-
Universitatea POLITEHNICA din Bucureti
Splaiul Independenei nr. 313, Bucureti RO-060042, ROMNIA
Tel. + 4021 402094064; Fax. +4021 318 10 03
www.upb.ro
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic
Referat de doctorat
Dobos Alpr
Coordonator tiinific:
Prof. Dr. Ing. Lnyi Szabolcs
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
2
Cuprins
1 Introducere
..........................................................................................................................
3
2 Obiectivele cercetrii
..........................................................................................................
4
3 Studiu bibliografic
..............................................................................................................
5
3.1 1,4-Butandiol
...............................................................................................................
5
3.2 Biologia sistemic i ingineria metabolic
..................................................................
6
3.3 Pasurile generale n ingineria metabolic a organismelor
........................................... 9
3.4 Programe pentru preconizarea cilor metabolice i pentru
construirea modelelor ... 12
3.5 Modele metabolice folosite n ingineria metabolic
................................................. 14
3.6 Metoda OptStrain
......................................................................................................
15
3.7 Analiza fluxurilor
......................................................................................................
17
3.8 Programul OptFlux
....................................................................................................
21
4 Metode i materiale
..........................................................................................................
22
4.1 Ci pentru producerea de 2,3-butandiol
....................................................................
22
5 Rezultate i discuii
...........................................................................................................
30
6 Bibliografie
.......................................................................................................................
49
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
3
1 Introducere
1,4-Butandiol este un produs chimic important la producerea
polimerilor, iar n momentul de
fa producerea lui se bazeaz pe industria petrolier, mpreun cu
acetilen, butan,
propilen,butadien etc. Consumul anual de 1,4-butandiol este mai
mult de 2,5 milioane de
tone, producerea lui din produse petroliere nu este fezabil i
sustenabil [1].
ntre factorii care duc la concluzia c tehnologia pentru
producerea de 1,4-butandiol trebuie
s fie schimbat se afl creterea constant a preului produselor
petroliere i creterea
emisiilor de gaze cu efect de ser. O alternativ a cilor de
producere convenionale ar fi
producerea de 1,4-butandiol din biomas. Balana emisiilor de gaze
cu efect de ser devine
mai favorabil cnd 1,4-butandiol este produs din biomas, aceste
fiind absorbite via
fotosintez, i costul biomasei este semnificativ inferior fa de
produse petroliere [2].
Niciuna dintre microorganisme cunoscute nu produc 1,4-butandiol,
astfel microorganismele
trebuie s fie modificate prin ingineria metabolic pentru a
atinge scopul propus [1].
Primele ncercri au constat din dou trepte: producerea acidului
succinic din biomas (zahr
provenit din biomas) prin fermentare, dup care producerea de
1,4-butandiol din acid
succinic folosind metode convenionale. ncercrile cel mai recente
au avut ca scop
fermentarea direct de 1,4-butandiol din zahr [2].
Fermentarea direct de 1,4-butandiol necesit identificarea noilor
ci metabolice, producerea
lui este inexistent n natur, astfel nu exist nici o cale
metabolic complet. Pentru
identificarea cilor metabolice, modele matematice trebuie s fie
folosite. Rezultatul
modelrii este un set de ci care n teorie ar duce la
1,4-butandiol, iar dintre aceste variaii
trebuie s fie selectate cele mai optime, baznd pe numrul
pasurilor metabolice, randamentul
procesului, criterii termodinamice, etc. Variaiile selectate
apoi trebuie s fie experimentate n
laborator, variaia care funcioneaz i are cel mai mare randament
este soluia la problem
[1]. Cercetrile n domeniu exist, variaia cel mai fezabil a fost
patentat de o firm
american, GENOMATICA, care este specializat n producerea
produselor petroliere prin
procese biologice. Ei vor nfiina o firm cu o capacitate de 18000
tone pe an pentru
producerea de 1,4-butandiol prin fermentare [3].
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
4
ns tehnologia cercetat exist, tema rmne deschis, ar putea exista
posibiliti de
optimizare i identificare a cilor cu randament mai mare.
Tehnologia poate fi adaptat la
diferite condiii geografice ct i la diferite substraturi de
intrare.
2 Obiectivele cercetrii
Obiectivul global al cercetrii este producerea de 1,4-butandiol
prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate prin ingineria metabolic:
identificarea cilor noi, analiza
cilor identificate de ctre firma Genomatica, alegerea celor mai
potrivite ci, identificarea
enzimelor care particip n lanul de reacii, modelarea
computaional a procesului
biochimic, planificarea vectorului i implementarea procesului n
laborator.
Obiectivul referatului este analiza literaturii n domeniu. Exist
diferite metode pentru
modelarea cilor metabolice i pentru preconizarea cilor care ar
duce la un produs de interes.
Scopul principal a studiului este analiza metodelor existente,
identificarea i cunoaterea
funcionrii programelor n domeniu.
O evaluare preliminar a programelor i a metodelor disponibile va
fi fcut pentru
verificarea capabilitii lor pentru a identifica ci metabolice
pentru producerea de 2,3-
butandiol. Scopul la faza asta este inventarierea programelor n
domeniu, dei nu am ales
identificarea cilor pentru producerea de 1,4-butandiol, care
este o sarcin mult mai
complicat, aceste ci nu pot fi gsite la nici una dintre
organismele cunoscute n momentul
de fa, nu ca i n cazul 2,3-butandiolului, care este prezent la
diverse organisme.
Substratul cel mai obinuit pentru producerea butandiolului este
glucoza provenit din
agricultur, cea ce impune problema creterii preurilor de mncare.
Concurena ntre
alimentaia populaiei i asigurarea materialelor prime pentru
industrie ar putea deveni o
problem. Pentru evitarea acestuia am decis s folosim glucoza
produs din deeuri i
glicerol, cea ce este un produs secundar la producerea
biodieselului.
Deeurile conin o cantitate mare de celuloz care poate fi
transformat n glucoz prin cale
biologic [4]. n deeuri este disponibil o cantitate mai mare de
celuloz dect n amidon,
care se afl n cantiti mai mari n plante industriale sau
alimentare. Amidonul se afl n
condiie relativ pur, n comparaie cu celuloz, care este mixat cu
lignin care se
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
5
descompune mai greu. Celuloza nu este uor de transformat n
glucoz, dar nu este imposibil,
o varietate de enzime sunt necesare pentru realizarea
procesului.
Biodieselul se formeaz prin transesterificarea lipidelor cu
alcool, formndu-se glicerol ca
produs secundar conform reaciei de mai jos.
