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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL Unidad Profesional
Interdisciplinaria de Ingeniera Campus Guanajuato
INGENIERA FARMACUTICA
Ingeniera en fermentaciones
Proyecto
Produccin de cerveza artesanal tipo Pale Ale
PRESENTA:
Equipo de fermentaciones:
Arriaga Moreno Janai
Ortiz Hernndez Vctor Hugo
Roco Alcntar Alma Itzel
Snchez Felipe Cynthia Guadalupe
Equipo de biorreactores:
Araujo Acosta Anabella
Escalera Martnez Erika Karina
Lpez Alfaro Eduardo
Aceves Mata Mara Carolina
Ramrez Laguna Patricia
Barrientos Garca Enrique
Granados Jos Guadalupe
Equipo #1
6FM1
Profesor (a):
Diana Ramrez Saenz
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PRODUCCIN DE CERVEZA ARTESANAL TIPO PALE ALE
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Arriaga, Ortiz, Roco y Snchez
INTRODUCCIN
AISLAMIENTO DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Los responsables de la fermentacin sumergida para la produccin
de cerveza tipo Pale
Ale, no son bacterias sino levaduras, los cuales son hongos
unicelulares que pertenecen a
los eucariotas. (Koolman, 2004)
Saccharomyces cerevisiae
Las levaduras de la cerveza (Saccharomyces Cerevisiae) son
organismos haploides y estos
se reproducen asexualmente por gemacin. Este tipo de levaduras
logran existir en
condiciones aerobias y anaerobias. (Koolman, 2004).
La cerveza tiene como subproducto levaduras las cuales utiliza
como medios para la
fermentacin de la cebada, malta u otros cereales. As mismo
consumen los azcares y los
convierten en alcohol y anhdrido carbnico (CO2). (Hough,
1990).
Entre los usos ms habituales de esta levadura, es la produccin
de cerveza, pan y vino. El
dixido de carbono (CO2) y etanol (C2H6O) producidos durante el
proceso de fermentacin,
son productos de desecho para las clulas de la levadura. Este
mtodo se efecta cuando la
levadura se encuentra en un medio muy rico en azcares. (Tortora,
2007)
Aislamiento de Saccharomyces Cerevisiae
Una de las formas ms importantes para la caracterizacin de
microorganismos es observar
su crecimiento a en medios de cultivo como Agar Papa Dextrosa
(PDA) til para cultivar
levaduras ya que la base del medio es altamente nutritiva y
permite la esporulacin y la
produccin de pigmentos en algunos dermatofitos, algunos
procedimientos sealan bajar el
pH del medio a 3.5 con cido tartrico al 10% para inhibir el
crecimiento bacteriano; la
infusin de papa promueve un crecimiento abundante de los hongos
y levaduras y el agar es
adicionado como agente solidificante.
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En la microbiologa, un medio de cultivo es un elemento bsico e
indispensable en cuanto
al estudio (aislamiento e identificacin) de los microorganismos
se refiere, ya que un
cultivo es un gel o sustancia que proporciona todo nutrimento
esencial necesario para el
desarrollo del mismo (Rodrguez et al., 2005).
Requerimientos nutricionales para el crecimiento de S.
Cerevisiae (Cceres, 2002):
Fuente de carbono:
Los azucares son de vital importancia, ya que son considerados
la fuente de carbono y
energa, por lo cual la clula fermentara la sacarosa, galactosa,
manosa y en general
hexosas. Aunque esta, no fermenta la lactosa, maltosa y
pentosa
Fuente de nitrgeno:
Tales como sales de amonio inorgnicas, el acetato de amonio,
carbonato, etc.
Fuente de fsforo:
Normalmente se utiliza en H2PO4
Fuente de azufre
Sales y elementos traza
Pruebas bioqumicas para Saccharomyces cerevisiae
Las pruebas bioqumicas se utilizan con frecuencia para
identificar bacterias y levaduras
(Tortora, 2007). Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el
microorganismo es capaz
de fermentar azcares, la presencia de enzimas, la degradacin de
compuestos, la
produccin de compuestos coloreados, etc. (Edwards, et al,
1986)
Las pruebas son:
Fermentacin de carbohidratos: Esta prueba nos indica la
presencia de levaduras al
obtener un cambio de color en una solucin de rojo fenol. Ya que
se puede observar un
cambio de pH, este debido a la fermentacin de los azcares que
llevan a cabo las
levaduras.
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Prueba de ureasa: Esta prueba es utilizada para detectar la
presencia de la enzima
ureasa, mostrando as el medio un cambio de color de rojo a rosa
fucsia indicando como tal
la liberacin de amoniaco y dixido de carbono al hidrolizar la
urea (Edwards, et al., 1986).
Pruebas macroscpicas y microscpicas de identificacin de
Sacharomyces cerevisiae
Para poder identificar un microorganismo (en este caso una
levadura) es importante tomar
en cuenta las caractersticas clave de la morfologa colonial
(figura 1) para ello se utiliza
frecuentemente criterios que caracterizan el crecimiento como
tamao, pigmentacin,
forma y aspecto de la colonia.
El aislamiento de las colonias al cultivar es importante ya que
con ello se puede examinar la
morfologa y realizar un frotis que junto con la evaluacin
microscpica de los cultivos y la
morfologa de la colonia son lo ms importante para la
identificacin del microorganismo.
(Prescott, 1999). Para caracterizar la morfologa celular de
microorganismos se debe
analizar el tamao celular, forma celular y distribucin de las
clulas unas con respecto a
otras. Tambin puede observarse la movilidad de los
microorganismos bajo microscopio
con condiciones de preparacin hmeda o por inoculacin en medios
semislidos. (Tortora
et al., 2007)
Antecedentes de aislamiento de Saccharomyces Cerevisiae para la
produccin de cerveza
Paz y Pellegrini (2003) aislaron diferentes tipos de levadura
principalmente Saccharomyces
uvarum con el propsito de observar los efectos de incorporar a
la dieta de equinos
levadura de cerveza, comparando sus efectos sobre el estallido
respiratorio de neutrfilos
sanguneos.
Legras y colaboradores (2007), aislaron Saccharomyces cerevisiae
para demostrar la
importancia de estas bacterias en la fermentacin de algunos
alimentos que juegan un rol
importante en la sociedad, evaluando la evolucin de los procesos
de produccin y su
adaptacin que va desde la domesticacin local a la industria.
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Khle y Jesperen, as como otros colaboradores (2001)
caracterizaron y aislaron levaduras
provenientes de cerveza de sorgo producida en Ghana y Burkina
Faso en frica Occidental.
Las levaduras involucradas en la fermentacin que fueron
encontradas consisten en
Saccharomyces spp, de los cuales los cultivos aislados
investigados, el 45% fueron
identificados como Saccharomyces cerevisiae y un poco ms del 53%
tenan propiedades
fisiolgicas atpicas de S. cerevisiae o cualquier otro miembro
del complejo strictu sensu,
ya que fueron capaces de asimilar solo glucosa, maltosa y etanol
como fuentes de carbono.
Cocolin, Campolongo, Gorra, Rolle y Ratsion (2012) a travs de un
estudio investigaron la
biodiversidad de Saccharomyces cerevisiae durante la elaboracin
de la cerveza de una
cerveza artesanal, as como su estudio durante su almacenamiento
en la botella durante 107
das a 20C. Despus de la inoculacin con una levadura seca activa,
los recuentos de
levadura fueron seguidos durante la fermentacin, as como despus
del embotellado. Las
cargas de levadura se mantuvieron estables en las unidades
formadoras de colonia. Casi
todas las levaduras aisladas fueron identificadas como
Saccharomyces cerevisiae.
