-
Makalah Rekayasa genetika
Page 1
BAB I
PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Thereronin 108 merupakan salah satu jenis asam amino yang
memiliki peran
penting dalam apoptosis protein apoptin. Menurut hipotesis yang
ada, threonin dalam
apoptin mampu menginduksi kematian sel dalam sel kanker. Untuk
mengetahui
kebenaran hipotesis tersebut, kita dapat melakukan mutasi gen
apoptin.
Mutasi gen dapat dilakukan dengan metode kloning. Pada teknik
kloning DNA,
telah diketahui bahwa terdapat cara untuk mengidentifikasi
sekuens DNA tertentu
menggunakan hasil kloning DNA tersebut. Namun teknik ini
dibatasi oleh beberapa
kondisi yang mengharuskan adanya beberapa modifikasi, seperti
modifikasi promoter
untuk memungkinkan adanya transkripsi, modifikasi untuk
keperluan pemahaman peran
suatu gen di dalam sel dan perbandingan antara gen asal dan gen
hasil kloning. Oleh
karena itu, untuk mencari hubungan antara struktur protein dan
fungsinya, kita dapat
melakukan modifikasi. Dalam memodifikasi kode genetik kita dapat
melakukan hal-hal
seperti delesi, substitusi, ataupun insersi ataupun hal-hal
lainya. Modifikasi ini dapat
digunakan untuk berbagai aplikasi salah satunya untuk
mengidentifikasi suatu basa yang
mengkode asam amino tertentu.
Untuk menganalisa thereonin, dapat dilakukan metode site
directed mutagenesis.
Dengan metode ini, kita dapat memutuskan sekuens manakah yang
akan dilakukan
mutasi. Mutasi ini harus terlebih dahulu mengetahui sekuens
basa-basa yang mengkode
protein. Melalui metode ini diharapkan mutasi suatu sisi-sisi
basa nitrogen dalam gen
dapt di mutasi dengan tepat. Pada metode ini, basa yang mengkode
thereonin 108
digantikan dengan basa yang mengkode asam amino lainnya.
Penggantian ini
menyebabkan proses apoptosis menjadi berubah sehingga diketahui
akibatnya apabila
asam amino thereonin 108 tidak terdapat dalam apoptin
(digantikan dengan asam amino
lain) dan dengan demikian kita mengetahui fungsi dari asam amino
thereonin dalam
apoptin.
I.2 Tujuan
Berikut ini merupakan tujuan dari pembuatan makalah ini:
1. Mengetahui pengaruh thereonin 108 di apoptin dalam proses
apoptosis.
2. Mengetahui mekanisme site directed mutagenesis.
-
Makalah Rekayasa genetika
Page 2
3. Mampu mendesain primer mutagenik yang digunakan dalam site
directed
mutagenesis.
I.3 Rumusan Masalah
Thereonin 108 akan dianalisa fungsinya dalam proses apoptosis.
Dengan demikian
kita akan menggantinya dengan asam amino lain. Penggantian asam
amino ini akan
mempengaruhi apoptosis sehingga kita akan mengetahui pengaruh
apakah yang
dihasilkan apabila thereonin 108 digantikan dengan asam amino
lain. Oleh karena itu hal/
masalah yang harus dipecahkan adalah:
1. Mampu menentukan kit yang akan kita gunakan dalam proses site
directed mutagenesis
ini.
2. Mengetahui letak threonin 108 dalam apoptin dan basa
nitrogennya.
3. Mampu menentukan asam amino yang akan menggantikan thereonin
108 (disesuaikan
dengan syarat-syarat yang ditentukan oleh kit yang
digunakan).
4. Mampu mendesain primer mutageniknya.
5. Mampu menjalankan mekanisme
I.4 Metode Penulisan
Dalam suatu makalah diperlukan metode penulisan yang baik dan
tersusun secara
sistematis untuk memudahkan pembaca dalam memahaminya. Metode
penulisan yang
digunakan dalam penulisan makalah ini adalah metode studi
literatur dimana sumber
yang diperoleh disesuaikan serta dikembangkan oleh penulis
mengacu kepada
permasalahan yang harus dipecahkan dan tujuan pembuatan makalah
ini. Penulis
mendapatkan sumber dari buku dan internet serta menggunakan
beberapa software
terkait.