Figura 1: Reacia de formare a biodieselului [5]
Glicerolul a devenit un produs secundar ieftin, la fiecare 100 L
de biodiesel produs se
formeaz inevitabil 10 L de glicerol. Dezvoltarea intens a
industriei de biodiesel rezult un
surplus semnificativ de glicerol micornd preurile. Aceast
reducere a preurilor este o
problem pentru industria de glicerol, la fel i pentru industria
de biodiesel. Conversia
glicerolului la un produs cu un pre mai mare este o soluie
promitoare [6].
3 Studiu bibliografic
3.1 1,4-Butandiol
1,4-Butandiol este un lichid necolorat, derivat din butan prin
punerea grupelor de alcool la
fiecare capt a lanului. Este una dintre cele patru izomere
stabile a butandiolului.
Figura 2: Molecula de 1,4 butandiol [7]
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
6
1,4-butandiol este folosit ca solvent la lichide de curire
industriale, de exemplu
tetrahidrofuran, este folosit i la producerea plasticelor, de
exemplu polibutilen tereftalat,
fibre, poliuretane. Majoritatea productorilor, cum sunt BASF,
DuPont, Linde i
LyondellBasel, pentru producerea de 1,4-butandiol folosesc o
varietate de procese
nesustenabile, bazate pe petrochimie[8].
Procesul cel mai vechi pentru producerea de 1,4-butandiol este
procesul Reppe, n care
acetilena reacioneaz cu dou molecule de formaldehid formnd
1,4-butandiol. n 1990
LyondellBasel a dezvoltat un proces fr acetilen. Procesul ncepe
cu conversia oxiduli de
propilen n alcool alilic. Prin hidroformilare, alcoolul alilic
se transform n 4-
hidroxibutiraldehid, care este hidrogenat n 1,4-butandiol. Exist
i alte procese pentru
producere de 1,4-butandiol bazate pe butadien, acetat de alil i
acid succinic, dar aceste
procese au produse secundare care au efect negativ asupra
mediului [8].
Dependena producerii de 1,4-butandiol de produse petroliere a
forat dezvoltarea metodelor
sustenabile prin fermentare cu ajutorul microorganismelor.
Primele ncercri au avut dou
trepte: producerea acidului succinic prin fermentare, apoi
transformarea acestuia n dimetil
ester i n final n 1,4-butandiol. Conform metodelor cele mai
recente, este posibil i
producerea direct de 1,4-butandiol prin fermentare. Metoda asta
va fi relatat n continuare.
Tabel 1: proprietile de 1,4 butandiol [7]
Formula molecular C4H10O2
Mas molecular 90,12 g/mol
Densitate 1,0171 g/cm3 (20 C)
Punct de topire 20,1 C
Punct de fierbere 235 C
Solubilitate n ap Miscibil
Solubilitate n etanol Solubil
3.2 Biologia sistemic i ingineria metabolic
Biologia sistemic asigur un cadru pentru construirea modelelor
sistemelor biologice. De la
invenia tiinei, analiza computaional a msurrilor efectuate
privind funcionarea celulelor
pentru modelarea i descoperirea proceselor s-a dezvoltat
semnificativ [9]. Biologia sistemic
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
7
este tiina care are ca obiectiv nelegerea felului n care
macromolecule prind via atunci
cnd fac parte dintr-un sistem. Aceast tiin propune studierea
organismelor n ansamblu,
ca un tot unitar, fcnd legtur ntre genom, proteom i metabolom.
Concepia a fost
rspndit n 2000 ca o tiin interdisciplinar, combin multe alte
ramuri a biologiei ca
biologie molecular, biochimie, bioinformatic i metabolomie.
Biologia sistemic analizeaz
cile metabolice, modeleaz procesele biochimice, asigur informaii
privind funcionarea
acestora.
Beneficiarul cel mai important a biologiei sistemice este
ingineria metabolic, care folosete
informaiile asigurate de acesta. Ingineria metabolic const n
optimizarea genetic a
proceselor de regulare a celulelor pentru producerea compusului
de interes. Ingineria
metabolic ntr-un fel a precedat biologia sistemic, prin crearea
necesitii de analizare
sistematic a cilor metabolice i optimizarea lor [10].
Ingineria metabolic are o dimensiune distinct industrial, fiindc
se adreseaz proiectrii
unor microorganisme care pot fi folosite ca bio-catalizatori
pentru producerea
combustibililor, chimicalelor i produselor farmaceutice. Fa de
biologia sintetic, ingineria
metabolic nu doar asambleaz genele pentru construirea cilor
metabolice, ci i creeaz un
proces economic pentru producerea chimicalelor, optimiznd
procesul. Elementele de baz al
ingineriei metabolice sunt planificarea, construirea i
optimizarea cilor.
Celulele modificate genetic pentru producerea chimicalelor de
interes pot fi considerate i ca
bio-reactoare mici, avnd materii de intrare i produse de ieire.
Procesul de dezvoltarea a
celulelor modificate pot fi divizate n trei grupe: faza de
planificare, faza de cercetare i faza
de evaluare. Procesul este prezentat n urmtoarea diagram
[11].
Ar fi ideal c procesul s fie linear, iar dup cum se vede i n
diagrama, sunt multe repetiii
n lanul activitilor. Modelul dezvoltat trebuie s fie ajustat dup
experimentele in vivo. Este
necesar analiza cantitativ a fluxelor intracelulare i
actualizarea variabilelor. Unul dintre
obiectivele cercetrii este construirea i ajustarea modelului
metabolic pentru producerea de
1,4 butandiol. n continuare vor fi relatate metodele de modelare
i construirea modelelor.
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
8
Figura 3: Procesul de dezvoltare, modificare genetic a
microorganismelor [11]
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
9
n ani receni un set de metode au fost dezvoltate pentru
preconizarea cilor metabolice cu
scopul de producere de chimicale prin fermentare microbiologic
[12]. Cercetarea reelelor
metabolice impune dou probleme: analiza i sinteza. Analiza
implic studierea reaciilor
biochimice i identificarea fiecrei cale metabolic, pentru
producerea unui compus
biochimic dintr-un set de compui i reacii biochimice cunoscute.
Sinteza implic
identificarea reaciilor i compuilor biochimice inexistente,
non-native [13].
Bazat pe cunotinele despre un sistem metabolic, putem manipula
sau modifica organismele
pentru a maximiza producerea compusului dorit [14].
Metodele pentru preconizarea cilor pot fi clasificate prin baza
abordrii [12]:
1. Metode bazate pe schimbrii de structuri chimice
Metodele din grupul acesta sunt folosite pentru reconstruirea
reelelor de relaii ntre compui
biochimici, folosind analiza omologiilor bazate pe structur.
Aceast metod genereaz o
varietate de ci non-native, iar preconizarea enzimelor este
dificil [12].
2. Metode bazate pe informaii enzimatice
Metodele bazate pe informaii enzimatice se concentreaz la
eliminarea genelor i
combinarea cilor existente la diferite microorganisme. Aceast
metod este util, dar
preconizrile efectuate sunt limitate la compui biochimici
cunoscute [12].