PRODUCCIN DE CERVEZA
Un ejemplo de biotecnologa tradicional es el proceso
rudimentario de cerveza, cerveza
artesanal, ya que puede presentar variaciones en su elaboracin
que dependern del tipo
especfico de cerveza (claro, obscura, etc.) Para la fabricacin
de la cerveza bsicamente
existen cuatro etapas: 1) proceso de germinacin de las semillas
del cereal (Malteado); 2) la
extraccin e hidrlisis de componente de la cebada seguido del
hervido con la adicin de
lpulo (Mosto); 3) fermentacin y 4) procesamiento final,
involucra las etapas de filtracin,
estabilizacin y embotellado.
De las etapas antes mencionadas la fermentacin es el proceso ms
lento, donde las clulas
de levadura aisladas son cultivadas en suspensin que fermentarn
el mosto en reactores
por lote, sin agitacin externa.
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La cerveza, por definicin, es una bebida alcohlica no destilada
que se obtiene de la
fermentacin de un mosto elaborado a partir de malta de cebada,
con o sin la adicin de
otros cereales no malteados. La mezcla de los cereales con agua
se transforma en azcares
mediante la digestin enzimtica de las levaduras. Posteriormente
el lpulo y/o sus
derivados son agregados a la mezcla agua-mosto para finalmente
ser sometida a un proceso
de coccin.
Existen dos tipos bsico de cerveza: ale y lager; cada uno con
subtipos con diferentes
caractersticas en cuanto a sus propiedades organolpticas.
Ingredientes de la cerveza.
Para la elaboracin de cerveza se requiere de las siguientes
materias primas:
Agua; materia prima de mayor proporcin, potable, que a una
escala industrial debe
seguir la NOM-142-SSA1-1995.
Malta; es un cereal en etapa temprana de germinacin, cuyo
proceso de germinacin
es controlado y detenido mediante la aplicacin de secado. Esta
materia prima
contiene las enzimas necesarias para hidrolizar los hidratos de
carbono complejos,
paso importante para la obtencin de mosto.
Lpulo; se obtiene a partir de los conos maduros de la planta
Humulus lupulus y se
agrega al mosto como extracto o productos secados en dosis que
varan en funcin
del sabor y aroma final deseados para la cerveza.
Un proceso general para la fabricacin de cerveza comprende las
siguientes cuatro etapas
principales:
1. Preparacin de la malta. Tiene por objetivo la obtencin de un
polvo rico en
enzimas. Para hacer esto, el grano de cebada tiene que ser
puesto a germinar a una
temperatura de 10-16C, con una humedad de 42-46% en un tiempo de
60 horas.
2. Produccin del mosto. La malta ya molida se mezcla con agua,
esta mezcla se
calienta gradualmente hasta una temperatura de 48C por
aproximadamente 20
minutos, en la que se activan principalmente las proteasas, las
beta-glucanasas y la
beta-amilasa. Se contina el calentamiento progresivo por etapas.
La solucin se
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filtra y al lquido obtenido se le aade el lpulo. Finalmente la
solucin se somete a
ebullicin pro una hora para obtener el mosto. Las proteasas
hidrolizan las protenas
de la malta, dando como resultado la formacin de pptidos y
aminocidos, que ms
adelante, durante la fermentacin servirn como nutrientes para la
levadura. Al
llevarse a cabo la coccin del mosto se cubren 7 objetivos
tecnolgicos:
concentracin de slidos en el mosto, extraccin de los componentes
del lpulo,
inactivacin de las enzimas de la malta, esterilizacin del mosto,
eliminacin de
compuestos voltiles indeseables, formacin de los compuestos
responsables del
aroma, sabor y color de la cerveza mediante reacciones de
Maillard, coagulacin de
protenas y favorecimiento de la reaccin entre protenas para la
formacin de
compuestos insolubles que precipitan clarificando as el
producto.
3. Fermentacin. Se aplica una fermentacin alta para la
elaboracin de cerveza tipo
ale, en la cual las levaduras forman un aglomerado que flota en
el lquido o
pueden flocular a inicios de la fermentacin y hundirse en el
lquido. En esta etapa
el mosto es sometido a temperaturas que van desde 15 a 22 C para
cervezas ale,
donde se metabolizan los carbohidratos del mosto para generacin
de etanol y CO2,
ver Figura 2.
4. Procesamiento final. Una vez concluida la maduracin, la
cerveza es clarificada,
envasada y pasteurizada para su embotellamiento y
distribucin.
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Figura 2 Seguimiento de reacciones para obtener etanol a partir
de glucosa.
Antecedentes de produccin de cerveza.
Garca, Snchez, Vidal y Vijande (2004) exponen en su artculo la
cerveza artesanal, cmo
hacer cerveza en casa una cronologa histrica de produccin de
cerveza, as como a partir
de procesos sencillos presentan la forma de elaborar cerveza en
casa, cumpliendo las cuatro
etapas fundamentales, malta, mosto, fermentacin y filtrado.
Pablo Placente (2001) en su artculo en lnea publicado en
ingenieraquimica.org, describe
paso a paso la elaboracin de cerveza de forma casera, sin la
adicin de algn lpulo en el
proceso.
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Anabel Snchez (2011) en su tesis fermentacin de malta empleando
un sistema
semicontinuo en el proceso de elaboracin de cerveza establece de
forma clara la
obtencin de una mayor productividad volumtrica de mosto
fermentado a partir de malta
de cebada mediante el uso de un sistema semicontinuo, en
comparacin con un sistema por
lote.
Martnez e Insuasti (2010) elaboraron cerveza artesanal
utilizando cebada y yuca, as como
la aplicacin de las pruebas fisicoqumicas de la estabilidad como
pH, acidez, densidad y
C02 estableciendo los niveles de azcar para la elaboracin de la
cerveza artesanal y la
cantidad de lpulo requerido para la elaboracin de cerveza.
Los lpulos utilizados para la elaboracin de nuestra cerveza
JINICH fueron Nugget
13.2%, Chinook 11.8% y Cascade 7%.
Lpulo Nugget. Es una de las variedades de lpulo ms populares
para la elaboracin de
cerveza; contiene excelente amargor, con un fuerte aroma herbla
y a maderas. Es un poco
picante, aroma a pino, resina muy fuerte y herbal, pero esto se
ve eclipsado por su potencial
de amargor. Es ideal para dar un empuje de amargor en estilos
que lo requieran. Entre sus
propiedades qumicas se encuentran: 11.0-12.5% (peso/peso) de
alfa cidos, 3.5-4.0%
(peso/peso) de beta cidos, un aproximado de 2.0 mL/100g de
aceites esenciales, mirceno
del 54%, este aceite mirceno es en la parte alta, que ayuda a
proporcionar algunos de los
tonos leosos.
Lpulo Chinook:.Es una variedad de amargor con caractersticas de
aroma, con altos cidos
alfa con carcter herbal, que da un gran aroma casi ahumado
cuando es usado como un
lpulo aromtico durante los ltimos minutos del hervido o en dry
hoping, mirceno del 35-
40% del total de aceite. Excelente para estilos Pale Ale.
Lpulo Cascade: Contiene de 6-0 a 8.0% de cidos alfa, 5.0-5.5% de
cidos beta,
1.1mL/100mg del total de aceites.
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JUSTIFICACIN
La produccin de cerveza, hoy por hoy es considerada en todo el
mundo como un tpico
ejemplo de biotecnologa tradicional. Como parte de la materia de
Ingeniera de
Fermentaciones, uno de los procesos clsicos que involucra una
fermentacin es
precisamente la fabricacin de cerveza.
