REKAYASA GENETIKA

PERAN PLASMID dalam REKAYASA GENETIKA* Sebelum membicarakan peran plasmid, kita bicarakan mengenai rekayasa genetika lebih dahulu. Rekayasa genetika ini merupakan bagian dari bioteknologi. * Apakah bioteknologi itu?

BIOTEKNOLOGIBioteknologi: gabungan teknologi modern dan biologi terapan yang bertujuan untuk meningkatkan mutu kebutuhan hidup manusia.Definisi Bioteknologi:Kegiatan pemanfaatan prinsip ilmiah dalam rekayasaKegiatan pemanfaatan aktifitas biologi dalam lingkup teknologi proses dan teknologi produksi dalam industriBioteknologi meliputi: B. Kedokteran, B. Farmasi, B. Pertanian, B. Peternakan Dll.Kita bicarakan mengenai Bioteknologi Kedokteran

BIOTEKNOLOGIBioteknologi kedokteran: upaya diagnosis, pengobatan, dan penyembuhan penyakit pada penderita.Rekayasa genetika atau teknologi DNA rekombinan merupakan primadona dalam bioteknologi.Rekayasa genetika/teknik DNA rekombinan: pembentukan rekombinan material genetik baru, yang selanjutnya dapat diturunkan ke generasi berikutnya.Dengan diketemukannya enzim restriksi, hal ini memungkinkan dilakukannya pemutusan fragmen DNA spesifik. Untuk menggandakan fragmen tersebut dalam jumlah besar, maka fragmen perlu disisipkan ke dalam suatu vektor (kendaraan yang berupa segmen DNA, yang mampu bereplikasi secara autonom).

REKAYASA GENETIKACara: Dengan menyisipkan suatu gen atau fragmen DNA (yang dihasilkan sel lain) ke dalam suatu vektor, terbentuklah rekombinan DNA. Rekombinan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam host/sel inang, sehingga memungkinkan terjadinya penggandaan gen di dalam host.Proses tersebut juga dikenal dengan sebutan gene cloning, karena organisme yang secara genetik terbentuk adalah identik, dan membawa seluruh gen atau fragmen DNA yang disisipkan, dan juga memperbanyak gen sisipan tersebut.Aspek penting dari proses ini: kemampuan menerobos barier alamiah suatu spesies dan kemungkinan dapat memperoleh dan memanipulasi gen, yang selanjutnya gen tersebut dapat menyandi suatu fungsi spesifik.

GENE CLONINGCloning: menginsersikan dan mempertahankan suatu segmen DNA ke dalam cloning vector Dua dasar penerapan gene cloning:1. Dapat melakukan isolasi dan mempelajari gen tertentu, sehingga dapat diperoleh pengertian mendalam tentang struktur, fungsi dan regulasi gen.2. Diperoleh peningkatan produksi gen spesifik.CLONE:1. Suatu populasi sel atau organisme identik secara genetik, sebagai hasil dari reproduksi aseksual, dan membentuk organisme identik secara genetik oleh adanya transplantasi nukleus. 2. Suatu populasi sel host dengan susunan DNA yang sama. 3. Menginsersikan suatu segmen DNA (gen) ke dalam suatu vektor atau kromosom host.

VEKTOR, ENZIM RESTRIKSI, & ENZIM LIGASETeknik DNA rekombinan berkaitan erat dengan penemuan berbagai vektor, enzim restriksi, dan enzim ligase.Vektor: kendaraan yang dapat dititipi/disisipi gen/fragmen DNA. Vektor yang paling umum digunakan adalah plasmid bakteri (molekul DNA sirkular yang mengandung gen resisten antibiotik) dan bakteriofag (virus bakteri).Enzim restriksi: enzim yang dapat digunakan untuk memotong nukleotida pada situs tertentuEnzim ligase: enzim yang dapat menyambung potongan-potongan atau fragmen-fragmen DNA

TAHAP-TAHAP TEKNIK DNA REKOMBINAN1. Isolasi DNA atau RNA2. Pemotongan DNA menjadi gen tunggal atau menjadi kelompokan gen3. Isolasi vektor DNA4. Penyisipan dan penyambungan gen pada vektor5. Analisis pemotongan & penyambungan gen pada vektor6. Transformasi pada host & uji transformasi

ISOLASI DNA1. Penghancuran dinding sel: a. Secara mekanik b. Secara enzimatik2. Lisis sel: disuspensikan di dalam bufer atau dalam detergen SDS, atau triton X-1003. Membersihkan debris: dengan sentrifugasi, untuk memisahkan protein dari lisat4. Presipitasi DNA dengan alkohol

PEMOTONGAN DNAPemotongan DNA dengan enzim restriksi Sifat enzim restriksi:1. Mengenal secara spesifik 4-8 pasang urutan nukleotida DNA/palindrom (dibaca dari kiri/kanan, bunyinya sama)2. Memotong DNA pada kedua untai pada tempat spesifik (recoqnition site). Contoh E. restriksi: EcoR1, memotong GAATTC, dan menghasilkan fragmen dengan ujung menggantung (sticky end) yang berguna untuk meningkatkan perlekatan sambungan antara 2 fragmen DNA (Gambar). Tidak semua enzim restriksi menghasilkan sticky end, mis.AluI menghasilkan blunt end.

