Bioquímica Experimental I Departamento de Química e Bioquímica Licenciatura em Bioquímica Docente: Francisco Pinto Trabalho realizado por: Alexandra Salvado, nº 40267 Andreia Sousa, nº 40261 Telmo Paiva, nº 40243 PL 3 17 e 18 de Outubro de 2011 Ano Lectivo 2011/2012 Separação e Análise de componentes celulares por centrifugação Diferencial
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Gráficos obtidos - curvas de calibração................................................................ 40
Separação e Análise de Componentes Celulares
por Centrifugação Diferencial
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Resumo
A actividade laboratorial realizada teve como objectivo o isolamento de várias
fracções subcelulares a partir de um homogenato, neste caso, de fígado de porco por
centrifugação diferencial e a determinação da sua caracterização bioquímica, ou seja,
foram determinadas as actividades de dois marcadores enzimáticos: o succinato (pellet
2) e o fosfatase ácido (pellet 3) e ainda se procedeu ao doseamento de proteínas pelo
método do Biureto e ao doseamento de DNA (pellet 1).
As fracções obtidas foram a fracção nuclear (pellet 1), a mitocondrial pesada
(contém maioritariamente os mitocôndrios, pellet 2) e leve (contém maioritariamente
lisossomas, pellet 3) e uma quarta fracção contendo os restantes organelos celulares e o
citosol (fracção solúvel ou citosólica, que contém a parte solúvel da célula como as
proteínas solúveis, sobrenadante 3).
A primeira fracção recolhida foi a nuclear, na qual se procedeu ao isolamento
do DNA a fim de ser feita a determinação da sua concentração, cujo valor obtido foi de
0,289 g.mL-1
, cerca de 0,39% (m/m) presente na amostra.
Nas duas fracções seguintes, pellet 2 e pellet 3, foram determinadas as
actividades de succinato e de fosfatase ácido, respectivamente, a partir da lei de
Lambert-Beer. A actividade específica do succinato no pellet 2 foi de 0,0410 U.mg-1
e
esta foi a actividade específica mais elevada observada nesta fracção, o que era de
esperar uma vez que este enzima é específico da fracção mitocondrial. A actividade
específica de fosfatase ácido foi de 3,55×10-3
U.mg-1
para o pellet 3, que também foi a
actividade mais elevada, o que também era de esperar, pois este enzima é específico
para a avaliar a presença de lisossomas.
Através da realização de uns gráficos com as actividades de ambos os
marcadores enzimáticos, succinato e fosfatase ácido, foi possível concluir que, na
amostra de homogenato, a quantidade de mitocôndrios foi muito superior à quantidade
de lisossomas, dado que a actividade específica do enzima succinato desidrogenase foi
muito superior à actividade específica do enzima fosfatase ácido.
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Nesta actividade experimental procedeu-se, igualmente, ao doseamento de
proteínas através da aplicação do método do Biureto. Neste estudo concluiu-se que a
concentração de proteínas no homogenato era de 66,66 mg.mL-1
, no pellet 1 foi de
130,11 mg.mL-1
, no pellet 2 foi de 60,72 mg.mL-1
, no pellet 3 de 137,24 mg.mL-1
e
finalmente, no sobrenadante 3 verificou-se uma concentração proteica de 40,70
mg.mL-1
.
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Material e Métodos
Preparação do homogenato de fígado de porco e centrifugação diferencial
Material
Bisturis
Tesouras
Pinças
Homogeneizador de Potter-Elvehjem
Papel de filtro
Tubos de centrífuga
Supercentrífuga refrigerada
Soluções utilizadas
Meio de Isolamento: tampão HEPES (pH 7,4) 10 mM com sacarose 0,25
M e EDTA 1 mM
KOH 0.1 M
Tampão Tris-HCl (pH 8.0) 10 mM contendo NaCl 150 mM e EDTA 100
mM (200 mL)
Métodos
Manteve-se o copo do homogeneizador em gelo até ao fim deste processo. Moveu-se para cima e para baixo entre 5-10 vezes, durante 5 segundos cada.