3. Metode bazate pe mecanisme de reacii
Metodele bazate pe mecanisme de reacii sunt capabile pentru
identificarea cilor pentru
producerea produsului de interes, dintr-un set de substraturi.
Aceste metode au capacitatea de
a identifica ci non-native conform cilor i regulilor cunoscute,
dar sunt limitate la reaciile
de biodegradare [12].
3.3 Pasurile generale n ingineria metabolic a organismelor
Programele menionate n capitolele anterioare pot fi combinate,
pot fi folosite la acelai scop
diferite programe , [15].
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
10
Figura 4: Pasurile generale n ingineria metabolic a organismelor
i programe utile la fiecare pas [15]
1. Preconizarea cilor metabolice
n primul pas un numr mare de ci posibile sunt identificate,
bazate pe reguli chimice i hri
metabolice. La faza asta avem deja o idee general despre
posibiliti de producere a
compusului de interes, fr s avem cunotine privind proprietile
termodinamice etc.
2. Prioritizarea cilor metabolice
Prioritizarea cilor metabolice are rolul de a reduce numrul
cilor identificate la primul pas,
dup criterii termodinamice, distana cii, numrul pasurilor
non-native etc. Cile selectate au
o ans mai mare c pot fi introduse ntr-un organism cu succes i
vor fi exprimate. Numrul
pasurilor la calea metabolic nu influeneaz rata produceri
produsului de interes, iar
Sinteza
RBS Calculator, Gene Designer, GeneDesign,
DNAWorks, Clotho, Thinker Cell, GenoCAD,
SynBioSS
Proiectarea genelor i integrarea
cii
Selectarea cii cel mai potrivite
COBRA toolbox, SurreyFBA, CycSim, Biomet
toolbox, IPATH2, GLAMM
Modelarea cilor metabolice
Desharky, Retro Path Prioritizarea cilor metabolice
BNICE, Desharky, FMM, RetroPath Preconizarea cilor
metabolice
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
11
producia enzimelor n plus consum mai mult energie. Efectul
pozitiv a reducerii numrul
pasurilor non-native pentru creterea eficienei nu este evident.
Exist o competiie ntre
cile metabolice native i ci metabolice introduse artificial. Cu
ct mai multe enzime sunt n
comun cu reeaua metabolic a organismului gazd, cu att competiia
va deveni mai mare,
astfel mai multe gene trebuie eliminate pentru asigurarea
producerii compusului dorit.
Separarea complet a cilor non-native de la ci native nu este o
soluie, trebuie s existe o
conexiune ntre ele.
3. Modelarea cilor metabolice
Modelarea cilor metabolice asigur informaii privind
comportamentul cii la organismul de
gazd, folosind analiza fluxului. Aceast analiz asum c sunt
condiii steady-state i
fluxurile sunt determinate n funcia coeficienilor
stoichiometrice. La modelarea cilor
criteriile de optimizare trebuie s fie definite, criteriul cel
mai frecvent ales este producerea
maxim a biomasei, iar acesta poate fi combinat cu producerea
compusului de interes.
4. Selectarea cii cel mai potrivite
Calea cu cel mai mare rat de producie va fi selectat, dup
simularea comparativ a
modelelor elaborate.
5. Proiectarea genelor i integrarea cii
Prile cii metabolice trebuie s fie analizate, trebuie
identificate enzimele, secvenele de
ADN trebuie s fie determinate.
6. Sinteza
Ordinea pasurilor nu este linear, iteraii pot exista ntre ele,
aceste sunt necesare pentru
optimizarea procesului, informaiile dobndite la sfritul
procesului de proiectare pot fi
folosite la reevaluarea informaiilor la nceput [15].
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
12
3.4 Programe pentru preconizarea cilor metabolice i pentru
construirea
modelelor
Exist o gam larg de programe care sunt accesibile gratuit pe
internet, care sunt utile i
pentru non-profesioniti, dar sunt i programe fr o interfa
sofisticat. n tabelul de mai jos
sunt prezentate programele cel mai rspndite n domeniu.
Tabel 2: Lista programelor [15]
Sistem Descripie
Preconizarea cilor
BNICE Biochemichal Network Integrated Computational Explorer,
cadru pentru
identificarea i evaluarea termodinamic a cilor posibile pentru
degradarea
sau producerea compusului dorit.
System of Cho et al. Cadru pentru identificarea i prioritizarea
cilor metabolice pentru sinteza
compusului chimic specificat de utilizator
Desharky Algoritm pentru identificarea cilor. Identific cile
metabolice, care sunt cel
mai corespunztoare cu reea metabolic a unui organism gazd i
identific
secvenele de aminoacizi a enzimelor corespunztoare de la
organisme care
sunt similare
RetroPath Este un web server pentru gzduirea cadrului pentru
proiectarea retro-sintetic
a cilor de metabolism, integreaz preconizarea i clasificarea
cilor,
preconizeaz i compatibilitatea cu gene a organismului de
gazd
FMM From Metabolite to Metabolite, este un web server pentru
identificarea cilor
metabolice folosind baza de dat KEGG
CarbonSearch Un algoritm pentru identificarea cilor metabolice
prin urmrirea conservrii
atomilor
OptStrain Este un cadru care ajut la optimizarea reelei
metabolice a organismului de
gazd prin adugarea sau tergerea reaciilor
Identificarea prilor
Registry of Standard
Biological Parts
Registrul al Massachusetts Institute of Technology, coninnd
diverse feluri de
pri biologice, de exemplu secvene de promotori, secvene
terminatorii,
plasmide. Registrul conine informaii colectate de la competiii
iGEM.
Standard Biological
Parts knowledgebase
O baz de date (inclusiv pri din Registry of Standard Biological
Parts), care
a fost transformat n formatul Synthetic Biology Open Language
pentru a face
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
13
informaii calculabile
IMG Integrated Microbial Genomes, mediu pentru analiza
comparativ i evolutiv
a genelor microbiale
antiSmash Identificarea, adnotarea i analiza comparativ a
genelor pentru sinteza
metaboliilor secundari
KEGG Colecia cea mai important a metaboliilor i cilor
metabolice, include ci
specifice a organismelor, hri generale cu ci metabolice,
corelaii ntre gene
i enzime, informaii ortologice etc.
ASC Activ Site Classification, folosete structura proteinelor
pentru identificarea
reziduurilor lng site-ul activ al enzimelor.
