Direccionamiento de fenotipo de microglas en un modelo de EAE y
evaluacin de su rol en soporte de remielinizacin
Direccionamiento de fenotipo de microglas en un modelo de EAE y
evaluacin de su rol en soporte de remielinizacin
Estudiante: Mara Marisela Snchez-Chaparro, 353836Supervisor:
Estudiante de PhD Ilia D. Vainchein; Dr. H.W.G.M. Boddeke
Diciembre 2011 Marzo 2012
Departamento de Neurociencias, Universidad de GroningenUMCG
Groningen, Los Pases Bajos
TABLA DE CONTENIDOS
RESUMEN 1
INTRODUCCIN 2
MATERIALES Y MTODOS 7Induccin de EAE 7Anlisis de Expresin de
Genes 7Aislamiento y tamizaje por FACS de microglas/macrfagos
RESULTADOS 8
DISCUSION 11
REFERENCIAS13
APPENDICES15Apndice I: Protocolos 15Apndice II: Anlisis
Estadstico19
ABSTRACT
Esclerosis mltiple es una enfermedad inflamatoria, crnica y
autoinmune del SNC y afecta solamente a humanos. Se caracteriza por
condiciones desmielinizantes seguido por la eliminacin de neuronas.
La remielinizacin es un proceso compensatorio que ayuda a mitigar
el dao. Este proceso falla o no se lleva a cabo cuando la
inflamacin se vuelve crnica. Las microglas son clulas inmunes del
SNC. Participan en el proceso de la fagocitosis y se les compara
con los macrfagos perifricos. Normalmente, estas clulas han sido
identificadas como precursores de procesos neuroinflamatorios. Sin
embargo, existen repores de que las clulas microgliales estn
involucradas en los procesos tempranos de remielinizacin, ayudando
a las clulas precursoras de oligodendrocitos (OPC). Un modelo de
cuprizona en ratones fue desarrollado anteriormente y sugiere que
la microglas presenta un fenotipo capaz de inducir o dar soporte en
procesos remielinizantes. Nuestro objetivo fue investigar un
fenotipo de microglas en EAE, un modelo mimtico de EM durante fases
primarias de desmilinizacin. Analizamos mRNA de
microglas/macrfagos. Nuestras evidencias indican un fenotipo que
est influenciando remielinizacin y sugiete que la microglas se
involucra en fagocitosis, inflamacin y estimulacin de procesos en
OPC, que son necesarios para desarrollar hiperplasia en
oligodendrocitos y mejorar OPC. Este estudio ayuda a conocer ms
acerca del papel de las clulas microgliales como soporte
homeosttico en mecanismos estabilizadores.
Palabras claves: Microglas, fenotipo, remielinizacin, modelo
EAE, EM.
INTRODUCCIN
Esclerosis mltiple (EM) es una enfermedad autoinmune, crnica e
inflamatoria caracterizada por desmielinizacin y degeneracin axonal
(Glas et al., 2010). Tiene sntomas desestabilizantes como alteracin
sensorial, neuritis ptica, discapacidad motriz, ataxia, disfuncin
de la vejiga, dficit cognitivo y fatiga (Green et al. 2010).
EM es la causa ms importante de discapacidad neurolgica en
adultos jvenes entre los 20 40 aos, afectando principalmente a
mujeres (3-2:1), y tiene una prevalencia de 260 por cada 100,000
habitantes en Reino Unido (Hirts, 2008). Esta enfermedad resulta de
la interaccin entre factores ambientales an no identificados, y la
susceptibilidad gentica (Compston, 2002). Hasta la fecha no se
conoce una cura para EM y los tratamientos intentan restablecer las
funciones despus de un ataque, prevenir nuevos ataques y
discapacidad, pero hasta ahora, no se ha desarrollado una terapia
exitosa debido a que los mecanismos de la enfermedad an no son
comprendidos del todo.
EM se caracteriza por periodos de recada-remitencia seguidos por
una fase progresiva, la cual es dirigida por el sistema inmune
adaptativo y estn involucradas clulas T cooperadoras (Th) tipo 1
(Th1), Th17 y CD8 que se infiltran al SNC y provocan un ataque.
Estas clulas estn moduladas por regulacin de clulas T y B. La
infiltracin de clulas T inicia una cascada de seales, causada por
un epitope que provoca nuevos ataques y adems activa el sistema
inmune innato como microglas, clulas dendrticas, astrocitos, etc.