Plasmid pUC19

Plasmid pUC19Plasmid pUC19 yang dipelihara dalam Escherichia coli ( E. coli), adalah vektor umum yang sering digunakan un-tuk cloning fragmen DNA yang panjangnya sampai 8 kb. Plasmid pUC19 adalah molekul DNA double stranded, sirkuler, letak di luar kromosom bakteri (extrachromo-somal), panjang 2686 bp, mengandung: suatu origin of replication; gen -galactosidase (lacZ); gen resistensi terhadap ampicillin Amp1; gen lacI yang menyandi protein represor dan meregulasi ekspresi gen lacZ; dan multiple cloning sequence yang mengandung 14 situs cloning yang unik yaitu EcoRI, SacI, KpnI, XmaI, SmaI, BamHI, XbaI, SalI, HincII, AccI, BspMI, PstI, SpbI, dan HindIII.

PENYISIPAN & PENYAMBUNGAN GEN PADA VEKTOR Isolasi vektor.Vektor yang sudah diisolasi kemudian dipotong dengan E. restriksi, mis. EcoRI. Gen disisipkan di antara tempat pemotongan vektor.Penyambungan gen yang disisipkan pada vektor dengan menggunakan enzim ligase, pada suhu 4-15 0C, selama 1 malam (Gambar).

ANALISIS PEMOTONGAN & PENYAMBUNGAN GEN PADA VEKTORAnalisis pemotongan & penyambungan gen pada vektor dengan elektroforesis gel agarosa atau poliakrilamid.Gel agarosa secara umum digunakan untuk memisah- kan fragmen DNA dengan variasi panjang dari ratusan hingga 20.000 pasang nukleotida, Sedang poliakrilamid untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih kecil.Molekul DNA bermuatan - maka dalam medan listrik akan bergerak ke elektroda +.Bila molekul DNA dengan berbagai ukuran dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel agarosa dan aliran listrik dijalankan, maka mol. DNA bergerak melalui matriks gel ke arah +. Kecepatan bergerak tergantung ukuran mol. DNA, yang lebih kecil bergerak lebih cepat & lebih jauh.

ANALISIS PEMOTONGAN & PENYAMBUNGAN GEN PADA VEKTORGel yang berisi DNA yang sudah dielektroforesis dalam waktu tertentu segera diangkat dari medan listrik, kemudian diwarnai dengan etidium bromida. Gel-DNA kemudian diamati dengan sinar UV, maka pita DNA akan berfluoresensi.Ukuran potongan DNA dibandingkan dengan ukuran kontrol.Gel agarosa juga dapat digunakan untuk isolasi fragmen DNA. Caranya dengan memotong gel yang mengandung fragmen DNA tadi, kemudian agar dihancurkan, dan DNA dipresipitasikan.

TRANSFORMASI & UJI TRANSFORMASITransformasi: adalah teknik untuk memasukkan DNA yang sudah diproses secara in vitro ke dalam suatu sel organisme.Contoh: Vektor yang sudah disisipi suatu gen, setelah dianalisis dan berhasil, dimasukkan ke dalam sel E. coli.Cara:1. Vektor bersisipan dan E. coli dicampur dalam larutan CaCl2 pada suhu 0 0C -5 0C. 2. Dilakukan heat shock (37 0C -45 0C), untuk meningkatkan frekuensi transformasi. 3. Dari pengalaman hasil uji transformasi hanya 1% populasi E. coli yang mampu mengambil DNA.

IDENTIFIKASI GEN/FRAGMEN DNA Metoda lainnya untuk identifikasi gen/fragmen DNA dapat dilakukan dengan mis. Hibridisasi.Deteksi sequence gen tertentu dapat dilakukan dengan teknik hibridisasi molekular. Hibridisasi dapat dilakukan dengan metoda Southern blotting. Teknik ini berdasarkan pada ketentuan: hibridisasi terjadi bila ssDNA dapat membentuk pasangan basa (anneal) dengan complementary single stranded DNA-nya.Sementara itu gagalnya annealing berarti keduanya tidak berkomplemen/tidak homolog/tidak cocok.

IDENTIFIKASI GEN/FRAGMEN DNAUntuk hibridisasi fragmen DNA genom seseorang (sejumlah klon gen) didigesti dengan enzim restriksi. Fragmen yang dihasilkan dipisahkan dengan elektroforesis gel, kemudian ditransfer dan difiksir pada film nitroselulosa. Hibridisasi dilakukan dengan DNA pelacak (probe/marker) yang dilabel dengan radioisotop, dan ditangkap dengan film sinar-X, sehingga klon yang mengandung sequence nukleotida homolog dengan DNA probe dapat dideteksi. Fragmen DNA/gen yang sudah diklon dapat digunakan sebagai penanda/marker/probe hibridisasi Mutasi yang ditandai oleh adanya perubahan ukuran fragmen dapat dideteksi bila dibandingkan dengan pola normal.