-
Makalah Rekayasa genetika
Page 3
BAB II
ISI
II.1 Cari sistem (perusahaan tertentu) untuk Site Directed
Mutagenesis
Jawaban :
Metode mutagenesis dengan site directed atau desain rasional
memiliki
keunggulan jika dibandingkan dengan metode mutagenesis acak
(direct evolution), salah
satunya adalah kemampuan untuk memutasi gen pada titik yang
benar-benar diinginkan,
sehingga hasil yang didapat diharapkan sesuai dengan keinginan
kita tanpa harus
melakukan screening bertahap. Karena itu pula, metode site
directed memerlukan
pengetahuan yang jauh lebih mendalam tentang ilmu ikatan
protein, juga terhadap fungsi
biologis, atau struktur protein, sedangkan hal-hal tersebut
masih sangat terbatas dan
sering tidak tersedia pada masa sekarang ini. Hal ini
dikarenakan strategi desain rasional
meliputi beberapa langkah, diantaranya:
Menemukan hubungan antara struktur dan fungsi protein serta
stabilitas
molekul melalui informasi dari struktur 3D protein.
Mengidentifikasikan susunan asam amino, seperti mengetahui asam
amino
memiliki energy terendah untuk merubah struktur ikatannya.
Merancang protein/enzim dengan sifat yang diinginkan melalui
teknik
rekayasa berdasarkan penerapan/peniruan teknik mutasi alam,
sehingga dapat
dilakukan analisa terhadap interaksi antara protein-protein,
ikatan DNA,
aplikasi karakteristik antibodi, eksplorasi susunan protein,
konstruksi hybrod
protein, probing promoter dan region regulasi, serta aktivitas
enzim.
Berdasarkan syarat-syarat diatas, jika peneliti ingin membuat
desain mutasi
terarah secara manual, diperlukan bantuan superkomputer yang
sangat canggih untuk
mengkomputasi situs spesifik mutasi pada vektor dan waktu yang
lama karena banyaknya
librari pada mutan yang dihasilkan, selain itu jika menggunakan
metode trial and error,
jika gagal maka harus memulai lagi proses mutagenesis dari awal
dan memakan biaya
yang besar.
-
Makalah Rekayasa genetika
Page 4
Gambar 1. Perbedaan skema proses antara RD dan DE
(Sumber:
http://io.ppijepang.org/j/files/Inovasi-Vol19-1-Jul2011.pdf)
Karenanya, kelompok kami memilih untuk menggunakan
QuikChange
Site-
Directed Mutagenesis Kit dari perusahaan Stratagene dari
California, Amerika Serikat
karena efisiensinya yang mencapai lebih dari 80%. Mutagenesis
kit ini dapat digunakan
untuk proses mutasi situs spesifik pada plasmid untai ganda
tanpa harus menyediakan
vektor spesifik, situs restriksi tertentu, atau transformasi
berkali-kali, sehingga
protokolnya sangat simple dan mudah digunakan. Mutagenesis kit
ini dapat digunakan
untuk mutasi titik, menukar asam amino, dan delesi maupun
insersi asam amino tunggal
maupun majemuk dan digunakan dengan alat bernama PfuTurbo
DNA polymerase dan
cycler suhu. PfuTurbo
DNA polymerase dapat mereplikasi kedua untai plasmid dengan
ketepatan yang tinggi dan tidak mengganggu primer
oligonukleotida mutan.