Refactorarea i sinteza prilor
RBS calculator Proiectarea automat a site-urilor de legtur
ribozomal, bazat pe modele
termodinamice
RBS Designer Algoritm pentru preconizarea eficienelor de
traducere de ARNm, este
capabil pentru proiectarea site-urilor de legtur ribozomal
pentru un nivel
de expresie a proteinelor
Gene Designer 2.0 Pachet de programe pentru proiectarea genelor,
operonelor i vectoarelor,
optimizarea codonilor
Gene Design Un server cu algoritmi pentru optimizarea codonilor,
introducerea grafic a
site-urilor de restricie la secvene de nucleotide
Gene Composer Program pentru proiectarea genelor
Optimizer Web server pentru optimizarea codonilor, folosind
tabelul cu rolul codoanelor
Programe pentru proiectarea cilor metabolice
Biojade Program pentru proiectarea i simularea circuitelor
genetice
Clotho Interfa flexibil pentru proiectarea sistemelor sintetice
biologice, este
capabil pentru folosirea plugin-elor cu ajutorul crora este
posibil
vizualizarea, importarea i editare secvenelor ADN
Tinker Cell Un program CAD pentru simularea sistemelor
biologice
Asmparts Instrument computaional pentru generarea modelelor prin
asamblarea prilor
GenoCAD Un program CAD pentru proiectarea secvenelor ADN, cu
posibilitatea
evalurii gramaticale a genelor
WebGEC Un simulator fabricat de Microsoft pentru evaluarea i
simularea circuitelor
genetice
SynBioSS Program pentru proiectarea, modelarea i simularea
sistemelor genetice.
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
14
Programul poate fi folosit pentru transformarea secvenelor
BioBrick (de la
Registry of Standard Biological Parts) sau altor pri ntr-un
model care poate
fi simulat la programul SynBioSS Desktop Simulator
Cell Designer Program pentru desenarea reelelor biochimice, care
pot fi salvate n System
Biology Markup Langueage (SBML) format
BionetCAD Este un plug-in pentru CAD i simularea reelelor
biochimice
Modelarea metabolic i analiza fluxurilor
Cobra Toolbox Un program standard pentru modelarea metabolic i
analiza fluxurilor
Surrey FBA Instrument pentru modelarea sistemelor la nivel
genetic
CycSIM Web server pentru analizarea modelelor metabolice,
include i simulri de
eliminare a enzimelor
BioMet Toolbox Instrument online pentru analiza modelelor
metabolice, include i eliminri de
gene, optimizri de flux
iPath2 Vizualizarea interactiv a datelor cilor metabolice,
elementele hrilor
metabolice bazate pe KEGG pot fi colorate dup preferina
utilizatorului
GLAMM Vizualizarea interactiv a cilor metabolice, poate folosi
reele metabolice
specifice organismului de gazd i permite detectarea cilor
3.5 Modele metabolice folosite n ingineria metabolic
Exist mai multe tipuri de modele metabolice folosite pentru
analiza, simularea sistemelor
metabolice n celule. Modelele mai simple sunt utile la
descrierea metabolismului la o scar
mai larg, de exemplu la nivelul celulei, iar modelele mai
complexe sunt utile la descrierea
metabolismelor la o scar mai mic, de exemplu numai pentru
modelare glicolizei. Modelele
mai complexe necesit mai multe informaii care de multe ori nu
sunt disponibile la scar mai
mare.
Modelele topologice includ interaciuni ntre metabolii i enzime,
sunt folosite ca puncte de
nceput la analiza datelor i la cutarea cilor metabolice prin
metode de teoria grafurilor.
Modelele stoichiometrice bazate pe constrngeri sunt modele
statice cu aplicaii largi n
identificarea intei pentru modificarea genomului a organismelor.
Aceste modele includ
relaii stoichiometrice ntre enzime i produi n reacii. Direcia
reaciilor i constrngerii
fluxului pot fi obinute de exemplu de la valori termodinamice i
capaciti enzimatice.
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
15
Cteva dintre aceste modele sunt adnotate cu reguli de reacii a
genelor, cea ce asigur un
link direct cu genomul i permite simulaii a efectelor schimbrii
genomului n organism.
Modelele stoichiometrice atom-maped include i transfere atomice
la reacii metabolice.
Pentru aplicaii care includ i analiza fluxului cu 13C este
necesar folosirea modelelor
stoichiometrice atom-maped. Modelele cinetice includ i ecuaii de
rat a reaciilor
metabolice, ori ecuaii simplificate ori ecuaii complexe. Ecuaii
simplificate au rolul de a
prezenta reacii enzimatice cu parametri cunoscute limitate, fr
complexitate. Ecuaii
complexe descriu comportamentul reaciei dependente de mecanismul
enzimatic [11].
Figura 5: Modele metabolice folosite n ingineria metabolic
[11]
3.6 Metoda OptStrain
Metoda OptStrain este o metod care se bazeaz pe informaii
enzimatice. OptStrain este
capabil de modificarea cilor prin adiia sau eliminarea reaciilor
ntr-o reea microbian
pentru producerea compusului biochimic dorit [16].
Procedura Optstrain are patru trepte, fiecare dintre ele rezolv
o problem diferit [17]:
Treapta 1: Descrcarea i verificarea reaciilor, dintr-o baz de
date
Modele cinetice: Modele stoichiometrice atom-maped:
Acid piruvic Acid oxaloacetic
1 1
2 2
3 3
Modele stoichiometrice:
X1: ATP+glucose=> G6P+ADP
X2: G6P=>F6P
X3: G6P+2NADP=>R5P+2NADPH+O2
X4: F6P+ATP=>2G3P+ADP
X5: 2R5P=>S7P+G3P
Modele Topologice:
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
16
Metoda are nevoie de un set de reacii enzimatice, care sunt
descrcate de la una dintre baze
de date disponibile pe internet, de exemplu KEGG (Kyoto
Encyclopedia of Genes and
Genomes). Baze de date open source au dezavantajul c nu toate
informaiile ncrcate sunt
verificate, astfel credibilitatea lor trebuie s fie analizat.
Analiza const din calcularea
atomilor la partea reactanilor, ct i la partea produilor.
Reaciile care nu sunt echilibrate
sunt excluse din lista reaciilor [16].
Treapta 2: Estimarea randamentului maxim
Pasul al doilea const din determinarea randamentului maxim de
formare a produsului de
interes, de la o gam de substraturi, fr restricii la numrul
reaciilor i la originea reaciilor.
Randamentul maxim teoretic este estimat pentru o unitate de
substraturi, prin maximizarea
sumei fluxurilor de reacie care produce minus fluxurile de
reacie care consum metabolitul
de int, ponderat cu coeficieni stoichiometrici [16].
Treapta 3: Identificarea cilor cu cel mai puine reacii strine
pentru organismul gazd
Pasul urmtor folosete randamentul maxim teoretic identificat
pentru a determina numrul
minim de reacii non-native care trebuie s fie adugate la reeaua
organismului de gazd.
