Replicação do DNA Prof. Dr. Francisco Prosdocimi.

Replicação do DNA

Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Mitose / Meiose

Como acontece a síntese do DNA?

Meselson-Stahl experiment

• 1957• Cresceram E. coli em meio

com N-15 e depois voltaram pra N-14

• Purificação do DNA das bactérias

• Três tipos de DNA– N-15 + N-15– N-15 + N-14– N-14 + N-14

• Ao aquecer o N-15 + N-14 e separar as fitas ficava claro que uma fita continha N-15 e outra N-14

Replicação semi-conservativa

Origens de replicação

• Locais com um contexto de sequência específico

• Ligam proteínas específicas

• Quando acionadas, essas proteínas permitem o início da replicação

Origens de replicação

Replicação

• DNA Polimerase III• Sentido 5’ → 3’• Nucleotídeos 3P

são adicionados– Liberação de

Pirofosfato

http://207.207.4.198/pub/flash/24/menu.swf

Primase

• Ribonucleoproteína• Liga-se à helicase em

procariotos formando o chamado primossomo

• Sintetiza um primer de RNA contendo aproximadamente 11 bases; fornece 3’ OH

• DNA polimerase lenta e sujeita a erros

• Evita a progressão da forquilha uma vez que a fita líder anda mais rápido

Micrografia, bolha de replicação

Forquilhas de replicação

Forquilha de replicação

Replicação das fitas

• Fita líder– Primase age uma vez

• Fita retardada– Primase age várias vezes– 1967, Fragmentos de Okasaki Okazaki R, Okazaki T, Sakabe K, Sugimoto K. Mechanism of DNA replication possible

discontinuity of DNA chain growth. Jpn J Med Sci Biol. 1967 Jun;20(3):255-60

Primase na fita retardada

• Deslocamento da forquilha de replicação

• Primase faz primer

Direções de replicação na Forquilha

Desenovelamento do DNA

• Retirada das histonas• Proteínas de ligação a fita simples (SSBPs)• DNA helicase

– Quebra pontes de H

• DNA topoisomerases– Tiram a tensão

Forquilha de replicação

Polaridade da síntese define fitas líder e retardada (descontínua)

DNA polimerase• Enzimas que catalisa a reação

de síntese do DNA

• Adiciona nucleotídeos tri-fosfato à extremidades 3’OH livre

• Alongamento da cadeia de DNA sempre é feito na direção 5’>3’ (endonuclease 5’>3’)

• Incapaz de fazer DNA do zero (precisa ter extremidade 3’OH livre)

• Possui mecanismo de correção de erros (exonuclease 3’>5’)

Tipos de DNA polimerase

• DNA polimerase I– Descoberta em 1956 (Kornberg pai)– Função precisa descoberta apenas em 1969: remove

o primer de RNA da fita descontínua

• DNA polimerase III– Descoberta em 1970 (Kornberg filho)– Principal enzima que realiza a replicação em

procariotos

• DNA polimerase II– Lenta, envolvida em reparo do DNA

DNA Replication

• DNA Pol precisa de um molde inicial

• Primase: gera um molde de RNA complementar

• A DNA Pol III agora é capaz de adicionar bases à extremidade 3’OH

Eliminação dos

fragmentos de Okasaki

DNA Pol I

Mecanismo da enzima Ligase

Visão geral

Repare na posição do primer de

RNA

Reparo pela Polimerase

• Mecanismo de verificação(Proof-reading)

• DNA-polimerase possui– Uma atividade de

polimerização 5’→ 3’– Uma atividade de

exonuclease 3’→ 5’

Reparo pela Polimerase

• Mecanismo de verificação(Proof-reading)

• DNA-polimerase possui– Uma atividade de

polimerização 5’→ 3’– Uma atividade de

exonuclease 3’→ 5’

DNA Repair

• Checagem de pareamento incorreto(eucariotos)

• Proteínas especiais para reparo do erro

E as extremidades dos cromossomos?

Doenças causadas por problemas no mecanismos de replicação

• Ataxia de Friedreich's– dano progressivo no sistema nervoso (problemas musculares,

na fala e doenças no coração)– forma mais comum das ataxias herdadas– A seqüência GAATTC se repete, quando existem mais de 40

repetições, o indivíduo apresenta a doença.

• Xeroderma pigmentosum – envelhecimento precoce – aumento na incidência de câncer– Falha no mecanismo de reparação

do DNA causado pela luz UV

Ciclo celular

• A replicação do DNA é regulada temporalmente

• Fase S do ciclo celular

• Checkpoints do ciclo celular

• Ciclinas

Conclusões

• Replicação semi-conservativa• Bolha de replicação avança em duas direções• Fita líder e fita retardada• Helicases e topoisomerases desenrolam o DNA• Primase faz o primer• DNA polimerase III, DNA polimerase I• DNA ligase• Telomerase