El hecho de realizar nosotros una fermentacin para producir
cerveza con Sacharomycces
cerevisiae integra conocimientos que hemos venido aprendiendo en
nuestra carrera como
Ingenieros Farmacuticos, desde los mtodos microbiolgicos para
tratar con la levadura,
las ruta biosinttica en la fermentacin, los mtodos analticos
para las diferentes
determinaciones de valores como pH, contenido de azcar y
porcentaje de alcohol, as
como la fisicoqumica de una buena cerveza.
Adems, en la elaboracin de la cerveza tendremos oportunidad de
usar el biorreactor tipo
tanque agitado, el cual es usado casi universalmente en la
industria de la fermentacin, y
nuestro inters en saber utilizarlo es muy grande, debido al
numeroso tipo clulas que se
pueden hacer crecer en ese reactor.
Tambin decidimos optar por realizar este proyecto ya que nunca
hemos producido cerveza
y una parte importante de cada materia que cursamos en nuestra
carrera es aprender algo
nuevo. Al inicio del semestre, se nos plante la opcin de hacer
penicilina en lugar de
cerveza pero la penicilina tambin la producimos en la materia de
Biotecnologa
Farmacutica, as que nos pareci ms interesante el hecho de
fabricar nuestra propia
cerveza.
Con este proyecto, queremos trabajar aprendiendo los principios
bsicos de transformacin
de sustrato a un producto especfico como el alcohol y as
aterrizar los conocimientos
tericos a algo tangible as como observar durante el proceso los
puntos crticos de control
que influyen en que se obtenga una buena cerveza.
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OBJETIVOS
Objetivo general:
Conocer, seleccionar y desarrollar una tcnica para la elaboracin
de cerveza artesanal.
Objetivos especficos:
Aislar e identificar la cepa de Saccharomyces Cerevisiae a
partir de una muestra de
cerveza.
Producir cerveza tipo Pale Ale, haciendo uso del mtodo dry
hoping, en un
biorreactor tipo tanque agitado.
Modificar la formulacin de la cerveza tipo Pale Ale mejorando
sus
caractersticas organolpticas.
MATERIALES Y MTODOS
Los siguientes materiales y metodologa se llevaron a cabo
basndonos en el Manual de
prcticas de microbiologa (2013), adems se desglosan los
materiales, reactivos, equipo y
metodologa empleada por objetivo establecido.
Aislamiento e identificacin de la cepa de Saccharomyces
Cerevisiae a partir de una
muestra de cerveza.
Tabla de materiales, equipos y reactivos empleados.
Material
Cajas Petri desechables Puntas para micropipeta
estriles
Vaso de precipitado (500
mL)
Varilla de vidrio Micropipeta 20-200 m Micropipeta 100-1000
m
Matraz Erlenmeyer (250mL) Porta objetos Asa de nicromo
Mechero Bunsen Cubre objetos Atomizador
Equipo
Autoclave Incubadora Campana de flujo laminar
Microscopio de campo claro Balanza analtica
Reactivos
Agar Papa Dextrosa Agua destilada Muestra de cerveza
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Metodologa (Diagrama de flujo)
Preparacin del medio de cultivo Papa Dextrosa (PDA).
Mtodo de extensin en placa
La muestra se pipetea
sobre la superficie de
la placa de agar (0,1
ml o menos).
La muestra se distribuye
uniformemente sobre la
superficie de agar
usando esparcidor de
vidrio estril.
Incubacin a 37C por 48
horas.
Resultados de propagacin de
placa
Colonias superficiales
Matraz de 250 mL
+ 100 mL de agua y
3.4 de PDA
Calentar con
agitacin suave
hasta su completa
disolucin y hervir
1 min.
Esterilizar en autoclave a
121 C (15 lb de presin)
durante 15 min. Enfriar a
45-50 C.
Vaciar en 4 cajas petri
y esperar a que
solidifique, rodeadas
por 3 mecheros bunsen
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Prueba microscpica para identificar la levadura. Se empleara
frotis en fresco
debido a que permite observar morfologa microscpica de la
levadura en rea
asptica.
Pruebas bioqumicas para identificar levaduras
2. Fermentacin de carbohidratos
Inocular cada cepa en
una serie de tubos de
caldo rojo fenol.
Incubar los tubos a
37C durante 48 horas.
Hacer observaciones a
las 24 y 48 horas de
incubacin.
Determinar si ha crecimiento,
cambios en el color del indicador.
Prueba positiva (+) color amarillo
Prueba negativa (-) color rojo
Depositar muestra de
levadura en
potaobjetos con el asa
de nicromo
previamente
esterilizada.
Agregar 2 gotas de
agua destilada a la
muestra en el
portaobjetos.
Colocar un cubreobjetos
sobre este y llevar la
muestra al microscopio.
Observar la levadura al
microscopio con el
objetivo 40X.
Determinar morfologa de
la levadura.
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2. Prueba de Ureasa
Morfologa colonial.
Caractersticas de Morfologa Colonial (Prescott, 1999).
Tamao de la colonia que comnmente se calcula en milmetros o
tambin puede
ser descrito por medio de trminos relativos como una cabeza de
alfiler, pequea,
mediana, grande.
Tambin es importante tomar en cuenta la pigmentacin de la
colonia.
La forma de la colonia donde se destaca las caractersticas
morfolgicas de la
colonia que incluye la forma, la elevacin y los bordes de la
colonia.
El aspecto de la superficie de la colonia tambin puede
identificarse con
caractersticas como si es brillante, opaca, mate,
transparente.
Inocular desde la caja
Petri con el asa de
nicromo la cepa en
tubos con caldo de
urea.
Incubar los tubos a
37C durante 48 horas.
Hacer observaciones a las
24 y 48 horas de incubacin.
Prueba positiva (+) rojo
cereza
Prueba negativa (-) rosa
Observar la caja Petri
a travs de una lente.
Evaluar las
caractersticas de
morfologa colonial a
partir de la Figura 1.
Anotar observaciones
(resultados) encontrados.
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Figura 1. Caractersticas morfolgicas de una colonia en general
(Prescott, 1999).
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Produccin de cerveza tipo Pale Ale, haciendo uso del mtodo dry
hoping, en un
biorreactor tipo tanque agitado.
Tabla de materiales, equipos y reactivos empleados.
Material
Vaso de precipitado (1L) Puntas para micropipeta
estriles
Vaso de precipitado (500
mL)
Matraz Erlenmeyer (6L) Micropipeta 20-200 m Micropipeta 100-1000
m
Matraz Erlenmeyer (250mL) Colador Cuchara de acero
inoxidable
Mechero Bunsen Olla (5L) Atomizador
Manta de cielo Franela Tubos Falcon
Vaporera (10L) Botellas de vidrio (250mL) Pinzas para matraz
Torundas de algodn Tubos de 1.5mL Tiras reactivas
Cofia Guantes de ltex Mangueras
Papel aluminio Cinta masking tape
Equipo
Autoclave Incubadora Cmara de Neubauer
Microscopio Balanza analtica Centrfuga de discos
Centrfuga Refractmetro Refrigerador
Campana de flujo laminar Bomba peristltica Biorreactor tipo
tanque
agitado ez-control
Reactivos
Agua destilada Lpulo Nugget 13.2% Lpulo CHINOOK 11.8%
Lpulo Cascade 7% Gas de CO2 1.72 Kg de malta de cebada
Agua Alcohol al 70% Alcohol al 96%
NaOH al 0.05N Muestra de S. Cerevisiae
Metodologa (Diagrama de flujo)
Preparacin de la malta
Cebada
Remojo
Germinaci
n
Trituracin
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Se colocaron 4 L del mosto en
Biorreactor tipo tanque agitado
durante 3 das.
Se tomaron 7 muestras de 1 mL a
diferentes horas del da (esto en
un lapso de 3 das en biorreactor)
para realizar las pruebas de
sustrato y biomasa.