Rezultatele pasului sunt variaiile cilor metabolice clasate n
ordinea eficienei, dar innd
cont de numrul reaciilor non-native. n etapa aceasta sunt
analizate diferite opiuni de
organisme gazde, organismul cu cel mai mic numr de reacii
non-native va fi cel mai potrivit
[16].
Treapta 4: ncorporarea reaciilor non-native la modelul
stoichiometric a organismului
gazd
Analiza continu cu extinderea reelei cilor metabolice la
organism gazd, cu reacii non-
native. Numai adugarea genelor necesare n sistemul metabolic a
organismului nu va rezulta
n producia produsului de interes, fiindc metabolismul
organismelor este proiectat pentru
corespunderea presiunilor de selecie: organismul cu cel mai mare
randament de reproducere
va supravieui. Genele inutile din punctul de vedere a producerii
produsului de interes trebuie
s fie eliminate pentru rezolvarea problemei [16].
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
17
Scopul metodei OptStrain este asigurarea ideilor despre cum s
reformm sistemul metabolic
a organismelor pentru producerea compusului chimic dorit. Metoda
este util nu doar n cazul
moleculelor mici, dar i n cazul producerii moleculelor mari i
compleci. Validitatea i
relevana rezultatelor primite este influenat de completitudinea
i precizia bazei de date a
reaciilor i modelelor de metabolism, astfel acestea trebuie s
fie verificate cu grij.
Metoda OptStrain a fost examinat pentru mai multe produse, de
exemplu: 1,3-propandiol,
inozitol, piruvat, hidrogen i vanilin. Cel mai promitor dintre
ele este molecula 1,3-
propandiol care e o molecul apropiat de 1,4-butandiol, produsul
nostru de interes [16].
3.7 Analiza fluxurilor
Dup identificarea cilor, pasul urmtor este analiza ratelor de
producere a cilor i modului
de control al acestora. Diferena dintre ingineria metabolic i
biologia molecular este c
primul se ocup cu ci metabolice integrate n locul reaciilor
individuale [10].
Metoda primar pentru analiza reelelor metabolice este analiza
fluxurilor metabolice.
Analiza fluxurilor metabolice este o tehnic pentru examinarea
ratelor de producie i de
consum a metaboliilor ntr-un sistem biologic. Prin folosirea
modelelor metabolice
stoichiometrice i spectroscopiei de mas cu izotope 13C, putem
descoperi informaii privind
reeaua reaciilor [18]. La analiza fluxurilor metabolice
fluxurile sunt calculate prin folosirea
modelelor stoichiometrice pentru reacii intracelulare i
echilibre de mas pentru calcularea
interaciunilor extracelulare. Rezultatul final al analizei este
reea fluxurilor metabolice
mpreun cu estimarea ratelor de reacii steady-state (flux).
Analiza controlului metabolic este cadrul matematic pentru
descrierea cilor, metaboliilor,
semnalizrii i reelelor genetice. Analiza controlul metabolic
determin cum variabilii, de
exemplu fluxuri i concentraia metaboliilor depind de parametrii
reelei. n original analiza
controlului metabolic a fost dezvoltat pentru descrierea
controlului cilor metabolice, iar
ulterior a fost dezvoltat pentru descrierea reelelor de
semnalizare i genetice.
Analiza echilibrului de flux este o metod matematic pentru
simularea metabolismului la
scar genomic. n comparaie cu metode tradiionale de modelare
analiza echilibrului de flux
necesit mai puine date pentru construirea modelului, i necesit o
capacitate computaional
mai mic.
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
18
Aplicaiile analizei echilibrului de flux sunt urmtoare:
- Eliminarea reaciilor
Este o tehnic folosit frecvent pentru identificarea reaciilor
critice pentru producerea
biomasei, deci pentru viabilitatea organismelor. Prin eliminarea
reaciilor pe rnd i
msurarea fluxului prin fluxul biomasei, fiecare reacie poate fi
clasificat ca reacie esenial
sau neglijabil.
- Eliminarea reaciilor n perechi
Eliminarea reaciilor n diferite perechi posibile este folosit
cel mai mult de medicin pentru
identificarea medicamentelor cu mai multe inte. Metoda este
folosit i n cuantificarea
interaciunilor ntre diferite ci.
- Eliminarea genelor
Genele sunt conectate la reaciile catalizate de enzime prin
expresii Boolean cunoscute ca
expresii gene-protein-reacie corespunztor pentru fiecare reacie.
Metoda este capabil de
evaluarea relaiilor logice ntre enzime, de exemplu relaia ntre
dou gene este AND cnd
amndoi sunt necesare pentru expresia proteinei, iar relaie este
OR cnd enzimele sunt
isoenzime. Astfel este posibil analiza eliminrii genelor singure
sau multiple.
- Inhibarea reaciilor
Efectul inhibrii reaciilor, nu eliminarea total, poate fi
simulat cu analiza echilibrului de
flux prin restricionarea fluxului prin reacie. Efectul inhibrii
poate fi clasificat fiind mortal
sau fiabil.
- Optimizarea mediului de cretere a organismelor
Analiza echilibrului de flux este capabil pentru optimizarea
mediului de cretere a
organismelor n privina supra-producerii compusului de interes
sau n privina maximizrii
altor fluxuri.
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
19
Matematica n analiza echilibrului de flux
mpotriva metodelor tradiionale, analiza echilibrului de flux nu
necesit folosirea ecuaiilor
difereniale ordinare, necesit foarte puine informaii referitor
la parametri cinetici i
concentraia metaboliilor n sistem. Asta este obinut prin
implicarea urmtoarelor
presupuneri: sistemul este steady-state i optimal. Steady-state
nseamn c concentraiile
sunt constante i sistemul optimal nseamn c organismul a fost
optimizat pentru inte
biologice, de exemplu creterea optim sau conservarea resurselor.
Presupunerea steady-state
reduce sistemul la ecuaii lineare, care sunt rezolvate pentru
identificarea distribuiei ntre
fluxuri care satisface condiiile steady-state i constrngerile
stoichiometrice. Presupunerea
steady-state se bazeaz pe ecuaia urmtoare:
Dac sistemul este steady-state, acumularea este zero, astfel
ecuaie devine:
Reelele metabolice aveau mai multe reacii dect metabolii,
rezultnd un sistem de reacii
lineare sub-determinate, coninnd mai multe reacii dect
variabile. Abordarea standard
pentru rezolvarea problemei este folosirea programrii lineare.
Aceste probleme pot fi
exprimate n forma canonic:
Unde x este vectorul variabililor care trebuie s fie determinat,
c i b sunt vectorii
coeficienilor cunoscute, A este matricele cunoscut a
coeficienilor, i este transpunerea
matricei. Expresia care trebuie s fie maximizat sau minimalizat
este numit funcia obiectiv,
( n cazul asta). Inegalitile sunt constrngeri la care funcia
obiectivei trebuie
s fie optimizat.