Material yang disediakan oleh QuikChange
Site-Directed Mutagenesis Kit
berikut spesifikasinya adalah sebagai berikut:
-
Makalah Rekayasa genetika
Page 5
Tabel 1. Spesifikasi Quick Change Site Directed Mutagenesis
Kit
Bahan-bahan yang Disediakan
Kuantitas
Catalog #200518
30 reactions
Catalog #200519
10 reactions
PfuTurbo DNA polymerase (2.5 U/ l) 80 U 25 U
10 reaction buffer 500 l 500 l
Dpn I restriction enzyme (10 U/l) 300 U 100 U
Oligonucleotide control primer #1 [34-mer (100
ng/l)]
5` CCA TGA TTA CGC CAA GCG CGC AAT
TAA CCC TCA C 3`
750 ng 750 ng
Oligonucleotide control primer #2 [34-mer (100
ng/l)]
5` GTG AGG GTT AAT TGC GCG CTT GGC
GTA ATC ATG G 3`
750 ng 750 ng
pWhitescriptTM 4.5-kb control plasmid (5 ng/
l) 50 ng 50 ng
dNTP mix 30 l 10 l
XL1-Blue supercompetent cells (blue tubes) 8 200 l 3 200 l
pUC18 control plasmid (0.1 ng/l in TE
bufferc) 10 l 10 l
(Sumber: QuikChange
Site-Directed Mutagenesis Kit Instruction Manual, Catalog
#200518 (30
reactions) and #200519 (10 reactions) Revision A.01)
QuikChange
Site-Directed Mutagenesis Kit (Katalog #200518) mengandung
reagen
yang cukup untuk total 30 reaksi, dengan 5 reaksi control.
QuikChange
Site-Directed Mutagenesis Kit (Katalog #200519) mengandung
reagen
-
Makalah Rekayasa genetika
Page 6
yang cukup untuk total 10 reaksi, dengan 5 reaksi control.
10x reaction buffer mengandung: 100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4 200
mM Tris-
HCl (pH 8.8), 20 mM MgSO4, 1% Triton
X-100, 1 mG/ml nuclease-free bovine
serum albumin (BSA).
Campuran dNTP hanya boleh dilelehkan sekali dan disiapkan untuk
ukuran sekali
pakai dan disimpan dalam suhu -20C dan tidak boleh
dibeku-lelehkan berulan-ulang.
Komposisi dNTP merupakan hak milik perusahaan Stratagene dan
tidak boleh diganti
dengan dNTP lainnya.
Genotipe XL1-Blue supercompetent cells: recA1 endA1 gyrA96 thi-1
hsdR17 supE44
relA1 lac [F proAB lacIqZM15 Tn10 (Tetr)]
Kondisi penyimpanan yang tepat adalah sebagai berikut:
XL1-Blue Supercompetent Cells and pUC18 Control Plasmid: 80C
All Other Components: 20C
Materi lain yang diperlukan:
14-ml BD Falcon polypropylene round-bottom tubes (BD Biosciences
Catalog
#352059)
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactopyranoside (X-gal)
Isopropyl-1-thio--D-galactopyranoside (IPTG)
Prosedur dasarnya ialah memanfaatkan vektor DNA beruntai ganda
(dsDNA)
yang bergelung sedemikian rupa (supercoiled) dengan insert gen
yan diinginkan dan dua
primer oligonukleotida sintetik yang mengandung mutasi yang
diinginkan. Primer-primer
oligonukleotida tersebut, yang masing-masing berkomplementer
dengan untai
seberangnya pada vektor, diperpanjang selama suhu disirkulasikan
oleh PfuTurbo
DNA
polymerase. Inkorporasi primer oligonukleotida menghasilkan
plasmid bermutasi yang
mengandung staggered nicks.
-
Makalah Rekayasa genetika
Page 7
Gambar 2. Staggered Nicks
(Sumber:
http://www.memrise.com/mem/1111853/replicative-transposition-mechanism/)
Mengikuti sirkulasi suhu, produk diintroduksikan dengan DPN I
endonuklease
(sekuens target: 5`-Gm6ATC-3`) yang spesifik untuk DNA
termetilasi dan
terhemimetilasi, digunakan untuk mencerna template DNA parental
dan menyeleksi DNA
sintesis yang mengandung gen termutasi. DNA yang diisolasi dari
hampir semua strain E.
coli adalah dam termetilasi, karenanya mereka akan menjadi peka
terhadap digesti DPN I.