Preparacin del mosto
Malta
Maceracin
Filtracin
Coccin
Adicin de lpulo
nugget 13.2%
durante coccin
30 min 50%
45 min 25%
55 min 35%
Filtracin
Fermentacin Mosto
Inoculacin de
levadura
Maduracin
Fermentacin
primaria Toma de muestra
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Modificacin de la formulacin de la cerveza tipo Pale Ale para
mejorar sus
caractersticas organolpticas
Tabla de materiales, equipos y reactivos empleados.
Material
Vaso de precipitado (1L) Puntas para micropipeta
estriles
Vaso de precipitado (500
mL)
Matraz Erlenmeyer (6L) Micropipeta 20-200 m Micropipeta 100-1000
m
Matraz Erlenmeyer (250mL) Colador Cuchara de acero
inoxidable
Mechero Bunsen Olla (5L) Atomizador
Manta de cielo Franela Tubos Falcon
Vaporera (10L) Botellas de vidrio (250mL) Pinzas para matraz
Torundas de algodn Tubos de 1.5mL Tiras reactivas
Cofia Guantes de ltex Mangueras
Papel aluminio Cinta masking tape
Equipo
Autoclave Incubadora Cmara de Neubauer
Microscopio Balanza analtica Centrfuga de discos
Centrfuga Refractmetro Refrigerador
Campana de flujo laminar Bomba peristltica Biorreactor tipo
tanque
agitado ez-control
Reactivos
Agua destilada Lpulo Nugget 13.2% Lpulo CHINOOK 11.8%
Lpulo Cascade 7% Gas de CO2 1.72 Kg de malta de cebada
Agua Alcohol al 70% Alcohol al 96%
NaOH al 0.05N Muestra de S. Cerevisiae
Metodologa (Diagrama de flujo)
Procesamiento
Cerveza
madurada
Gasificado
Clarificacin
Envasado
Cerveza
La clarificacin se llev a cabo
en la centrifuga de discos, el
envasado se coloc en botellas
de 255 mL. Se gasific durante 5
min a un flujo de burbujeo
regular. Se tap con corcho y se
sello con parafina, esto para
evitar la perdida del CO2 y por
ltimo se refriger. (Snchez et
a.l,2011)
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Es similar al proceso empleado en el partado Produccin de
cerveza tipo Pale Ale,
haciendo uso del mtodo dry hoping, en un biorreactor tipo tanque
agitado, sin embargo la
diferencia es el cambio en la concentracin de los reactivos
(lpulos).
Centrifuga de discos (Usada para la clarificacin de la
cerveza)
Diagrama de funcionamiento:
(Hojas Tcnica Uso y especificaciones. Alfa Laval Industries)
1. En un principio esta se debe de llenar
con el agente a centrifugar, en un
flujo constante de suspensin.
2. Pero esta permanece girando
desde que entre el flujo.
3. Una vez que el volumen es
totalmente ocupado, comienza
a formarse la torta.
4. Ya que est formada se abre una
pequea compuerta alrededor de de
la centrifuga, esto a travs de un
sistema de aire comprimido y es
programado para abrirse cada
determinado tiempo.
5. El lquido clarificado sale por la
parte superior y usualmente este se
recircula para asegurar la separacin
de los slidos.
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RESULTADOS Y DISCUSIN
Aislamiento e identificacin de la cepa de Saccharomyces
Cerevisiae a partir de una
muestra de cerveza.
Aislacin e identificacin mediante pruebas bioqumicas de la
levadura Sacharomycces
Cerevisiae de una muestra de cerveza obtenida en el laboratorio
de Ingeniera de
Fermentaciones de UPIIG.
Para llevar a cabo el aislamiento e identificacin de S.
Cerevisiae se utiliz una muestra de
cerveza proporcionada en el laboratorio de Ingeniera de
Fermentaciones de UPIIG que se
saba con anterioridad que contena la levadura de inters.
Para aislar la levadura, se decidi realizar la tcnica de
extensin en placa debido a que es
un mtodo viable y comnmente usado para diversos grupos
microbianos de importancia
en alimentos. Esta tcnica no pretende detectar a todos los
microorganismos presentes,
pero el medio de cultivo, las condiciones de temperatura y la
presencia de oxgeno,
permiten seleccionar grupos de levaduras o bacterias cuya
presencia es importante en
diferentes alimentos; por ejemplo en el pan, la cerveza, el
queso, el vino, etc. (Prescott,
1999).
Como lo que se pretende en el proyecto es aislar la levadura de
una muestra de cerveza, el
mtodo de extensin en placa permite que al extender la muestra
sobre la placa se haga
posible el adelgazamiento de la muestra de tal manera que en la
superficie del agar quedan
las bacterias separadas unas de otras permitiendo que se aslen
con mayor facilidad adems
de ser un mtodo ms rpido en comparacin con el vaciado en placa,
ms sencillo que la
tcnica de diluciones en serie o la de estra cruzada debido a que
si no se tiene el suficiente
cuidado y buen manejo de la tcnica, la estra cruzada puede salir
mal y no lograr el total
aislamiento de la levadura. (Prescott, 1999)
El aislamiento de las colonias al cultivar es importante ya que
con ello se puede examinar la
morfologa y realizar un frotis que junto con la evaluacin
microscpica de los cultivos y la
morfologa de la colonia son lo ms importante para la
identificacin del microorganismo.
(Prescott, 1999)
Para caracterizar la morfologa celular de microorganismos de
debe analizar el tamao
celular, forma celular y distribucin de las clulas unas con
respecto a otras. Tambin
puede observarse la movilidad de los microorganismos bajo
microscopio con condiciones
de preparacin hmeda o por inoculacin en medios semislidos.
(Tortora et al., 2007)
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Para la observacin de la morfologa colonial, se tomaron fotos a
simple vista y se
describieron algunas caractersticas observadas (Tabla 1), se
observaron las cajas Petri
proporcionadas en el microscopio, se identificaron las colonias
y se describi la morfologa
observada (Tabla 1). Adems se realiz un frotis para su
observacin en el microscopio de
campo claro bajo el objetivo de 40 X (Figura 4).
Resultados de la morfologa celular.
Como se puede observar en la figura 4 el cultivo de la levadura
no est axnico, es decir, no
se logr aislar S. Cerevisae con la tcnica de extensin en placa,
en la figura se ven dos
tipos de morfologa celular, se ven unas clulas ms grandes que
otras, unas son circulares
y otras tiene forma ovalada. Esto quiere decir que en realidad,
obtuvimos dos tipos de
levadura, no slo una. Podramos argumentar tambin que el medio
pudo haberse
contaminado, pero no ocurri esto ya que realizamos un stock en
el procedimiento e incluso
en un inicio se dejaron las cajas de Petri con el PDA sin el
inculo en la incubadora durante
24 horas para verificar que no se contaminara el medio o que el
pH cambiara. Uno de los
puntos crticos de control en el procedimiento llevado a cabo
para aislar la levadura de
inters fue que la muestra de cerveza que se nos proporcion no
estaba estril, por lo tanto
pudo contener microorganismos que afectaron la aislacin de la
levadura.
La morfologa colonial de S. Cerevisiae segn el Atlas consultado
(Koneman et al., 2006)
se puede observar en la figura 4 y la morfologa colonial
obtenida se muestra en la figura 5.
Figura 4. S. Cerevisae. La forma celular es ovalada y circular,
se observan distintos tamaos.
Clula ms grande.
Forma ovalada
Clula ms pequea.
Forma circular
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Figura 4. Morfologa colonial tpica
de S. cerevisiae obtenida con la tcnica
de extensin en placa.