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
20
Programarea linear necesit definirea funciei obiectiv, soluia
optim este cea care
maximalizeaz sau minimalizeaz funcia obiectiv, dup caz. n cazul
analizei echilibrului de
flux, funcia obiectiv pentru programare linear, n majoritatea
cazurilor, este producia de
biomas. Producia biomasei este simulat printr-o reacie care
reprezint suma reaciilor care
transform precursori de biomas n biomas.
Astfel forma canonic a analizei echilibrului de flux devine:
Unde v reprezint vectorul fluxurilor care trebuie s fie
determinat, S este matricea
coeficienilor care sunt cunoscute. Inegalitile definesc
rata maxim a fluxurilor pentru fiecare reacie corespunznd
coloanelor matricei S. Aceste
rate pot fi determinate experimental pentru a constrnge i a
mbunti precizia de
preconizare a modelului.
Avantajul cel mai important a analizei echilibrului de flux este
c nu necesit cunoaterea
concentraiilor de metabolii i cinetica enzimatic a reaciilor.
Coeficienii stoichiometrici
sunt suficiente pentru maximizarea matematic a funciei obiectiv
[18].
Construirea modelelor pentru analiza echilibrului de flux
Prile cel mai importante la construirea modelelor pentru analiza
echilibrului de flux sunt:
- Crearea reelei complete a proceselor metabolice
- Adugarea constrngerilor n model
- Adugarea funciei obiectiv
Cerina principal a reelei este s fie complet, asta nseamn c o
evaluare excesiv este
necesar. Pachetele de software pentru construirea modelelor sunt
prezentate n capitolul
anterior.
Partea cheie la analiza echilibrului de flux este abilitatea de
a aduga constrngeri la rata
fluxurilor de reacii, fornd acestea s rmn ntr-un interval
predefinit, asta face modelul s
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
21
fie real. Sunt dou feluri de constrngeri: constrngeri la sfritul
metabolismului, care
limiteaz absorbia i excreia nutrimentelor, i constrngeri interne
pentru limitarea
fluxurilor ntre reacii.
Fiecare organism are un mediu de cretere la care absoarbe
nutrieni i triete n condiii
bune. n general rata de absorbie este influenat de
disponibilitatea nutrienilor, concentraia
lor. Dac rata de absorbie a nutrienilor este msurabil
experimental, informaia asta poate
fi adugat ca constrngere n model, prin rate de flux la sfritul
sau la nceputul modelului
metabolic. Asta asigur c nutrieni care nu sunt prezeni, sau nu
sunt absorbite de organism,
s nu intre n metabolism, pentru ei, rata de flux este zero.
n principiu toate reaciile sunt reversibile, totui n practic
reaciile se desfoar numai
ntr-o singur direcie. Asta poate fi datorit concentraiei mai
mari a reactanilor n
comparaie cu concentraia produselor, dar de multe ori este
datorit entalpiei libere mai mici
a produselor n comparaie cu reactanii, astfel direcia de nainte
este mai favorabil [18].
Analiza echilibrului de flux folosete modele stoichiometrice la
nivelul genelor. Recent o
mulime de astfel de modele au fost dezvoltate, de exemplu,
pentru Escherichia coli. Modelul
acestuia include 2077 reacii, 1039 metabolii. Cu ajutorul
modelului, prin folosirea analizei
echilibrului de flux, cercettorii au reuit de exemplu
supra-producerea licopenului [10].
Modele similare au fost dezvoltate pentru Saccharomyces
cerevisiae, Bacillus subtilis,
Clostridium acetobutylicum, Corynebacterium glutamicum,
Arabidopsis thaliana, chiar i
pentru oameni [10].
3.8 Programul OptFlux
Programul OptFlux este o platform pentru ingineria metabolic
pentru identificarea
reaciilor care trebuie s fie adugate n genomul
microorganismelor, cum i pentru
identificarea reaciilor care trebuie s fie eliminate pentru
producerea compusului de interes,
pstrnd viabilitatea organismului [19]. Programul este
open-source, accesibil gratuit pentru
toi, ncorporeaz mai multe algoritme pentru optimizarea cilor
metabolice.
Optimizarea cilor are limitaii cnd modelele metabolice sunt
incomplete sau cnd compusul
de interes nu poate fi produs. n aceste cazuri trebuie s fie
adugate la model reacii
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
22
adiionale, un plug-in separat a fost dezvoltat n aceast privin,
care face posibil adugarea
reaciilor dintr-o baz de date extern [19].
Programul poate lucra cu formatul SBML (Systems Biology Markup
Language), dar are i o
bibliotec online proprie cu modelele cilor metabolice care sunt
verificate de echipa OptFlux
i pot fi de ncredere. OptFlux determin valorile fluxurilor de
reacii care sunt incluse n
model, corespund condiiile mediului (fluxul substraturilor) i
condiii genetice [20].
4 Metode i materiale
4.1 Ci pentru producerea de 2,3-butandiol
Dup vasta analiz a metodelor pentru preconizarea cilor
metabolice ncercm s folosim n
practic programele menionate. Scopul este s avem o idee simpl
despre producerea de 2,3-
-butandiol prin fermentare i s avem o idee despre folosirea
programelor.
Platforma online FMM a gsit ase ci cu diferene foarte mici
pentru producerea de 2,3-
butandiol din D-glucoz, fiecare cale avnd 9 trepte. Nu toate
dintre enzimele identificate
sunt disponibile la un organism, astfel la organismul de gazd
trebuie adugate genele
necesare. Calea identificat de platforma FMM atinge calea
pentoz-fosfat, sinteza acidului
pantotenic i coenzimei A i metabolismul butanoate. Calea
identificat este prezentat n
Figura 3.
Calea identificat de FMM este similar cu calea gsit la baze de
date Metacyc, care este
prezentat n Figura 2 [21].
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
23
Figura 6: Calea gsit la date de baze Metacyc pentru producerea
de 2,3-butandiol
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
24
Figura 7: Rezultatele primite la platforma online FMM [22]
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
25
Pasul urmtor ar fi implementarea cii prezentate n Figura 3, i
simularea modelului, sau
identificarea unui organism la care se gsesc toate enzimele
necesare procesului. Dup cum
se vede din Tabelul 2, nici una dintre organismele din natur nu
conine toate enzimele
necesare procesului, cel mult ase din nou enzime se gsesc la
organisme. Ca un pas urmtor
ar fi alegerea unuia dintre organismele din tabelul de mai jos,
i completarea lui cu cile
necesare producerii de 2,3-butandiol.