Plasmid DNA yang diisolasi dari hampir semua strain E. coli yang
biasanya dipakai
(dam+) sudah termetilasi dan merupakan template yang sesuai
untuk mutagenesis,
sedangkan plasmid DNA yang diisolasi dari strain E. coli
pengecualian (dam-), termasuk
JM110 dan SCS110, tidak sesuai.
DNA vektor terpotong yang yang mengandung hasil mutasi yang
diinginkan
kemudian ditransformasi ke dalam sel supercompetent XL1Blue.
Starting DNA template
dalam jumlah kecil yang diperlukan untuk melakukan metode ini,
ketepatan yang tinggi
dari PfuTurbo DNA polymerase, dan siklus suhu dalam jumlah
kecil, semua ini
berkontribusi terhadap efisiensi mutasi yang tinggi dan
penurunan potensi untuk
menghasilkan mutasi acak selama reaksi.
Plasmid kontrol pWhitescriptTM 4.5-kb digunakan untuk menguji
efisiensi
generasi plasmid mutan menggunakan QuikChange
Site-Directed Mutagenesis Kit.
Plasmid kontrol pWhitescript 4.5-kb mengandung kodon stop (TAA)
pada posisi dimana
kodon glutamin (CAA) biasanya muncul dalam gen -galaktosidase
dari phagemid
pBluescript II SK(-) (sesuai dengan asam amino dari 9 protein).
Sel supercompetent
XL1-Blue yang ditransformasi dengan plasmid kontrol ini akan
tampak putih di plate
agar LB-ampicillin (yang akan dijelaskan pada nomor berikutnya)
karena mengandung
IPTG dan X-gal, karena aktivitas -galaktosidase telah
dihapuskan. Primer kontrol
oligonukleotida (Oligonucleotide control primer) akan membuat
mutasi titik tertentu pada
-
Makalah Rekayasa genetika
Page 8
plasmid kontrol pWhitescript 4.5-kb yang mengubah residu T dari
kodon stop (TAA)
pada asam amino 9 dari gen -galaktosidase dengan residu C, untuk
menghasilkan kodon
glutamin (CAA) yang ditemukan dalam sekuens wild type. Setelah
transformasi, koloni
dapat di-screening untuk fenotipe -galaktosidase ( - gal+,
biru). Penjelasan lebih
mendalam mengenai proses mutasi site directed akan dijelaskan
pada bagian berikutnya.
II.2 Cari gen apoptin
Jawaban :
Berikut ini merupakan asam amino gen apoptin beserta urutan basa
nitrogennya, yaitu
setelah EcoRI sampai sebelum Kodon Stop:
Gambar 3. Asam amino gen apoptin beserta urutan basa
nitrogennya
II. 3 Tentukan dimana letak posisi threonin 108
Jawaban :
Threonin 108 terletak pada asam amino gen apoptin ke 108 (yang
ditunjukkan oleh anak
panah hitam pada gambar di bawah)
-
Makalah Rekayasa genetika
Page 9
Gambar 4. Threonin, asam amino apoptin ke 108
dimana urutan basa threonin 108 terletak pada urutan ke
322-324.
Gambar 5. Basa nitrogen threonin 108
Berdasarkan gambar tersebut, kita mengetahui bahwa basa nitrogen
thereonin 108 yaitu
ACT.
II. 4 Tentukan pengganti asam amino threonin 108
Jawaban :
Untuk membuktikan apakah benar bahwa asam amino threonin
berpengaruh pada
fungsi apoptin sebagai penginduksi kematian sel pada sel kanker,
kita akan mengganti
asam amino threonin 108 dengan asam amino lain. Pemilihan asam
amino pengganti
thereonin dilakukan secara acak sesuai dengan metode mutagenesis
yang kami gunakan.
Pada akhirnya, kita akan melihat perbedaan hasil yang
ditunjukkan ketika tidak terdapat
asam amino thereonin 108 dalam gen apoptin tersebut.