Adems la posible cepa de levadura que pudo haberse obtenido pudo
ser Saccharomyces
carlsbergensis debido a sus caractersticas morfolgicas y
coloniales que la hacen tener
similitud con las que observamos en nuestra caja. Su morfologa
es circular (no ovalada
como la de S. cerevisiae) y presenta un anillo caf alrededor y
el centro ligeramente oscuro.
En la figura 6 podemos observar la morfologa de S.
carlsbergensis bajo el microscopio de
campo claro bajo 1000X.
La levadura Saccharomyces carlsbergensis hoy en da se emplea
esta levadura en la
investigacin de ciertos procesos de la gluclisis. Este tipo de
levadura es diferente en
muchos aspectos de la S. cerevisiae; no esporulan fcilmente y un
bajo porcentaje de las
esporas son viables. Adems, S. carlsbergensis parece crecer a
una temperatura ms baja en
comparacin con la que crece S. cerevisiae. S. carlsbergensis es
polipoide, contiene partes
de al menos dos genomas divergentes. (Kerridge, 1958).
Figura 5. Morfologa colonial de
S. cerevisiae obtenida de la
muestra de cerveza con la tcnica
de extensin en placa.
Figura 6. Morfologa celular tpica de
Saccharomyces carlsbergensi bajo 1000X
-
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Despus de la observacin en el microscopio y tomando en cuenta
que el cultivo no result
ser axnico, se procedi a realizar la tcnica de estra cruzada en
medio PDA, de tal manera
que se tom una muestra de las colonias que se vean ms grandes en
la caja de cultivo
(figura 5) ya que de acuerdo al Atlas consultado esas colonias
son tpicas de Sacharomyces
cerevisiae y se llev a cabo la tcnica de estra cruzada en placa
la cual consiste en girar la
placa al ir rayando sobre el agar hasta formar un pentgono con
el fin de que el inculo se
vaya diluyendo, al final de la siembra las levaduras deben
quedar bien separadas unas de
otras para aislar la levadura nuevamente y lograr obtener slo S.
cerevisiae. Posteriormente
se dej incubar por 48 horas a 37C, el resultado obtenido se
muestra en la figura 7.
Figura 7. S. cerevisiae aislada con la tcnica de estra
cruzada
Adems se observ su morfologa en el microscopio de campo claro
(figura 8) para
identificar que efectivamente era S. cerevisiae y present una
morfologa ovoide
caracterstica de ese tipo de levadura y ahora todas las clulas
que se vean eran ovoides y
presentaban las mismas caractersticas en el anillo y en el
centro por lo tanto el cultivo ya
es axnico.
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Figura 8. Morfologa de S. cerevisiae asilada. Observacin bajo el
objetivo de 100 X en
microscopio de campo claro.
Durante 200 aos las caractersticas morfolgicas (estructurales)
han ayudado a los
taxonomistas a clasificar los organismos. Hoy en da la
identificacin de un
microorganismo por medio de la morfologa nos dice poco acerca de
las relaciones
filognicas. Sin embargo, las caractersticas morfolgicas an son
tiles para la
identificacin de las levaduras, bacterias y hongos. (Tortora, et
al., 2007).
Existen clasificaciones para casi todos los microorganismos e
identificar la morfologa es
una ventaja para cuando no se sabe qu clase de microorganismo se
maneja es decir si es un
hongo o una bacteria, cada uno tiene caractersticas muy
especficas por lo cual si se
conocen dichas caractersticas es fcil diferenciar uno del
otro.
S. Cerevisae es un hongo, una levadura utilizada en la
fabricacin de pan, cerveza y vino
comnmente, debido a que es un hongo normalmente se encuentran
vista al microscopio
agrupaciones de esferas pequeas.
Las colonias, son agrupaciones del microorganismo de inters (en
este caso de levadura)
que son visibles en los medios de cultivo, gracias a las formas
que generan. Este tipo de
agrupaciones son formadas por un solo tipo de microorganismo, lo
que quiere decir que
tienen la misma informacin gentica. La morfologa colonial y
celular, son las
caractersticas que, junto con el aspecto de las colonias y el
tipo del medio en el que se han
-
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incubado, siendo diferenciales y selectivos; todo esto, forma
parte de procedimientos
llevados a cabo en laboratorios microbiolgicos (Koneman, et al.,
2006).
En la tabla 1 se pueden observar los resultados obtenidos de la
morfologa colonial de S.
Cerevisiae aislada mediante la tcnica de estra cruzada.
Tabla 1. Resultados se las observaciones de la morfologa
colonial a simple vista.
Caracterstica Descripcin
Medio de cultivo Slido
Aspecto Seco
Color Beige
Superficie Lisa
Elevacin Plana
Forma Circular
Pigmento No presente
Consistencia Suave
Borde Entero
El desarrollo, crecimiento, reproduccin y adaptacin de las
clulas est estrechamente
ligado a su relacin con el medio extracelular; estas variaciones
en el entorno producen
como consecuencia una respuesta de adaptacin a las nuevas
situaciones, que pueden ser
determinante para su supervivencia. Para ello poseen sensores
que activan cambios y
mecanismos metablicos que conllevan a una respuesta especfica
(Salle, 1967).
Las pruebas bioqumicas se basan en cuatro aspectos, primero el
sustrato contenido en el
medio de cultivo, segundo la enzima o va metablica secretada o
que est dentro del
microorganismo, tercero el producto y por ltimo un revelador y/o
indicador (Salle, 1967).
La Saccharomyces Cerevisiae es una levadura, un hongo
unicelular, del grupo de los
ascomicetos, crece de forma ptima a un pH cido. La alcalinizacin
extracelular interfiere
con el correcto transporte de nutrientes y cationes necesarios
para su supervivencia y, por
ello, la exposicin a pH alcalino supone una situacin de estrs.
S. Cerevisiae es capaz de
sobrevivir a valores de pH de 5.0 a 6.0. Es un anaerobio
facultativo, adems desarrolla un
metabolismo oxidativo y un metabolismo fermentativo. (Ortiz,
2013)
Pruebas bioqumicas
Prueba de Fermentacin de carbohidratos.
Se utiliz un medio de cultivo caldo bsico rojo de fenol siendo
39 g los necesarios para
preparar un litro de medio, teniendo como formulacin qumica los
siguientes compuestos:
-
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Peptona 10g.
Extracto de carne 1g.
Cloruro de sodio 5g
Agua destilada 1000 mL.
Indicador de pH: Rojo de fenol.
-cido: color amarillo con pH de 6.8
-Alcalino: color rojo con pH de 8.4
-Medio no inoculado de color rojo intenso con pH de 7.4
El fundamento de esta prueba se basa en el proceso metablico de
xido-reduccin que
ocurre en un medio ambiente anaerobio y, en lugar de oxgeno, un
sustrato orgnico sirve
como aceptor final de hidrgeno. Este efecto es detectado
observando cambios de color en
los indicadores de pH a medida que se forman los productos cidos
(metabolitos). La
prueba resulta negativa si la coloracin del medio es rosa-rojizo
(alcalina) o color naranja y
es positiva si la coloracin es amarilla (cida) (Cercenado y
Cantn, 2010).
Las bacterias anaerobias y anaerobias facultativas a menudo
fermentan carbohidratos a
cidos orgnicos y gas. (Bailn et al, 2003)
En la figura 9, se observan los cambios de color para el medio
de cultivo caldo bsico de
fenol, obteniendo un resultado positivo para la prueba de
fermentacin de carbohidratos
interpretndose que los compuestos de carbono incorporados en el
sustrato fueron
degradados a monmeros y transportados a la clula para
posteriormente ser metabolizados
por la va fermentativa debido a las condiciones anaerobias del
medio. Fsicamente esto se
observa por el cambio de color amarillo que indica la acidez en
el medio de cultivo
significando la fermentacin (degradacin) de los compuestos de
carbono, siendo este
compuesto, en la formulacin, el extracto de carne.