(Vigletta, 2004; Lassmann et al., 2001).
Usualmente, cuando el dao y la inflamacin pasan, la
remielinizacin puede llevarse a cabo como parte de mecanismos de
reparacin y homeostasis; no obstante, si la inflamacin se vuelve
crnica, este procesos se afecta resultando en nuevos sntomas que
derivan en degeneracin axonal y la subsecuente desaparicin de
neuronas (Glass et al. 2010).
Este procesos se ha visto en varias citocinas inflamatorias que
se producen de manera previa por clulas del sistema inmune
perifrico y las residentes del SNC, como la microglas activada, que
promueve procesos de inflamacin, que mediante el cual rutas de
sealizacin son activadas y que finalmente resultan en la sntesis de
autoanticuerpos dirigidos a las vainas de mielina que luego
destruyen y producen la prdida de sta (Zindler and Zipp, 2010).
La remielinizacin es ms activa durante los procesos de
inflamacin aguda y fases progresivas y coincide con la remocin
fagoctica de restos de mielina (Williams, 2007). Las clulas
precursoras de oligodendrocitos (OPCs) no diferenciados estn
alrededor de las lesiones de MS y adems actan como fuente de clulas
que tienen un potencial de restablecer axones (Chandran, 2008). En
teora, el proceso de remielinizacin falla debido a una deficiencia
en el restablecimiento y/o diferenciacin de OPCs, este ltimo
proceso es el ms complicado de realizar y por lo tanto el ms
susceptible a fracasar. (Franklin, 2008). Se sabe que las clulas
OPC pueden la capacidad y habilidad de convertirse en
oligodendrocitos maduros que son las clulas reparadoras del SNC y
son el producto final del linaje celular. Este proceso est sujeto a
una compleja y precisa sincronizacin de procesos como proliferacin,
migracin, diferenciacin y mielinizacin para producir vainas de
mielina en axones que sean capaces de reparar los sitios daados.
Sin embargo, la manera en cmo se realiza el proceso de
remielinizacin no es claro. (Lully, 2010).
Las neuronas son clulas que no pueden dividirse o ser
reemplazadas, por lo tanto requieren un sistema de defensa que las
proteja contra patgenos y que adems acte despus de un dao y ayude a
restablecer el SNC. Este trabajo es realizado por el grupo de
clulas gliales, compuesto por la macroglia (astrocitos,
oligodendrocitos y polidendrocitos) y microglas (Ransohoff and
Cardona, 2010). A principios del siglo XIX, Cajal describi la
existencia de un tercer elemento adems de neuronas y neuroglia,
(Kaur, et al, 2001), subsecuentemente del Ro-Hortega identific
dentro de este elemento dos tipos de clulas, nombrndolas
oligodendroglia y microglas, las cuales estn diferenciadas una de
otra por su morfologa externa as como su origen embrionario (del
Ro-Hortega, 1932). Cabe sealar que el origen del desarrollo de las
microglas han sido tema de debate por muchos aos y ste tiene 3
principales teoras acerca del origen de estas clulas (1)
mesodermal, (2) neuroectodermal, y (3) monoctico (revisado por
Tambuyer, 2009). Actualmente, la mayora de las investigaciones
soportan la hiptesis de que las microglas son un linaje derivado de
clulas mieloides-monocticas y/o precursores hematopoyticos (Chan et
al 2007).
Las microglas constituyen entre 5-20% del total de poblacin de
clulas gliales dentro del SNC, encontradas en la materia gris que
en materia blanca (Lawson, 1992), y estn distribuidas en regiones
como hipocampo y el tlamo dorsal en el desarrollo del CNS (Perry,
1993). Las clulas microgliales se distribuyen en hipocampo y
cerebelo en ratn (Jinno, 2007) y pueden permanecer quiescentes
largo tiempo, pero cambian su comportamiento en respuesta a
diferentes seales del medio ambiente celular, de un estado inactivo
a uno activo que es estrictamente controlado por la secrecin de
productos como citocinas, aminocidos excitatorios y radicales
libres. Mediante este proceso, las microglas pueden comunicarse con
otras clulas del cerebro y del sistema inmunolgico. Este proceso se
denomina como plasticidad de desarrollo (revisado por Tamboyuzer,
2009).