-
Makalah Rekayasa genetika
Page 10
Asam amino yang kami gunakan adalah arginin. Kami memilih asam
amino ini
karena metode mutagenesis yang kami pilih memanfaatkan teknologi
PCR dalam proses
mutasinya, dimana dalam metode yang kami pilih ini, kami akan
membuat primer untuk
memutasi suatu plasmid. Sarat dari primer untuk metode yang kami
pilih adalah
mengandung minimal 40% basa nitrogen Guanine dan Cytocine
sehingga kami memilih
asam amino arginin yang memiliki basa nitrogen CGC. Adanya
arginin dalam primer
yang akan dimutasi akan memperbesar presentasi Guanine dan
Cytocine dalam primer
sehingga kemungkinan keberhasilan mutagenesis akan lebih
besar.
II. 5 Dibuat primer untuk site directed mutagenesis sesuai
dengan sistemnya
Jawaban :
Mekanisme site directed mutagenesis untuk memutasi gen apoptin
tersebut dapat
diilustrasikan pada gambar di bawah.
-
Makalah Rekayasa genetika
Page 11
Gambar 6. Mekanisme Site Directed Mutagenesis
Ada 4 tahap yang dilakukan, yaitu isolasi plasmid yang berisi
gen dengan sisi
target yang akan dimutasi, temperature cycling (mendenaturasi
plasmid) lalu
memperpanjang dan menggabungkan primer mutagenik, digesti
metilase, dan
transformasi untai sirkular tersebut.
Dengan demikian yang akan kita lakukan adalah mendesain primer
mutageniknya.
Di sini kami mendesain dua primer berdasarkan fungsinya, primer
pertama adalah untuk
mendelesi asam amino thereonin 108 dan primer kedua untuk
mengganti asam amino
thereonin dengan asam amino arginin.
Terdapat dua jenis primer yang didesain yaitu primer forward dan
primer reverse.
Primer-primer tersebut akan di-annealing di daerah plasmid yang
terdapat asam amino
-
Makalah Rekayasa genetika
Page 12
thereonin 108. Oleh karena itu kita terlebih dahulu harus
mengetahui urutan basa nitrogen
di daerah dekat basa nitrogen untuk asam amino thereonon 108.
Urutan basa nitrogennya
adalah:
5 3
AGC TTG ATT ACC ACT ACT CCC AGC CGA CCC CGA
Primer mutagenik dimana basa threonin (ACT) digantikan dengan
basa arginin (CGC)
adalah sebagai berikut:
Primer forward primer mutageniknya yaitu:
5 3
AGC TTG ATT ACC ACT CGC CCC AGC CGA CCC CGA
Primer reverse primer mutageniknya yaitu:
5 3
TCG GGG TCG GCT GGG GCG AGT GGT AAT CAA GCT
II. 6 Ikuti langkah-langkah pada sistem no. 1
Jawaban :
Secara garis besar, tahapan untuk memutasi Threonin 108 yang
berada dalam
apoptin menggunakan Quick Change- Site Directed Mutagenesis Kit
digambarkan oleh
diagram alir di bawah ini :
Gambar 7. Diagram alir mutasi menggunakan Quick Change- SDM
Kit
Menyisipkan gen apoptin dalam plasmid
(Pembahasan Bab Sebelumnya)
Mengisolasi plasmid yang telah mengandung gen
apotin dari strain E Coli dam+ dan termetilasi
Mendesign primer untuk mutasi threonin 108 sesuai dengan Quick
Change- Site Directed Mutagenesis Kit
Thermal Cycling (PCR)
Reaksi Sintesis DNA mutan dengan menggunakan primer yang di
design untuk mutasi
Digestion plasmid asal (wild type)
menggunakan Dpn I
Transformasi plasmid ke XL1-Blue
Supercompetent Cells
Color Screening
Elektroforesis
-
Makalah Rekayasa genetika
Page 13
Isolasi Plasmid yang Mengandung Gen Apoptin
Plasmid yang telah mengandung apoptin diisolasi dari sel host
dan akan dijadikan
bahan untuk mutasi threonin 108. Mutasi threonin 108 bertujuan
untuk meneliti aktivitas
apoptosis jika asam amino threonin 108 tersebut di mutasi.
Gambar 8. Plasmid yang telah mengandung apoptin dan threonin 108
sebagai target mutasi
Plasmid-apoptin ini lebih baik diisolasi dari strain E Coli dam+
yang telah termetilasi.