Prueba de ureasa.
B
Figura 9. A) Tubos Falcon con medio de cultivo caldo bsico de
fenol inoculado con
Saccharomyces cerevisiae al tiempo cero de incubacin. B) Se
observa el cambio de coloracin del
medio de cultivo caldo bsico de fenol de un color rojizo a un
color amarillo a las 48 horas de
incubacin siendo la temperatura de incubacin 37C.
A B
-
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Se utiliz un medio de cultivo caldo urea de Christensen cuya
formulacin (3.87 g de
polvo) para 100 mL de agua es la siguiente:
Extracto de levadura 0.10g
Urea 20.0g
Fosfato monopotsico 9.10g
Fosfato de sodio 9.50g
Rojo de fenol 0.01g
Indicador de pH: Rojo de fenol
cido: amarillo con pH de 6.8.
Alcalino: rosado con pH de 8.4
Medio no inoculado: amarillo con pH de 6.8
Este tipo de prueba determinar la capacidad de un organismo de
desdoblar la urea formando
dos molculas de amoniaco por la accin de la enzima ureasa
produciendo un cambio de
color en el medio. Las levaduras pueden degradar la urea si
tienen la enzima ureasa. Tiene
como reaccin qumica la siguiente:
+ 22 2 + 2 + 23
El amoniaco reacciona en solucin para formar carbonato de
amonio, producindose
alcalinizacin y aumento del pH del medio que se detecta por la
presencia del indicador
(Cercenado y Cantn, 2010).
La hidrlisis de la urea es catalizada por la ureasa para dar dos
molculas de amoniaco. La
ureasa es una importante enzima microbiana vinculada con la
descomposicin de los
compuestos orgnicos. El resultado es positivo si la coloracin es
rosada intenso, negativo
si la coloracin es amarilla (Bailn et al, 2003) Los resultados
obtenidos para sta prueba se
muestran en la figura 10.
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En la figura 10, se observa el cambio de color del caldo urea de
rojo a rosado leve, esto nos
indica que la prueba es positiva, por lo cual en el medio existe
una baja concentracin de
amonaco que alcaliniza el medio. La baja concentracin de
amoniaco puede explicarse
debido a que durante el proceso metablico de la Saccharomyces
cerevisiae la degradacin
de la urea no siempre sigue inmediatamente el metabolismo de la
arginina. En
consecuencia, la urea es excretada progresivamente por los
microorganismos de levadura y
puede ser reabsorbida ms tarde para ser utilizada como una
fuente de nitrgeno. La
excrecin de urea y re-absorcin afectan la cantidad de urea
presente en el medio. Adems
degrada la urea en una reaccin de amonaco en dos pasos, primero
se puede utilizar para
sintetizar nuevas molculas nitrogenadas complejas y dos producir
CO2, donde la urea es
carboxilada en alofanato por carboxilasa. (Coulon J. et al,
2006).
Tabla 2. Resumen de los resultados obtenidos para las pruebas
bioqumicas aplicadas a
Saccharomyces cerevisiae.
Prueba bioqumica Resultado
Fermentacin de carbohidratos Positiva
Prueba de Ureasa Positiva
Figura 10. A) Tubos Falcon con 20 mL de cultivo caldo urea cada
uno, inoculados con
Saccharomyces cerevisiae, ntese su coloracin rojiza a un tiempo
cero de incubacin.
B) Se observan los tubos Falcon transcurridas 48 horas de
incubacin, se aprecia una
coloracin rosada en el caldo urea.
A B A
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Produccin de cerveza tipo Pale Ale, haciendo uso del mtodo dry
hoping, en un
biorreactor tipo tanque agitado.
Conteo en cmara de Neubauer.
Se tomaron en total cinco muestras durante un da de fermentacin
para hacer el conteo
de las clulas de la levadura y obtener una cintica que nos
mostrara la produccin de
biomasa. Se realiz el conteo de cada muestra en cmara de
Neubauer.
Figura 11. Se observan los cuadros representativos para un
conteo en cmara de Neubauer.
La muestra de cerveza JINICH fue contada en la regin tres de la
cmara a 1/16 del cuadro
tres.
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Figura 12. Grfica de la produccin de biomasa de Saccharomyces
Cerevisiae en la
fermentacin de mosto para la produccin de cerveza.
Podemos observar en la Figura 12 el crecimiento de la
Saccharomyces Crevisiae con una
concentracin inicial a un tiempo de cero horas de 5.5x106 cel/mL
y una concentracin
final despus de veinte horas de 1.25x107 cel/mL
La velocidad especfica de crecimiento () para produccin de
biomasa o generacin de
clulas de Saccharomyces cerevisiae tiene un valor de 0.0339
h-1
(ver anexo, apartado II),
con un tiempo de duplicacin de 20.44 horas (ver anexo, apartado
III).
Conteo de clulas en cmara de Neubauer:
16 cuadros Nmero de clulas por cuadro
Cuadro 1 extremo superior izquierdo
14
Cuadro 2 extremo superior derecho
15
Cuadro 3 central 13
Cuadro 4 extremo inferior izquierdo 14
14
Cuadro 5 extremo inferior derecho 14
Dado el conteo anterior, la concentracin celular obtenida de la
suspensin de
Saccharomyces cerevisiae del inculo es de 3.5 x 107 clulas/mL
(Ver anexo, apartado
ll).
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
14000000
0 5 10 15 20 25
Co
nce
ntr
aci
n (
cel/
mL)
Tempo (h)
-
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Cintica de crecimiento de la levadura Saccharomyces cerevisiae
sobre medio de
cultivo (mosto) en un Biorreactor tipo tanque agitado.
Condiciones iniciales de operacin: T= 23C; pH = 5.5; Volumen = 4
L; Tiempo = 24 h
Figura 16. Cintica de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae en
Biorreactor tipo
Tanque Agitado.
Figura 17. Regresin de datos para la obtencin de la velocidad
especfica de crecimiento.
El coeficiente de mantenimiento () para produccin de biomasa o
generacin de clulas de
Saccharomyces cerevisiae tiene un valor en este caso de 0.1772
hr-1
de acuerdo a la
ecuacin de regresin obtenida en la figura 13 (y = 0.1772x +
13.399) y las ecuaciones
empleadas (ver Anexo).
12.5
13
13.5
14
14.5
15
15.5
16
16.5
17
17.5
0 5 10 15 20 25 30
Ln (
# c
lula
s/m
L)
Tiempo (h)
y = 0.1772x + 13.399 R = 0.7749
12.5
13.5
14.5
15.5
16.5
17.5
18.5
0 5 10 15 20 25 30
Ln (
# c
lu
las/
mL)
Tiempo (h)
-
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En la figura 18, se muestra la produccin de biomasa y consumo de
sustrato cuantificados
en g/L.
Figura 18. Consumo de sustrato y produccin de biomasa de S.
cerevisiae en biorreactor
tipo tanque agitado.
Nota: Para convertir los grados Brix medidos a g/L simplemente
se hace la correlacin
usando las tablas correspondientes de la relacin entre los
grados Brix y el ndice de
refraccin a la temperatura a la cual se midieron los grados Brix
y la cantidad de azcar por
litro de agua. (Tabla 6).
Tabla 6. Grados Brix obtenidos durante la fermentacin de S.
Cerevisae en el biorreactor
tipo tanque agitado.