Transferiu-se porções dessa mistura para um homogeneizador de Potter-Elvehjem pré-arrefecido
Pesou-se o fígado, cortou-se em pequenos pedaços e adicionou-se meio de isolamento gelado
Transferiu-se o fígado lavado para um gobelé pré-tarado
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Suspendeu-se o pellet P3, que constitui a fracção mitocondrial "leve" meio de isolamento e manteve-se em gelo. Guardou-se uma amostra para medir a absorvência
Guardou-se o sobrenadante S3
Centrifugou-se o sobrenadante S2 a 10000 x gav durante 20 minutos a 4ºC - C3
Suspendeu-se o pellet P2, que constitui a fracção mitocondria "pesada" em meio de isolamento e manteve-se em gelo. Guardou-se uma amostra para medir a absorvência
Retirou-se o sobrenadante da C2 para outros tubos de centrífuga
Centrifugou-se o sobrenadante, S1, a 3000 x gav durante 10 minutos a 4ºc (centrifugação 2 - C2)
Suspendeu-se o pellet P1 em solução tamponada Tris-HCl (pH 8,0) 10 mM; NaCl 150 mM e EDTA 100 mM. Manteve-se os tubos em gelo. Guardou-se uma amostra para
medir a absorvência
Removeu-se o sobrenadante cuidadosamente para outros tubos de centrífuga com o auxílio de uma pipeta de Pasteur
O pellet P1, obtido corresponde á fraccção nuclear. Manteve-se os tubos em gelo.
Dividiu-se o homogenato de fígado por tubos de centrífuga pré-arrefecida e centrifugou-se a 1000 x gav durante 10 minutos a 4ºC
Transferiu-se o fígado já homogeneizado para um erlenmeyer pré-arrefecido e colocado em gelo
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Nota: Todo o procedimento seguiu o protocolo, excepto a suspensão do pellet P2 e do
pellet P3, que foi efectuada em 0,5 mL de meio de isolamento. Procedeu-se desta forma,
uma vez que se usou fígado de porco em vez de fígado de rato, pelo que se diluiu
menos, de forma a não reduzir a actividade enzimática.
Determinação da actividade do succinato: citocrómo c oxidoreductase
Material
Espectrofotómetro UV-Vis
Cuvettes de plástico
Soluções utilizadas
Tampão de fosfatos (pH 7,2) 10 mM
Citocromo C 1 mM em tampão de fosfatos (pH 7,2) 10 mM
KCN 0,3 M em tampão de fosfatos (pH 7,2) 10 mM
Succinato de sódio 0,5 M em tampão de fosfatos (pH 7,2) 10 mM
Métodos
Repetiu-se o procedimento anterior para o homogenato, para as várias fracções colectadas e para o sobrenadante final
Agitou-se a mistura por inversão, tapando a cuvette com parafilm. Seguiu-se a redução do citocrómo c pelo aumento de absorvência ao longo do tempo, 1 minuto
Iniciou-se a reacção com a adição de solução de succinato 0,5 M à célula amostra
Agitou-se bem a mistura e transferiu-se quantitativamente para uma cuvette
Adicionou-se tampão de fosfatos (pH 7,2) 10 mM, solução de citocrómo c 1 mM, KCN 0,3 M e a fracção pretendida a um tubo de ensaio
Ajustou-se o zero do espectrofotómetro a 550 nm com água destilada
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Determinação da actividade do fosfatase ácido
Material
Espectrofotómetro UV-Vis
Cuvettes de plástico
Soluções utilizadas
Desoxicolato de sódio 0,5% (m/v)
Tampão acetat de sódio (pH 5,0) 0,5M
pNPP (p-nitrofenilfosfato) 10 mM
NaOH 0,5M
Métodos
Repetiu-se o procedimento para o homogenato, para as várias fracções colectadas e para o sobrenadante final
Leu-se a absorvência dos vários tubos a 400 nm, usando o conteúdo do tubo controlo como branco
