Xiang L., Ling Q. 2005. Metagenomics-based drug discovery and marine
microbial diversity. TRENDS in Biotech. 23: 539-543 p.
Xue S., Zhang H.T., Wu P.C., Zhang W., Yuan Q. 2004. Study on bioactivity of
extracts from marine sponges in Chinese Sea. J of Exp. Mar. Biol. and
Ecol. 298: 71-78 p.
Zengler K., Toledo G., Rappé M., Elkins J., Mathur E.J., Short J.M, Keller M.
2002. Cultivating the uncultured. PNAS. 99: 15681–15686 p.
www.calbiomarine.com (Agosto/2005)
http://www.eastbayexpress.com/issues/2005-09-07/news/feature.html
(Diciembre/2005).
Related Documents