Frecuentemente, las microglas se comparan con los macrfagos
porque ambas son atrados por factores quimiotcticos end- y exgenos,
tienen la capacidad de migrar hasta sitios de daos o infeccin en el
SNC (Hanisch, 2001), y representan una defensa esencial y un
sistema de reparacin (Lawson, 1992). Ellas se comportan como clulas
de primera lnea de defensa y realizan procesos de fagocitosis,
adems son conocidas por su funcin como fagocitos transitorios
responsables de la limpieza de cuerpos celulares neurales en estado
apopttico durante la ontogenia del SNC (Stolozing, 2004). El papel
de las microglas endgena es proteger la integridad de tejidos,
realizando una exhaustiva vigilancia y respondiendo efectivamente
sobre seales de alerta. (Nimmerjahn et al. 2005). No obstante, la
importancia del proceso de fagocitosis en varias patologas
neurolgicas es un tema controvertido.
Pese a que las microglas pueden capturar, procesar, y presentar
la mielina como antgeno, las investigaciones no han demostrado
precisamente stas sean un factor clave para iniciar el proceso de
desmielinizacin en EM. En ausencia de inflamacin linfocitaria en no
autoinmune contexto, los agentes patgenos asociados con la aparicin
de la inflamacin, las clulas microgliales protege compartimento
neuronal (Remington et al. 2007). Sin embargo, este proceso se
invierte tanto en los Estados miembros y que la microgla activada y
los macrfagos derivados de la periferia se mueven hacia un fenotipo
pro-inflamatorias, debido a que la participacin de las citocinas
como el TNF- e IL-1 que induce la inflamacin y sustancias
neurotxicas, incluyendo xido ntrico (NO), las especies reactivas
del oxgeno (ROS) y las enzimas proteolticas (Ransohoff de 2009,
Vogt et al., 2009).
Aunque las clulas microgliales pueden capturar, procesar y
presentar la mielina como un antgeno, las investigaciones no han
probado que exactamente stas son un factor clave de iniciacin de
procesos desmielinizantes de EM. En ausencia de inflamacin
linfoctica en un contexto no autoinmune, la patognesis asociada al
inicio de la inflamacin, las microglias protegen el compartimento
neuronal (Remington et al. 2007). Sin embargo, este proceso se
revierte tanto en EM y en las microglias activadas y los macrfagos
derivados del sistema perifrico se mueven hacia un fenotipo
pro-inflamatorio, debido a que se involucran citocinas como TNF- y
IL-1 que indicen sustancias inflamatorias y neurotxicas, incluyendo
xido ntrico (NO), especies reactivas de oxgeno (ROS) y enzimas
proteolticas (Ransohoff, 2009, Vogt et al., 2009).
La infiltracin de macrfagos y clulas dendrticas dirigidas dentro
del SNC han sido considerados como procesos necesarios y la
activacin simultnea o subsecuente de las microglas, son un
resultado de la interferencia inmune con infiltracin de clulas
inmunolgicas a travs de quimiocinas y sealizacin de IL (Carson,
2002; Raivich yd Banati, 2004, Becher et al, 2006).
Encefalomielitis alrgica experimental (EAE) sirve como un modelo
animal para EM, y desde la primera vez que fue descrito por Rivers
in 1933, ste ha sido desarrollado de manera mimtica con todas las
caractersticas clnicas de EM, incluyendo formas como las de
remitencia-recurrencia, progresiva, y ptico-espinal, as como otras
formas espontneas (Lassman, 2007). La mayora de los tratamientos
para EM han basados en estudios de modelos de EAE, as como
conceptos bsicos de procesos autoinmunes que son relevantes para
esta enfermedad humana (Steinman, 2006). Diferentes cepas de
roedores son genticamente susceptibles a los componentes de la
mielina, y EAE se activa mediante la inmunizacin de la mielina, las
protenas asociadas, tales como la glicoprotena de mielina de
oligodendrocitos (MOG) o protena bsica de mielina (MBP), as como
otros inductores (Wekerle, 2008).
Debido a la etiologa compleja de la EM y que ste se considera
que slo afectan a los humanos, es difcil desarrollar un modelo
animal nico para imitar exactamente la condicin y los sntomas de
los pacientes con esta patologa, diferentes modelos animales se han
desarrollado las distintas especies animales que se centran en los
aspectos de la enfermedad. Los sntomas y la susceptibilidad
dependen del tipo de la inmunizacin, ya sea por la estimulacin
inmune, viral o qumica, y la cepa o especie de usar, ya que no
funcionan todos los antgenos de mielina en todas las cepas tipos de
roedores, y combinaciones diferentes que son capaces de reflejar un
subtipo especfico de EM (Gao y Tsirka, 2011).