Salah satu contoh strain E Coli dam+ adalah DH5. Tujuan dari
pemilihan plasmid yang
termetilasi agar setelah proses mutasi dengan thermal cycling,
plasmid wild type yang
masih termetilasi akan terdigesti oleh enzim Dpn I, sedangkan
plasmid yang
termutagenesis akan bertahan.
Design Primer untuk Mutasi Threonin 108 (ACT)
Dalam Quick Change- Site Directed Mutagenesis Kit, design primer
harus
memenuhi kriteria :
Kedua primer mutagenesis harus mengandung sequence mutasi yang
diinginkan dan
menempel pada sequence yang sama dalam strand yang berbeda dari
plasmid.
Gambar 9. Primer mutagenesis dalam sequence yang sama di strand
yang berbeda
Panjang primer harus diantara 25 45 pasang basa dengan melting
temperature (Tm)
78 . Tm primer dalam Quick Change- Site Directed Mutagenesis Kit
dapat
dihitung dengan menggunakan kalkulator Tm yang disediakan online
oleh
www.stratagene.com atau menggunakan rumus seperti di bawah ini
:
Keterangan :
Target yang akan dimutasi
-
Makalah Rekayasa genetika
Page 14
N jumlah basa
Mismatch basa yang akan tidak cocok dengan template
Sequence mutasi yang diinginkan harus berada di tengah primer
dengan 10-15 basa
yang sesuai di kedua sisinya.
Primer yang optimal memiliki kandungan GC minimum 40%
Dari kriteria tersebut, kelompok kami mendesain primer mutagenik
untuk threonin 108
sebagai berikut :
Forward 5 AGC TTG ATT ACC ACT CGC CCC AGC CGA CCC CGA 3
Tm = 78.0 , Bases = 33, GC content = 63.6%, mismatched bases =
3
Reverse 5 TCG GGG TCG GCT GGG GCG AGT GGT AAT CAA GCT 3
Tm = 78.0, Bases = 33, GC content = 63.6%, mismatched bases =
3
Primer mutagenik yang telah kami desain memenuhi keempat
kriteria dari Quick Change-
Site Directed Mutagenesis Kit dan dalam primer threonin 108
telah diubah dengan
arginine yang ditandai warna hijau.
Thermal Cycling (PCR)
Proses untuk perbanyakan yang dipakai dalam kit ini adalah
thermal cycling.
Stratagene merekomendasikan untuk memakai dinding tabung tipis
yang ideal untuk
kontak dengan panas. Thermal cycling yang akan dilakukan untuk
dua jenis yaitu sintesis
plasmid yang mutagenik dan plasmid kontrol. Bahan-bahan yang
dipakai dalam proses
thermal cycling adalah :
Tabel 2. Bahan untuk proses Thermal Cycling
Bahan
Reaksi untuk Sintesis Plasmid
Mutagenik Reaksi untuk Plasmid Control
1 l of PfuTurbo DNA polymerase (2.5 U/l)
-
Makalah Rekayasa genetika
Page 15
Primer yang dipakai untuk reaksi sintesis plasmid mutagenik
adalah primer yang
telah kami rancang sebelumnya, sedangkan primer untuk reaksi
plasmid kontrol adalah
primer yang sudah disediakan dalam Quick Change- Site Directed
Mutagenesis Kit
sekaligus control plasmid plasmidnya (pWhitescript 4.5kb). Di
bawah ini merupakan
proses thermal cycling dalam reaksi sintesis plasmid
mutagenik.
Gambar 10. Proses sintesis plasmid mutagenik menggunakan thermal
cycling
Jika thermal cycling yang ada tidak disusun hot top/ hot start,
maka di lapisan atas
ditambahkan 30 l minyak agar polimerase tidak langsung bercampur
di awal
(denaturasi). Waktu reaksi thermal cycling adalah sebagai
berikut :
-
Makalah Rekayasa genetika
Page 16
Tabel 3. Waktu reaksi dalam thermal cycling menggunakan Quick
Change- Site Directed
Mutagenesis Kit
Sedangkan untuk sintesis plasmid mutagenik, kita harus memilih
banyaknya daur yang
sesuai. Dalam hal ini, mutasi yang kita lakukan adalah mengubah
satu asam amino yaitu
threonin 108 menjadi asam amino lain. Sehingga daur yang
dibutuhkan untuk thermal
cyling adalah 16.