Incubaram-se as amostras a 37˚C durante 10 min e pararou-se a reacção com a adição de NaOH 0,5 M
Adicionou-se a cada tubo desoxicolato de sódio 0,5% (m/v), misturou-se bem e adicionou-se tampão acetato de sódio (pH 5,0) 0,5 M
Preparou-se um tubo controlo igual aos anteriores, mas em que o volume de fracção celular foi substituído por água
Preparam-se 2 tubos de ensaio de acordo com o quadro abaixo (Quadro 1) para o homogenato, para as várias fracções colectadas e para o sobrenadante final
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Quadro 1. Doseamento da actividade do fosfatase ácido
Reagente Tubo
A B
Fracção (mL) 0,1 -
Fracção diluída ⁄ em
H2O (mL) - 0,1
Doseamento de proteínas pelo método do biureto com desoxilato
Material
Espectrofotómetro UV-Vis
Cuvettes de plástico
Soluções utilizadas
Reagente do biureto com desoxicolato
Albumina sérica bovina (BSA) 5,0 mg/mL
TCA 10% (m/v)
Métodos
Arrefeceu-se e leu-se a absorvência a 540 nm
Aqueceu-se os tubos de ensaio num banho de água fervente durante 1 min
Preparou-se uma curva-padrão para o método do biureto segundo as indicações do quadro abaixo, Quadro 2
Adicionou-se água destilada para suspender o pellet.
Centrifugou-se a 600 X g durante 7 min e decantou-se o sobrenadante
Retirou-se uma alíquota de cada fracção e adicionou-se 1 volume de TCA 10% (m/v)
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Quadro 2. Doseamento de proteína pelo método do biureto com desoxicolato.
Após se ter acertado o zero do espectrofotómetro, determinou-se a concentração de DNA na sua preparação através de absorvência a 260 nm. Registou-se também a
leitura de absorvência a 280 nm
Dissolveu-se o sedimento de DNA em solução de citrato (pH 7,0) 0,015 M contendo 0,15 M NaCl
Centrifugou-se durante 10 minutos a 600 x gav e desprezou-se o sobrenadante
Misturou-se por inversão.
Precipitou-se os ácidos núcleicos com etanol absoluto a -20ºC
Transferiu-se cuidadosamente a fase aquosa, superior, que continha os ácidos nucleicos para um tubo
Adicionou-se um volume de clorofórmio: álcool isoamílico (24:1, v/v). Tapou-se e misturou-se com cuidado durante 20 minutos
Centrifugou-se a 3500 x gav durante 10 minutos
Adicionou-se NaClO4 5 M e misturou-se cuidadosamente por inversão
Arrefeceu-se o tubo à mergulhando-o em água
Aqueceu-se a mistura num banho de água a 60ºC durante 10 minutos, continuando a agitar
Misturou-se cuidadosamente por inversão
Adicionou-se SDS 10% (v/v) ao sedimento já ressuspendido em solução tamponada Tris-HCl (pH 8,0) 10 mM, NaCl 150 mM e EDTA 100 mM
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Resultados e Discussão
Apresentação do fluxograma do esquema da centrifugação diferencial utilizado no
fraccionamento sub-celular do fígado de porco. Identificação da composição
esperada para cada fracção.
Figura 1. Esquema da centrifugação diferencial
Homogenato
Pellet 1
Fracção nuclear
Sobrenadante (S1)
Pellet 2
Fracção mitocondrial
"pesada"
Sobrenadante (S2)
Pellet 3
Fracção mitocondrial
"leve"
Sobrenadante (S3)
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Doseamento de proteínas pelo método do biureto com desoxicolato
Representação da curva de calibração de doseamento de proteína pelo método do
Biureto. Cálculo da concentração proteica do homogenato de fígado de porco e de
cada uma das fracções isoladas.