Tiempo (h) Temperatura
(C)
Grados Brix
medidos
g/L azcar Alcohol
probable
0 23 4.03 44.841 2.33
2 23 4.13 45.878 2.36
4 23 4.03 44.768 2.39
6 23 3.41 37.744 1.95
8 24 2.44 27.171 1.41
10 24 1.36 15.146 0.78
12 24 1.08 11.963 0.54
14 24 0.93 10.354 0.58
16 24 0.90 9.963 0.57
El alcohol probable se obtuvo mediante las tablas obtenidas
de
http://www.ictsl.net/downloads/refractometros.pdf,
correlacionado los valores de los grados
Brix.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 5 10 15
Co
nsu
mo
de
sust
rato
(g/
L)
Tiempo (h)
Consumo de sustrato(g/L)
Biomasa (g/L)
-
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Determinacin de variables que influyen en el cuerpo, conservacin
y sabor de la
cerveza.
Segn posada (1995), la calidad de la cerveza depende de varios
factores que tienen
relacin con las materias primas utilizadas, con el proceso de
elaboracin y principalmente
con las personas que evalan esta calidad. Entre los parmetros ms
importantes de
evaluacin de calidad estn el sabor, la presencia y permanencia
de espuma, color, grado
alcohlico y la presencia de residuos o precipitados
(estabilidad).
A continuacin se muestran los resultados obtenidos de las
determinaciones de los valores
correspondientes de la cerveza producida.
Tabla 3. Resultados obtenidos de las determinaciones de los
valores de pH, grados Brix y
grados de alcohol de la cerveza producida.
pH Brix % Alcohol
4.3 4.0 3.93 %
El valor obtenido para el pH (4.3), est dentro del rango sealado
por Kunze (1996) para la
cerveza tipo Pale Ale que l produjo, el cual indica que el pH se
sita entre 4,2 y 4,4. Sin
embargo, Swistowiez (1977) registra un valor ms bajo de 4,1
0,2.
Para poder calcular el porcentaje de alcohol, despus de tomar la
densidad inicial (antes de
fermentar) se tom la siguiente lectura (densidad final) cuando
sali del fermentador
(biorreactor tipo tanque agitado). Cabe mencionar que la
densidad final siempre ser menor
debido a que la levadura ha consumido parte de los azcares
disueltos en el mosto. (Hough
y Gonzlez, 1990).
La glucosa, es el azcar principal que es convertido en alcohol
por la levadura. Las
reacciones que se llevan a cabo convierten cada molcula de
glucosa en dos molculas de
etanol (CH3CH2OH) y dos molculas de dixido de carbono (CO2):
C6H12O6 => 2(CH3CH2OH) + 2(CO2)
Ahora, si revisamos la tabla peridica, el peso molecular del
etanol o es: 46.0688 g/mol y
por otro lado el peso molecular del dixido de carbono es:
44.0098 g/mol. Estos nmeros
son necesarios para calcular la cantidad de alcohol en la
cerveza.
Por los pesos moleculares mencionados podemos decir entonces,
que por cada 44.0098
g/mol de CO2 que se liberan, se producen 46.0688 gramos de
etanol. O lo que es lo mismo,
por cada gramo de CO2, se producen 1.05 gramos de etanol.
Entonces ahora podemos calcular el contenido de alcohol en la
cerveza.
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Densidad inicial: 1,045 g/mL
Densidad final: 1.015 g/mL
Si las restamos nos da la cantidad de CO2 que se liber, que es
0.03 g/mL, si lo
multiplicamos por 1.05 nos da el peso del alcohol en el
fermentador. Que en este caso es
de: 0.0315 g/mL.
Alcohol en la cerveza = (Densidad inicial-Densidad final)*1.05 =
0.0315 g/mL
Densidad final de la cerveza: 1.015 g/mL
Entonces al dividir ambas podemos calcular el porcentaje de
alcohol en nuestra cerveza:
Alcohol en la cerveza/ Densidad final = (0.0315 g/mL)/1.015 g/mL
* 100 = 3.103 %
Este es el porcentaje de alcohol por peso, que tiene nuestra
cerveza. Sin embargo es ms
comn expresar el porcentaje de alcohol en volumen. (%ABV).
(Hough y Gonzlez,
1990). Entonces para obtener el porcentaje de alcohol en
volumen, slo hay que dividirlo
por la densidad del alcohol, lo que nos da:
3.103/0.79= 3.92 %
O utilizar esta frmula general: (Hough y Gonzlez, 1990)
%ABV= (Densidad inicial-densidad final)*131
%ABV= (1.045 g/mL-1.015 g/mL)*131= 3.93%
Y as concluimos que nuestra cerveza tiene un 3.93 % de
Alcohol.
Los principales productos de fermentacin son etanol y CO2,
aunque tambin se forman
otros subproductos del crecimiento de la levadura, que
contribuyen de forma importante al
perfume y aroma de la cerveza. (Tabla 4). Los cidos orgnicos,
alcoholes y steres son
especialmente importantes (Brown et al., 1989).
Tabla 4. Productos de las fermentaciones de levaduras.
-
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Anlisis organolptico
A continuacin se nombran algunos parmetros fsico-qumicos usados
comnmente para
describir una cerveza, y que pueden ser utilizados para medir de
alguna manera su calidad.
El anlisis organolptico se llev a cabo con 10 personas en las
instalaciones de la Unidad
Profesional Interdisciplinaria de Ingeniera campus Guanajuato a
las cuales se les dio una
muestra de la cerveza para que la evaluaran. Los resultados
obtenidos se muestran en las
siguientes grficas.
Figura 12. Calificaciones otorgadas por los degustadores en
cunto al color de la cerveza.
0123456789
10
Cal
ific
aci
n
Degustadores
Color
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
Cal
ific
aci
n
Degustadores
Sabor
Figura 13. Calificacin obtenida en la evaluacin del sabor segn
los
degustadores. 1= Amarga, 2= Poco Amarga, 3= Muy amarga.
-
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Figura 14. Calificaciones del olor de cerveza segn los
degustadores.
Segn Garca et al., (1993) hay distintos tipos de cerveza en el
mundo, algunas de sus
caractersticas se muestran en la tabla 3. Como podemos ver, lo
que distingue a una cerveza
tipo Pale Ale de las dems es su sabor muy amargo, adems de que
contiene mucho lpulo
es clara y seca.
Tabla 5. Distintos tipos de cerveza en el mundo, sus nombres y
sus caractersticas.
Tipo de cerveza Caractersticas
LAGER
Hell o Pale Clara, mucho lplulo, seca, poco cuerpo
Dortmunder Igual que la pilsener, pero con menos lpulo y sabor
ms suave
Munich Oscura, sabor intenso, poco lpulo, poco amarga, dulce,
mucho cuerpo
Bock, Marzen Igual que la Munich pero con ms alcohol
ALE
Pale ale Clara, mucho lpulo, seca, muy amarga
Brown ale Oscura, poco lpulo, dulce
Bitter Clara, mucho lpulo, mucho cuerpo (pale ale de barril)
Mild Ale Semioscura, dulce, poco densa, amarga
Stout o Porter Muy oscura, mucho cuerpo, mucho lpulo, amarga,
dulce o seca
Si observamos la figura 13, la mayora de los degustadores
calificaron como Amarga y
muy amarga la cerveza obtenida, caracterstica que concuerda con
lo consultado en la
literatura (Tabla 5).
8.48.68.8
99.29.49.69.810
10.2
Cal
ific
aci
n
Degustadores
Olor
-
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Finalmente en la tabla 4 se agrupan las caractersticas obtenidas
de la cerveza producida a
la cual nombramos cerveza JINICH.
Tabla 4. Propiedades organolpticas de la cerveza JINICH
Caracterstica Observaciones
Color Amarillo
Tonalidad del color Claro
Vivacidad Poca capacidad del desprendimiento de gas
disuelto en la cerveza.
Consistencia de la espuma Ligera, con tamao de poros de gas
en
superficie cerrados.