Tabel 4. Daur untuk sintesis plasmid mutagenik
Setelah proses thermal cycling, dapat dilakukan uji terlebih
dahulu dengan elektroforesis
dan dapat juga langsung ke treatment selanjutnya yaitu seleksi
plasmid yang termutasi
dengan plasmid wild type. Plasmid yang termutasi dari proses
thermal cycling ini
menghasilkan ujung nick dan tidak termetilasi. Seleksi
berdasarkan metilasi pada plasmid
yang disediakan oleh kit adalah menggunakan enzim DpnI yang akan
dijelaskan lebih
lanjut.
Digestion Plasmid Wild Type menggunakan DpnI
Plasmid awal (Wild type) yang diambil dari strain Ecoli dam+
memiliki strand
yang termetilasi. Sedangkan plasmid mutagenik yang tersintesis
sebelumnya sudah tidak
termetilasi. Cara untuk menyeleksi antara plasmid wild type
dengan plasmid mutagenik
adalah dengan cara menambahkan enzim DpnI. Enzim DpnI berfungsi
memotong/
menghancurkan DNA dam termetilasi sehingga plasmid wild type
akan dihancurkan oleh
enzim ini dan plasmid yang termutagenesis bertahan hidup. Dalam
kit ini, DpnI
ditambahkan sebanyak 1L (10U/L) langsung untuk setiap reaksi
amplifikasi. Campur
-
Makalah Rekayasa genetika
Page 17
larutan tersebut dengan cara mem-pipet ke atas dan ke bawah
berulang-ulang kali. Setelah
itu disentrifugasi dan diinkubasi dalam suhu 37 selama 1
jam.
Transformasi ke Dalam XL1-Blue Supercompetent Cells
Setelah di seleksi dengan DpnI, telah terpilih plasmid-plasmid
yang termutasi.
Plasmid ini akan ditransformasikan ke dalam host cell yang
disediakan kit yaitu XL1-
Blue Supercompetent Cells. Plasmid yang dimasukkan ke dalam
XL1-Blue
Supercompetent Cells tidak hanya plasmid yang lolos seleksi dari
treatment DpnI, namun
juga plasmid control pWhitescript untuk dilihat efisiensi nya
dengan menggunakan
screening (yang akan dijelaskan selanjutnya). Selain itu, ujung
nick DNA yang termutasi
akan di perbaiki oleh sel host .
Gambar 11. Ujung nick yang diperbaiki oleh sel host
Transformasi yang digunakan sesuai manual book kit ini adalah
heat shock,
berikut tahap-tahap transformasi plasmid mutagenik dan plasmid
control ke dalam XL1-
Blue Supercompetent Cells :
1. Melakukan thawing sel host yang disimpan dalam suhu -80,
untuk setiap reaksi
plasmid mutagenik dan kontrol yang akan ditransformasi, cairkan
50L sel host dalam
falcon 14 mL.
2. Memindahkan DNA yang sudah di treatment dengan DpnI dan
plasmid sample ke
dalam larutan sel host yang berbeda dan diinkubasi di es selama
30 menit.
3. Transformasi dengan heat shock 42 selama 45 menit, setelah
itu dimasukkan
kembali ke dalam es selama 2 menit.
4. Tambahkan 0,5ml NZY broth pada sel host yang belum dipanaskan
dan transformasi
dengan inkubasi dan disentrifuge 225-250rpm.
5. Setelah transformasi, letakkan plasmid di medium LB-ampicilin
plates sesuai
komposisi (di bawah) dan diinkubasi 37 > 16 jam
-
Makalah Rekayasa genetika
Page 18
Tabel 5. Komposisi medium LB-ampicilin plates
Screening
Untuk menyiapkan LB agar plates untuk bluewhite color screening,
tambahkan
80 g/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactopyranoside (X-gal),
20 mM isopropyl-
1-thio--D-galactopyranoside (IPTG), dan antibiotic yang sesuai
ke dalam LB agar.