Tabel 3: Speciile i enzimele din procesul determinat de FMM
[22]
Numrul
enzimelor Enzime Specii
6 1.1.5.2 3.1.1.17 2.7.1.45 4.1.2.14 2.2.1.6 1.1.1.4
Agrobacterium tumefaciens str. C58
6 1.1.5.2 3.1.1.17 2.7.1.45 4.1.2.14 2.2.1.6 1.1.1.4
Sinorhizobium meliloti 1021
6 1.1.5.2 3.1.1.17 2.7.1.45 4.1.2.14 2.2.1.6 4.1.1.5
Pseudoalteromonas atlantica T6c
6 1.1.5.2 3.1.1.17 2.7.1.45 4.1.2.14 2.2.1.6 1.1.1.4
Sinorhizobium medicae WSM419
6 1.1.5.2 3.1.1.17 2.7.1.45 4.1.2.14 2.2.1.6 4.1.1.5 Serratia
proteamaculans 568
6 1.1.5.2 3.1.1.17 2.7.1.45 4.1.2.14 2.2.1.6 4.1.1.5
Enterobacter sp. 638
Proiectul path2models este un mare ajutor, fiind o iniiativ
pentru transformarea cilor
metabolice de la baza de date KEGG, n format SBML, iar sunt i
transformate modele
metabolice complete al organismelor [23]. Obstacolul cel mai
mare este standardizarea
insuficient a modelelor n formatul SBML, muli dintre ele nu pot
fi folosite de programele
menionate n capitole anterioare. Chiar i dac modelele sunt
cunoscute de programe, sunt
deschise parial, muli dintre valori nu sunt completate, cel mai
frecvent lipsesc valorile
ratelor cinetice a reaciilor.
Astfel decizia a fost construirea numai a unei pri a modelului
responsabil pentru producerea
de 2,3-butandiol, cu ajutorul programului Matlab Simbiology,
folosind datele cinetice din
baza de date BRENDA. Conform literaturii, producerea industrial
a 2,3-butandiolului se
face cu ajutorul organismului Enterobacter [24], ceea ce apare i
n Tabelul 2. Astfel
organismul ales este Enterobacter sp. 638 unde se gsesc valorile
cinetice. Valorile Km sunt
alese pentru varianta slbatic a enzimelor unde a fost
disponibil.
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
26
Tabel 4: Valorile Km pentru enzimele necesare pentru producerea
de butandiol conform FMM
Numele enzimelor Numr EC Valoarea Km
mM
Kcat
1/s
quinoprotein glucose dehydrogenase 1.1.5.2 0,95 3860
glucose dehydrogenase (acceptor) 1.1.99.10 2,5 ??
gluconolactonase 3.1.1.17 9,4 162
gluconate dehydratase 4.2.1.39 2 760
2-dehydro-3-deoxygluconokinase 2.7.1.45 1 11
2-dehydro-3-deoxy-phosphogluconate aldolase 4.1.2.14 1,9
0,0063
acetolactate synthase 2.2.1.6 4,8 40,3
acetolactate decarboxylase 4.1.1.5 ?? ??
(R,R)-butanediol dehydrogenase 1.1.1.4 3 ??
Regulile reaciilor au fost determinate conform cineticii
enzimatice Michaelis Menten,
folosind valorile din Tabelul 3. Fiecare reacie a fost verificat
pe rnd, toi dintre ele sunt
reacii reversibile, modelul elaborat ine cont i de coeficienii
stoichiometrici.
Figura 8: Modelul la platforma Simbiology
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
27
Fluxurile reaciilor sunt prezentate pe Figura 4, este exact
aceeai ca i n cazul Figurii 3,
adic urmrete rezultatele platformei FMM. Modelul nu ine cont de
alte reacii care sunt
necesare pentru viabilitatea organismului, astfel exerciiul are
numai un scop orientativ
asupra funcionrii programelor.
Am realizat o analiz de flux la programul Simbiology,
rezultatele sunt prezentate n Figura
5.
Figura 9: Concentraiile metaboliilor
Cantitatea de glucoz este 5 mM la intrare, valoarea lui nu este
constant, deci se consum la
reacie. Poate fi observat c concentraia de butandiol va ajunge
numai la jumtatea
concentraiei originale a glucozei. Acest fapt este datorit
reaciei de formare a 2-acetolactat
din piruvat, la care din dou piruvat se formeaz o
2-acetolactate, conform reaciilor
prezentate n continuare, reacia este reversibil.
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
28
D-Glucose + Quinone D-Glucono-1,5-lactone + Hydroquinone
D-Glucono-1,5-lactone + H2O D-Gluconic acid
D-Gluconic acid 2-Dehydro-3-deoxy-D-gluconate + H2O
ATP + 2-Dehydro-3-deoxy-D-gluconate ADP +
2-Dehydro-3-deoxy-6-phospho-D-
gluconate
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
29
2-Dehydro-3-deoxy-6-phospho-D-gluconate D-Glyceraldehyde
3-phosphate + Pyruvate
2-Acetolactate + CO2 2 Pyruvate
(S)-2-Acetolactate (R)-Acetoin + CO2
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
30
(R,R)-Butane-2,3-diol + NAD+ (R)-Acetoin + NADH + H+
Dac ar fi vorb despre un sistem metabolic complet, care a fost
dezvoltat cu reacii
necesare pentru producerea compusului chimic de interes, o
analiz Optknock ar fi necesar
pentru identificarea reaciilor de eliminare, pstrnd viabilitatea
organismului i maximiznd
rata de producere a compusului chimic de interes. Pentru analiza
Optknock avem nevoie de
alte programe, de exemplu Optflux sau Cobra Toolbox.
5 Rezultate i discuii
Barierele cei mai mari al preconizrii cilor metabolice sunt:
- Standardizarea insuficient a formatului SBML
- Lipsa datelor cinetice
Pentru rezolvarea problemelor menionate, programele folosite la
pasurile descrise la
Capitolul 3.2 trebuie s fie combinate cu grij, de exemplu: avem
o ans mai mare de
compatibilitate ntre programe Cobra toolbox i Simbiology, fiindc
amndou sunt operate
n cadrul programului Matlab. Modelul elaborat n Simbiology nu a
fost recunoscut de
programul Optflux, n ciuda faptului c modelul a fost salvat n
format SBML level 2 version,
cea ce este compatibil cu programul.
Colectarea datelor cinetice este una dintre cel mai grele
sarcini la modelarea proceselor
biochimice. Sunt mai multe baze de date pe internet cu valori
cinetice a enzimelor de
exemplu: Brenda. Problema este c valorile cinetice sunt
specifice, sunt influenate de
organismul gazd, substrat, condiii de mediu: temperatura i pH.