EAE ha recibido la mayor atencin como un modelo de esclerosis
mltiple y es habitualmente utilizado en el ensayo de estrategias
teraputicas para la EM. Esta enfermedad presenta muchas
caractersticas clnicas e histolgicas de la esclerosis mltiple y es
causada por la induccin de la autoinmunidad a los antgenos que se
encuentran de forma natural o artificial (como el implantado
micobacterias o la ovoalbmina que, despus de la sensibilizacin
perifrica a estos antgenos, permite a los locales de las lesiones
especficas que se desarroll) expresados en el SNC (Owen, 2006).
Despus de la sensibilizacin a los antgenos de mielina, los animales
desarrollan la enfermedad caracterizada por parlisis de las
extremidades. EAE se asocia con disfuncin de la barrera
hematoenceflica, la infiltracin de clulas mononucleares en la CNS y
bloqueo de la conduccin que resulta en la neurotransmisin alterada.
Esto puede suceder en ausencia de la desmielinizacin y pone de
manifiesto una idea falsa de los muchos que EAE se debe a la
destruccin de la mielina. En algunos modelos de enfermedad tambin
se asocia con una prdida significativa axonal, que es la causa
subyacente de la incapacidad persistente (Lavi, 2005).
Cepas como ratones Biozzi ABH y SL mice, cepas de ratas DA y
cepa 13 de cobayos desarrollan EAE con recadas despus de haber
inmunizado con mielina completa, mientras que los ratones C57BL/6
son relativamente resistentes. Sin embargo, MOG es capaz de inducir
EAE con parlisis crnica, incluyendo en C57BL/6 (Revisado por Baker,
2011). El modelo de cuprizona (CPZ) es usado para una
desmielinizacin txica en ratones jvenes que se alimentan con un
quelante de cuprizona de cobre, lo que lleva a la muerte de
oligodendrocitos y luego una desmielinizacin reversible, pero que
es posible realizar un proceso de remielinizacin 4 das despus si
los ratones no se alimentan de este compuesto. La ingestion de
cuprizona en ratones induce una desmielinizacin altamente
reproducible de las regiones cerebrales distintas, entre ellas del
cuerpo calloso, que representa la zona ms frecuentemente
investigada de la materia blanca en este modelo animal. Estos
modelos reflejan cada uno de los diferentes aspectos de la patologa
de la EM y son los actuales estndares aceptados de oro para el
modelado de la enfermedad (Zhang, 2011). Sin embargo, CPZ, as como
otros modelos de inductores qumicos neurotxicos (o biolgicos) no se
comparan con la EAE, ya que stas no se desarrollan bajo las
caractersticas autoinmunes (Moreno, 2012).
Olah et al. (2012) han obtenido recientemente los datos de un
modelo de desmielinizacin en CPZ inducida en ratones que muestran
que microglas locales exhiben un fenotipo de apoyo de la
remielinizacin y que este fenotipo se expresa ya en los primeros
signos de desmielinizacin debido a que no encontraron evidencia que
apoya la idea de que hay microglas fenotipos desmielinizantes. El
fenotipo observado durante la remielinizacin desarrollado durante
el curso de la desmielinizacin y persisti en la remielinizacin.
Los patrones de expresin de la mayora de los genes mostraron
todo el proceso de desmielinizacin y remielinizacin fue uniforme,
incluyen genes asociados con el complejo MHC-II. Otro aspecto
encontrado por esta investigacin fue un fenotipo que apoya la
diferenciacin de oligodendrocitos porque genes como PDGFA, PDGFB,
VEGF, Vegfb, TGFb1, IGF1, y SPP1 se encontraron sobreregulados.
Estos y otros resultados sugieren que las clulas microgliales puede
jugar un papel de apoyo en la induccin de una remielinizacin. (Olah
et al., 2012). Sin embargo, el modelo de CPZ permite la
remielinizacin por s mismo, por lo que es necesaria una evaluacin
en el modelo de EAE, porque este es un modelo mimtico a la EM.