Selanjtnya, 100 l of 10 mM IPTG and 100 l 2% X-gal disebar di
atas LB agar plates 30
menit sebelum transformasi. Menyiapkan IPTG pada dH2O steril,
X-gal dalam
dimethylformamide (DMF). Jangan campur IPTG dan X-gal sebelum
dicampurkan dalam
plates karena akan terpresipitasi.
pWhitescript 4.5-kb plasmid kontrol digunakan untuk menguji
efisiensi
generasi plasmid mutagenik dalam QuikChange site-directed
mutagenesis kit ini.
pWhitescript 4.5-kb plasmid kontrol mengandung kodon stop (TAA)
di posisi kodon
glutamine berada (CAA) yang pada keadaan normal terdapat pada
gen -galactosidase
(asam amino ke-9) pBluescript II SK() phagemid. Plamid kontrol
ini ditransformasi ke
dalam XL1-Blue supercompetent cells dan ketika diletakkan dalam
LBampicillin agar
plates yang mengandung IPTG and X-gal akan berwarna putih,
karena akivitas -
galactosidase telah dihapus dengan adanya penggantian CAA
menjadi TAA. Namun,
primer oligonucleotide control yang membuat titik mutasi pada
pWhitescript 4.5-kb yang
akan mengubah kembali basa residu T pada stop kodon (TAA) di
asam amino ke-9 gen -
galactosidase menjadi basa residu C, dan menghasilkan kodon
glutamine (CAA) yang
ditemukan dalam wild sequence. Sehingga, koloni yang termutasi
ini akan terdeteksi
screened -galactosidase (-gal+, blue) dengan warna biru.
Sehingga dapat disimpulkan, jika mutasi berjalan dengan baik,
maka koloni yang
berwarna biru akan lebih banyak dibandingkan dengan koloni yang
berwarna putih. Hal
ini dikarenakan mutasi residu T berhasil berubah menjadi C dalam
Quick Change- Site
Directed Mutagenesis Kit ini sehingga menghasilkan banyak koloni
wild type yang
-
Makalah Rekayasa genetika
Page 19
memiliki aktivitas -galactosidase dan menghasilkan warna biru.
Tingkat keberhasilan
mutasi pada kontrol plasmid mewakilkan keberhasilan mutasi
threonin 108 pada plasmid
apoptin menggunakan Quick Change- Site Directed Mutagenesis Kit
ini.
-
Makalah Rekayasa genetika
Page 20
BAB III
PENUTUP
Beberapa kesimpulan yang dapat diambil dari pembahasan dalam
makalah ini adalah sebagai
berikut :
1. Metode mutagenesis dengan site directed atau desain rasional
memiliki keunggulan
jika dibandingkan dengan metode mutagenesis acak (direct
evolution), salah satunya
adalah kemampuan untuk memutasi gen pada titik yang benar-benar
diinginkan,
sehingga hasil yang didapat diharapkan sesuai dengan keinginan
kita.
2. Kelompok kami memilih untuk menggunakan QuikChange
Site-Directed
Mutagenesis Kit dari perusahaan Stratagene dari California,
Amerika Serikat karena
efisiensinya yang mencapai lebih dari 80%.
3. Basa nitrogen thereonin 108 adalah ACT.
4. Asam amino yang digunakan sebagai pengganti adalah arginin
karena syarat dari
primer untuk metode yang kami pilih adalah mengandung minimal
40% basa nitrogen
Guanine dan Cytocine sehingga dipilihlah asam amino arginin yang
memiliki basa
nitrogen CGC.
5. Primer forward primer mutageniknya yaitu:
5 3
AGC TTG ATT ACC ACT CGC CCC AGC CGA CCC CGA
6. Primer reverse primer mutageniknya yaitu:
5 3
TCG GGG TCG GCT GGG GCG AGT GGT AAT CAA GCT