Persistencia de la espuma en el vaso No
Color de la espuma Blanco intenso
Aroma Agradable, terroso intenso
Alcohol Intenso
Sabor Un amargo intenso
Sensacin residual Perdura en la boca despus del consumo.
Las tipo Pale Ale segn el programa de certificacin para juzgar
cervezas (2008) estipulan
que tienen un aspecto amarillo claro o cobre suave, claridad
buena o brillante. Espuma
blancuzca de baja a moderada. Puede tener una espuma de poca
altura debido a la baja
carbonatacin. Sabor amargo medio a alto.. El sabor del lpulo es
de moderado a bajo (a
terroso, resinoso y/o floral en las variedades tpicamente
inglesas, aunque pueden usarse
variedades de lpulo. Carcter maltoso de bajo a medio con un
gusto final seco. Su sabor en
la boca es de cuerpo liviano a medio-liviano.
Adems de todo lo anterior la formacin de espuma es uno de los
factores ms importantes
en la evaluacin de calidad que realizan los consumidores, ya que
con esto se transmite la
primera impresin del producto cuando es servido un vaso de
cerveza. La espuma se forma
por gases que se encuentran finamente repartidos en el lquido y
materias slidas,
principalmente el CO2.
Segn Swistowiez (1977), los elementos de la formacin de espuma
son las protenas de
alto peso molecular derivadas de la malta y provenientes del
lpulo. Las maltas demasiado
modificadas o poco desecadas tienden a producir espumas pobres.
Cuanto menor sea la
relacin de malta y lpulo, ms pobre ser la espuma.
Cabe mencionar que no pudimos evaluar este factor en la cerveza
producida porque ocurri
un accidente con la cerveza ya embotellada, alguien la meti al
congelador por descuido
ocasionando que se congelara por completo y se desgasificara
como ocurre con todos los
productos gaseados cuando se congelan, la cerveza gasificada que
se tena se puede
observar en la figura 15, donde se aprecia la formacin de
espuma.
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Figura 15. Generacin de espuma en la cerveza producida (Antes de
haberse congelado)
Otras de las caractersticas que son importantes evaluar para
validar la calidad de una
cerveza son el amargor y la turbidez, los cuales influyen mucho
en el sabor y color del
producto final. (Hough y Gonzlez, 1990).
La cerveza final obtenida se puede apreciar en la figura 16.
Embotellada y etiquetada. La
marca: JINICH.
Figura 16. Cerveza artesanal marca JINICH elaborada a partir de
la fermentacin S.
cerevisiae en un biorreactor tipo tanque agitado.
Espuma generada
en el primer
embotellamiento
de la cerveza.
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CONCLUSIN
Se aisl S. Cerevisiae mediante la tcnica de estra cruzada en
agar PDA, se identific y
determin la morfologa colonial y celular de S. Cerevisiae
mediante pruebas bioqumicas y
una vez aislada la cepa se utiliz para realizar una fermentacin
en un biorreactor tipo
tanque agitado obteniendo cerveza tipo Pale Ale artesanal
clarificada con centrifuga de
discos. De los parmetros fsico-qumicos determinados se encontr
que concuerdan con
los mencionados por literatura para ste tipo de cerveza
producida con la implementacin
de tcnica Dry-Hopping.
REFERENCIAS
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40 | Ingeniera Farmacutica
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Posada, J. 1998. Estudio Recopilatorio Cerveza y Salud. Escuela
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Cerveza y Malta. Centro de informacin Cerveza y Salud. Madrid.
Espaa.
ANEXO
Memoria de clculo.
Apartado I.
El rea del 1-16 de la regin tres de la cmara de Neubauer
comprende:
rea= 0.05 mm x 0.05 mm= 0.0025 mm2
Volumen= 0.0025 mm2 x 0.1 mm= 2.5 x 10
-4 mm
3 = 2.5x10
-7 mL.
Frmula de concentracin celular:
= 4106
Apartado II.
Figura Regresin de datos para la obtencin del coeficiente de
mantenimiento.
y = 0.0339x + 0.0851 R = 0.9558
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0 5 10 15 20 25
ln(x
/x0)
Tiempo (h)
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Se observa en la Figura la regresin de los datos del logaritmo
de la concentracin de
biomasa con respecto al tiempo para determinar la velocidad
especfica de crecimiento ();
partiendo de la siguiente ecuacin:
= x
0= t
y graficando
0 con respecto al tiempo para obtener la velocidad especfica
de
crecimiento (), resultando una ecuacin final de:
y = 0.0339x + 0.0851
0= 0.0339t + 0.0851
Apartado III.
Para el tiempo de duplicacin empleamos la siguiente ecuacin:
=2
= 20.44
- Calculo del promedio de clulas por cuadrado:
Media (14+15+13+14 +14)/5 = 14 levaduras en 16 cuadros de 0.05
mm x 0.05 mm c/u
14
16 400
0.1 3
1000 3
1 3 102 = 3.5 107 /
Al utilizar un inculo activo y suponiendo que puede acortarse el
tiempo que dura la fase
de latencia y la velocidad de crecimiento de la biomasa aumenta,
transcurridas ciertas horas
las clulas crecen a una velocidad mxima constante (fase
exponencial) y puede describirse
con la ecuacin:
dX/dt = X Dnde: X= es la concentracin de clulas (mg/mL) t = es
el tiempo (h) = es la velocidad especfica de crecimiento (h-1) Al
integrar la ecuacin dX/dt = X, obtenemos:
Xt = X0eut
Dnde: X0 es la concentracin de clulas en el tiempo 0.
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Xt es la concentracin de clulas despus de un tiempo t en horas
Tomando logaritmos naturales en la ecuacin: Xt = X0e
ut se obtiene:
Ln Xt = ln X0 +t
El crecimiento microbiano unicelular es auto cataltico, de modo
que la velocidad de
crecimiento celular es proporcional a la concentracin de clulas
ya presente. El
crecimiento de un microorganismo en un cultivo puede describirse
tambin usando el
trmino de tiempo de duplicacin () que es el tiempo necesario
para dividir una clula.
(Cahuancama, 2013).Si en un medio de cultivo se inoculara una
clula viable y esta clula
creciera a velocidad mxima sin pasar por la fase de latencia, el
crecimiento secuencial del
nmero de clulas que se observara sera: 1, 2,4, 8, 16, 32, 64,
etc. Este crecimiento
secuencial puede representarse expresando el nmero de clulas en
base dos.
(Cahuancama, 2013)
Entonces tenemos:
= 20
ln (
0)) =
ln (2
0)) =
Despejando el tiempo de duplicacin ():
= ln 2
Dada la regresin obtenida se tiene:
Y=0.1172x+13.399
Y= mx+b
Ln (# de clulas) =t
Con un tiempo de duplicacin de:
=2
0.1772 1/h = 3.9
-
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Rendimientos.
Con los 1.72 Kg de malta utilizada se lograron obtener 4.3
litros de cerveza.
Los clculos para la adicin de lpulos y malta se muestran a
continuacin:
1 Kg malta = 2.5 L mosto
4.3 (1
2.5 ) = 1.72
6.666 gr de lpulo = 1 L mosto
6.666 4.3 = 28.666 13.2%
A continuacin se muestra la cantidad de lpulo Nugget 13.2%
agregado a los diferentes
tiempos
30 min 50% (28.66
100 %) = 14.33
45 min 25% (28.66
100 %) = 7.16
55 min 25% (28.66
100 %) = 7.16
En la tcnica Dry Hopping se usaron las siguientes cantidades del
lpulo CHINOOK 11.8%
y Cascade 7%.
25% (28.66
100 %) = 7.16 11.8%
25% (28.66
100 %) = 7.16 7%