En este estudio nuestro objetivo fue identificar el
direccionamiento de fenotipo en microglas en un modelo de ratn para
EM (EAE), y tambin encontrar un fenotipo capaz de apoyar el proceso
de remielinizacin, proinflamatorio, y el fenotipo de la infiltracin
de macrfagos perjudiciales en el tejido de la mdula espinal, que
por lo tanto, no dara un mejor entendimiento del comportamiento de
microglas y su papel de proteccin hacia el SNC, lo que podra ayudar
a desarrollar nuevos tratamientos dirigidos a incrementar o
estimular la remielinizacin de las vainas de mielina.MATERIALES Y
MTODOS
Induccin de EAE El manejo del ratn y los experimentos se
llevaron a cabo en estricta conformidad con la prctica de buen
animal como se define en la normativa nacional y / o los organismos
locales de proteccin de los animales, y todos los animales de
trabajo fue aprobado por el Comit Institucional de Empleo y Cuidado
de Animales de la Universidad de Groningen. EAE se indujo la
utilizacin activa de una mezcla de la glicoprotena de mielina de
oligodendrocitos (MOG) 3555 (MEVGWYRSPFSRVVH LYRNGK) y toxina de
pertussis (PTX). Esta emulsin fue sintetizada por Hooke
Laboratories (Hooke Kit MOG35-55/CFA Emulsion PTX EK-0113). El
procedimiento para inducir EAE se realiz siguiendo el instructor
por el fabricante (Apndice 1.1). Un total de 10 ratones hembra,
cepa C57BL/6JOla se utilizaron en este experimento, comprende 5
jaulas, cada una con dos ratones. Los signos de la enfermedad
fueron controlados como se describe: 0, no hay cambios evidentes:
1, cola inerte; 2, cola flcido y alteracin del movimiento; 3, la
cola flcido y una parlisis parcial de las patas traseras; 4, cola
flcido, parlisis completa de las patas traseras; 5, tetraplejia; 6,
muerte. Los ratones fueron sacrificados a una puntuacin de 3-4.
Anlisis de expresin de genes En resumen, el ARN total se aisl a
partir microglas utilizando un protocolo basado en fenol /
cloroformo (Apndice 1.2). Descripcin detallada de la RT-qPCR ensayo
se indica en el apndice 1.3. La calidad y cantidad de ARN se
comprob con el Nanodrop. Las muestras con resultado Nanodrop en la
relacin A260/280 con 1.9-2.1 se utilizaron para el anlisis de la
expresin gnica. Los genes de inters fueron analizados CD74, CD80,
CD86, IL-1, TNF, Pdgfa, ApoE, TGF, Cxcl16, Spp1 y Lgals3 en ambos
tipos celulares; CD40, y Il4ra fueron evaluados solo en macrfagos.
Los resultados se normalizaron comparando con HMBS y HPRT1. La
descripcin y anlisis estadsticos se realizaron Minitab v 16 y Prims
GraphPad 5. ANOVA de un factor y la comparacin de Tukey se
calcularon para encontrar significativa diferencia.
Aislamiento y FACS de microglas/macrfagosLos ratones fueron
anesteciados con una mezcla de pentobarbital de sodio y fenitoina
de sodio (Euthasol VIRBAC AH, Inc.) por inyeccin intraperitoneal y
se perfundieron con solucin salina helada al 0.9%. Despus de la
perfusin, se extrajeron la mdula espinal y el cerebro y se
colocaton en medio A. Los tejidos fueron homogenizados en este
mismo medio con un mortero de vidrio y se realiz el procedimiento
de aislamiento (Apndice 1.4). La suspensin celular se incub con los
anticuerpos de citometra de flujo anti-CD11b PE (eBioscience; Cat.
No. 12-0112) y anti-CD45 FITC (eBioscience; Cat. No. 11-0451) por
15 min en hielo y lavados con medio A sin color. Subsecuentemente,
las clulas microgliales y macrfagos se separaron por medio de un
separador celular usando el canal para los perfiles de microglia de
CD11b high/CD45.
RESULTADOS
Determinacin de perfil de expresin genticoEl patrn de expresin
gentica en nuestro modelo de EAE evaluado fue determinado
comparando los puntajes 0 y 4 de discapacidad, tanto en microglas y
macrfagos (Tabla 1). Las clulas microgliales mostraron incremento
en la expresin de CD74, as como en CD80 (B7.1) y CD86 (B7.2) pero
en estas dos ltimos resultados, resultaron ser altamente
significativo (p 0.005) se muestra en un color caracterstico.