Para calcular a concentração proteica das diferentes fracções obtidas do fígado,
utilizou-se o método do biureto. O princípio do método de Biureto baseia-se na reacção
do reactivo do biureto, que é constituído por uma mistura de cobre (sulfato de cobre
pentahidratado) e hidróxido de sódio com um complexante que estabiliza o cobre em
solução, que normalmente é tartarato de sódio. Em meio alcalino, o cobre reage com
proteínas (formando um complexo com ligações peptídicas) e forma um complexo
quadrangular plano de cor roxo.
No cálculo das concentrações proteicas das fracções obtidas foi necessário
compará-las com soluções padrão. As soluções padrão são preparadas com o fim de
possuírem diferentes concentrações proteicas, conhecidas, em que foi aplicado o método
do biureto (para que se encontrem nas mesmas condições que as amostras). Através
destas soluções, sabendo a sua concentração e a que absorvência correspondem é
possível obter uma recta de calibração que permitirá obter a concentração proteica das
amostras pretendidas.
Para a construção da curva de calibração, realizaram-se três medições de
absorvência para cada uma das concentrações proteicas teóricas (Quadro 3) – ver
cálculos referentes à concentração proteica das soluções padrão em anexo.
.
Quadro 3. Concentração das soluções padrão e respectivas absorvâncias.
Tubos Concentração
proteica (mg mL-1
)
1ª medição 2ª medição 3ª medição
0 0,000 0,035 0,033 0,032
1 0,083 0,057 0,056 0,058
2 0,167 0,076 0,083 0,075
3 0,333 0,123 0,117 0,116
4 0,500 0,166 0,169 0,153
5 0,666 0,198 0,201 0,199
6 0,833 0,241 0,216 0,244
7 1,000 0,285 0,281 0,277
8 1,333 0,349 0,346 0,351
9 1,667 0,434 0,424 0,417
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Figura 2. Representação gráfica da curva de calibração de doseamento proteico pelo
método do biureto.
Com a recta de calibração obtida ( ) é agora possível medir
a concentração das fracções através das absorvências medidas, sendo que corresponde
à absorvência medida e à concentração da solução, tem-se que:
Para a medição das absorvências foram retirados a cada fracção 0,5 mL no caso
do homogenato e do pellet 1, e 0,75 mL no caso das restantes fracções (volumes
correspondentes à concentração da fracção, [fracção]). A estes volumes foi adicionado o
mesmo volume (retirado de cada fracção) de TCA 10% (m/v), ou seja, ao homogenato e
ao pellet 1 foram adicionados 0,5 mL e às restantes 0,75 mL. Após centrifugação foram
adicionados 4 mL de água, o que significa que esta solução ficou com um volume total
de 5,0 mL (solução do homogenato e pellet 1) e de 5,5 mL (soluções restantes) – a
concentração da suspensão, [suspensão], corresponde à concentração proteica deste
volume.
A 1 mL das soluções anteriores foram adicionados 2 mL de reagente do biureto
(a esta solução corresponde a concentração da solução do tubo de ensaio, [tubo de
ensaio]) e foram aquecidas num banho de água fervente durante 1 minuto.
y = 0,078x + 0,0397
R² = 0,9969
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0 0,333 0,666 0,999 1,332 1,665 1,998
Ab
sorv
ân
cia a
540 n
m
Concentração Padrão (mg mL-1)
Curva de Calibração de doseamento proteico pelo
método do biureto
Absorvância
Linear (Absorvância)
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No quadro seguinte (Quadro 4) é possível observar as concentrações referidas
anteriormente e a concentração na fracção – os cálculos necessários ao preenchimento
deste quadro encontram-se em anexo.
Quadro 4. Registo das absorvências das várias medições das fracções em que foi
aplicado o método do biureto e respectivas concentrações.