Complementary DNA (cDNA)Seringkali identifikasi suatu gen dimulai dengan identifikasi mRNA yang ditranskripsikan oleh gen yang bersangkutan. Untuk itu single stranded RNA dikonversi lebih dahulu menjadi double-stranded DNA dengan menggunakan enzim reverse transkriptase. Hasil konversi ini disebut complementary DNA (cDNA).

DARI MANA ASAL PROBE?Dari gen yang sudah diidentifikasi sebelumnyaDengan menggunakan cDNA. Mis. cDNA dari mRNA retikulosit (yang bila ditranslasikan akan menghasilkan hemoglobin).Dengan menggunakan pengetahuan kode genetik, oligonukleotida dapat disintesis secara kimiawi dari hasil sequencing asam-asam amino produk protein suatu gen. Dengan menyatukan beberapa oligonukleotida, akhirnya dapat didesain cDNA probe. Dengan adanya kodon degeneratif pembuatan oligonukleotida ini dilakukan dengan membuat beberapa kemungkinan. Bila tidak tersedia protein, pembuatan cDNA probe dapat dicapai dari antibodi terhadap produk gen itu.

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)PCR (polimerase chain reaction): suatu teknik yang dipergunakan untuk menggandakan sampel DNA yang jumlahnya terlalu kecil dalam ukuran nanogram, dari suatu campuran kompleks, dengan menggunakan jasa enzim DNA polimerase. Teknik ini diilhami oleh proses penggandaan/replikasi alami DNA pada setiap sel organisme yang bernukleus, dengan menggunakan enzim DNA polimerase. Enzim polimerase adalah universal, dan dihasilkan serta digunakan oleh sel organisme untuk mengadakan replikasi atau penggandaan DNA sebelum mengadakan pembelahan sel.Teknik ini memungkinkan analisis fragmen DNA tertentu tanpa harus melakukan kloning lebih dahulu.

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)1. Sintesis 2 primer oligonukleotida dengan panjang 20-35 nukleotida,berdasarkan sequence yang dikenal pada fragmen DNA.2.Kedua primer ditambahkan pada DNA genom (yang berlaku sebagai template), kemudian DNA didenaturasi untuk memisahkan kedua untai DNA, primer akan 3.Ditambahkan enzim Taq polimerase (dihasilkan oleh bakteri Thermus aquaticus yang hidup di sumber air panas), aktivitas seperti DNA polimerase, dan tahan terhadap suhu 95 0C.4. Selain itu juga ditambahkan: bahan pembangun berupa dNTP, bufer dan aquabides.

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)5. Tahap-tahap PCR: * Denaturasi:pemisahan DNA template. * Annealing: hibridisasi primer-DNA template. * Extension: elongasi/sintesis DNA. * Inkubasi 6. Dilakukan penentuan waktu: Mis. Denaturasi DNA pada suhu 94-95 0C, 30; Annealing primer pada kedua ujung segmen DNA pada suhu 50-55 0C, 30; Elongasi pada suhu 68 0C, 90, Dilakukan sebanyak 30-40 siklus . Inkubasi pada 4 0C.

VERIFIKASI HASIL PCRHasil berupa pangkat dari penambahan jumlah DNA. Jumlah material menjadi dobel pada setiap akhir siklus. Oleh karena itu pada akhir dari siklus ke 30 misalnya, fragmen DNA sudah diamplifikasi sebanyak 230 kali, atau sekitar sejuta kali. Verifikasi hasil PCR dapat dilakukan dengan elektroforesis gel, untuk visualisasi pita-pita fragmen DNA khusus.

APLIKASI PCRTidak terbatas pada deteksi perubahan nukleotida yang mengubah situs restriksi saja, (karena mutasi). Kemampuan PCR untuk menghasilkan sampel fragmen DNA tunggal yang murni, memungkin-kan hasilnya dapat digunakan untuk hibridisasi, yang memungkinkan untuk mendeteksi perbedaan nukleotida tunggal sampel DNA. Uji genetikDiagnosisKepentingan IKK

NORTHERN BLOTTINGTeknik yang digunakan untuk analisis mRNA suatu gen. Caranya sama dengan Southern blotting, hanya saja sampel berupa mRNA, dihibridisasikan dengan DNA probe.

Daftar ReferensiPasternak JJ. An Introduction to Human Molecular Genetics. 2nd ed. A John Wiley & Sons Inc. Pub. 2005. New YerseyStratchan T, Read AP. Human Molecular Genetics Bios Scientific Pub. 1996. New YorkWiley, J. Gene Cloning.