Dottorato in Medicina Sperimentale XXXIIl Ciclo Relazione avanzamento progetto di tesi di dottorato Settembre 2018 “Titolo del progetto" CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DEL TUMORE DELLA MAMMELLA EREDITARIO: dall’analisi dei geni BRCA1 e BRCA2 ai pannelli multi-genici Dottorando: Aldo Germani Coordinatore: Prof. Maurizio Sorice Docenti guida: Prof.ssa Maria Rosaria Torrisi e Dott.ssa Maria Piane Sede di svolgimento del progetto di ricerca: l’U.O.C di Genetica Medica e Diagnostica Cellulare Avanzata (Azienda Ospedaliera Sant'Andrea) Razionale: La maggior parte dei tumori della mammella è sporadico, il 5-10% è ereditario e i geni ad alta penetranza BRCA1/2, giustificano solo il 10-20% dei casi di tumore della mammella/ovaio. Altri geni di suscettibilità, coinvolti nei meccanismi di Homologous Recombination (HR), sono considerati a moderata o bassa penetranza. Mutazioni in questi geni conferiscono alle cellule il profilo molecolare di HD Deficency, un fenotipo clinico/patologico simile ai tumori BRCA1/2 mutati, inclusa la sensibilità ai PARP inibitori. Scopo del progetto: valutare l’incidenza di mutazioni germinali in geni coinvolti nell’HR, mismatch repair (MR) e nel controllo del ciclo cellulare in pazienti con tumore della mammella/ovaio BRCA1/2 negative, ma con storia familiare suggestiva di tumori ereditari; comparare il fenotipo clinico e molecolare delle pazienti BRCA mutate con le pazienti con mutazioni in altri geni di suscettibilità; valutare l’utilità clinica dell’uso dei pannelli multi-genici; contribuire alla classificazione delle varianti identificate nei geni analizzati. Prima fase del progetto: selezione di pazienti non-BRCA Metodo: 1) sequenziamento massivo parallelo dei geni BRCA1/2 su piattaforma Ion Torrent PGM (Thermo Fisher), per l’analisi di mutazioni puntiformi e indels; 2) MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification) e/o MAQ (Multiplex Amplicon Quantification) per l’analisi dei riarrangiamenti genomici. Seconda fase del progetto: identificazione di mutazioni germinali nei geni dell’HR, mismatch repair e ciclo cellulare nelle pazienti negative al test BRCA Metodo:Analisi NGS con un pannello “custom” di 25 geni: APC, ATM, BARD1, BMPR1A, BRIP1, CDH1, CDK4, CDKN2A, CHEK2, EPCAM, MRE11A, MSH2, MSH6, MUTYH, NBN, PALB2, PMS2, PTEN, RAD50, RAD51C, RAD51D, SMAD4, STK11 e TP53 su piattaforma PGM Terza fase del progetto : correlazione genotipo-fenotipo nelle pazienti con mutazioni nei geni BRCA1/2 e negli altri geni analizzati; valutazione dell’utilità clinica dell’uso dei pannelli multigenici nei pazienti con tumore al seno ad esordio precoce o storia familiare significativa e classificazione delle varianti identificate nei geni analizzati. Metodo: correlazione dei dati clinici al genotipo delle pazienti; elaborazioni dei risultati dell'analisi NGS in termine di frequenza di varianti patogenetiche identificate nei geni non-BRCA; classificazione delle varianti identificate mediante l'uso di database specifici, dati di letteratura e software di predizione per la valutazione dell’impatto delle varianti identificate sulle proteine corrispondenti quali: SIFT (http://sift.jcvi.org/), Poly-Phen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/), MutationTaster (http://www.mutationtaster.org/), Align-GVGD (http://agvgd.iarc.fr/) e Human SplicingFinderFinder (http://www.umd.be/HSF3/). Verranno inoltre consultati i database dbSNP, ClinVar, gnomAD, HGMD allo scopo di verificare se la variante è stata precedentemente descritta a livello germinale. Risultati preliminari della prima fase: Nell'ambito della selezione delle pazienti non-BRCA da sottoporre alla successiva analisi NGS per i geni dell'HR, MR e ciclo cellulare sono state finora analizzate 81 donne con tumore della mammella/ovaio o appartenenti a famiglie ad alto rischio, mediante Oncomine BRCA Research Assay™ su piattaforma Ion Torrent PGM e MLPA/MAQ, CNV-NGS per l'analisi dei riarrangiamenti genomici. Analisi dei geni BRCA1/2 per mutazioni puntiformi, indels e CNVs Su 81 campioni analizzati sono state identificate 19 varianti alleliche (detection rate 23%) di cui 14 varianti patogeniche (P) (74%, 14 / 19) (una mutazione del sito di splicing, una nonsenso, una missense, 9 frameshift e tre CNVs) e 5 varianti di significato incerto (VUS) (Tabella 1).