Metoda cea mai uoar este
identificarea organismului de gazd care conine cel mai muli
dintre enzime necesare pentru
producerea compusului chimic de interes, dar n acelai timp este
disponibil i modelul lui
complet i verificat n colecia modelelor SBML. Modelul asta apoi
trebuie s fie completat
cu reacii non-native, care sunt inexistente n organismul gazd.
Este recomandat
determinarea valorilor cinetice prin experimente n laborator,
cnd acestea nu sunt
disponibile.
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
31
Exerciiul realizat n Capitolul 3.8 a avut inta de a identifica o
cale pentru producerea de 2,3-
butandiol, cea ce exist ca un metabolit n organismele naturale,
iar inta original este
identificarea cilor pentru producerea de 1,4-butandiol cea ce nu
exist la nici una dintre
organismele naturale cunoscute n momentul de fa. La Capitolul
3.8 am optat la 2,3-
butandiol din motive simplificatoare. Modificarea, modelarea
organismelor pentru
producerea de 1,4-butandiol este o sarcin mult mai mare. Cei din
Genomatica au ales
Escherichia coli ca organism de gazd, din motive practice: este
cel mai rspndit i cunoscut
organism folosit n industria biochimic. Modelul detaliat a lui
este disponibil. Ei au folosit
o metod bazat pe operatori de reacii n schimb de metodologiile
bazate pe reacii
enzimatice cunoscute, astfel au identificat i ci non-native, cea
ce este esenial cnd este
vorba de un compus de interes care nu se gsete la nici una
dintre organismele cunoscute
[1]. Metodologia folosit de ei este foarte similar cu
metodologia descris la Capitolul 3.4.:
Figura 10: Metodologia folosit de Genomatica [1]
Planificarea operatorilor de reacii bazat pe reguli chimice i
clase de enzime
Adugarea operatorilor de reacii la baze de date al programului
SimPheny Biopathway Predictor
Definirea metabolitelor
Managementul operatorilor de
reacii
Selectarea compusului de int de la baze de date
Selectarea dimensiunii reelei
Selectarea limitei de mrime a moleculelor
Calcularea reelei: pentru fiecare nivel, operatori de reacii
sunt aplicate
Calcularea reelelor
Adugarea metabolitelor secundari la reeaua reaciilor
Calcualrea speciilor dominante i ncrcate la pH neutru
Echilibrarea reaciilor
Calcularea proprietiilor termodinamice
Semnarea reaciilor i metaboliilor cunoscui
Integrarea automat cu
ajutorul SimPheny
Selectarea manual a metaboliilor de intrare de la reea
calculat
Selectarea manual a lungimei maxim a cii
Urmrirea automat a cilor de la metabolii de intrare selectat
Calcularea automat a reaciilor i termodinamica cilor
Urmrirea cilor
Calcularea ratei maxime de producere teoretic n modelul
metabolic
Selectarea i prioritizarea cilor conform criteriilor de
selecie
Evaluarea manual a rezultatelor
Prioritizarea i evaluarea cilor
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
32
Folosind metoda prezentat n Figura 10, au obinut mai muli de
10000 de ci alctuite din 4
sau 6 trepte, de la metabolii obinuii cum sunt acetil-CoA,
-ketoglutarate, succinil-CoA i
glutamat. Dup prioritizarea cilor innd cont de rata maxim
teoretic, lungimea cii,
numrul treptelor non-native, numrul treptelor native i
fezabilitatea termodinamic a
procesului au redus numrul cilor la 10 procente. Cile rmase au
fost prioritizate folosind
alte criterii: numrul treptelor fr enzime caracterizate (bazat
pe Kyoto Encyclopedia a
Genelor i baza de date intern), numrul treptelor non-native,
numrul treptelor din
metabolismul central. Fiecare dintre procesele selectate au
atins 4-hidroxibutirat [1]:
Figura 11: Calea metabolic adugat la E. Coli de Genomatica,
Enzimele numerotate sunt: 1. 2-oxoglutarate decarboxylase, 2.
Succinil-CoA synthetase, 3. Succinate semialdehyde dehydrogenase
dependent de CoA, 4. 4-
hydrixybutirat dehidrogenase, 5. 4-hydroxybutyryl-CoA
transferase, 6. 4-hydroxybutyryl-CoA reductase, 7. Alcohol
dehydrogenase [1].
Treptele 2 i 7 exist n natur n sistemul metabolic al Escherichia
Coli, celelalte trepte au
fost introdui artificial. Din motive de validare au ales mprirea
procesului la dou pri:
partea pentru producerea de 4-hidroxibutirat i partea pentru
producerea de 1,4-butandiol.
Partea pentru producerea de 4-hidroxybutirat are dou opiuni,
amndou ncep cu compuse
din ciclul acidului citric, una de la succinat, alta de la
-cetoglutarate. Versiunea cu -
cetoglutarate este mai fezabil din punct de vedere termodinamic,
conine mai puine trepte,
fr reacii reversibile.
Partea pentru producerea de 1,4-butandiol necesit dou trepte de
reducie, catalizate de
dehidrogenaze. Enzimele necesare procesului nu au fost
identificate, astfel o list de enzime
candidate au fost identificate pe baza activitii lor cu
4-hidroxibutirat sau cu molecule
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
33
similare. Dup un numr de experimente, enzimele alese au fost
4-hydroxybutyril-CoA-
reductaz i 4-hydroxybutyril-CoA-reductaz. Astfel sa produs o
cantitate de 138 M 1,4-
butandiol.
Obiectivul propus esteproducerea de 1,4-butandiol ntr-un singur
pas, , folosind acelai
organism. Cercettorii la Genomatica au combinat plasmidele
necesare proceselor discutate
mai sus, la prima parte au insertat genele necesare pentru
producerea de 4-hidroxybutirat, din
ambele substraturi: succinat i -cetoglutarate. Astfel au reuit s
produc 1,3 mM de 1,4-
butandiol n 40 de ore.
Dup producerea de 1,4-butandiol, dovedind c procesul este
viabil, s-a urmrit optimizarea
procesului prin eliminarea genelor pentru a pstra metabolismul
pe calea bine definit. Dup
o analiz OptKnock s-au identificat enzimele care trebuie s fie
eliminate pentru obinerea
ratei maxime. Producerea de etanol, metanoate, lactat i succinat
au fost blocate, astfel
fornd organismul pentru producerea de 1,4-butandiol pentru
balansarea potenialului redox.
95% a carbonului a fost transferat spre calea pentru producerea
de 1,4-butandiol dup
optimizare. Enzimele la sfritul cii au fost reconsiderate, au
fost alese acelai enzime, dar
de la diferite organisme, tot rezultnd n creterea ratei de
producere de 1,4-butandiol.
Substratul preferat a fost zaharoza, fiind mai ieftin i rspndit
dect glucoza, iar au i
ncercat mai multe feluri de carbohidrai, iar la nici una dintre
ele nu s-au obinut o producie
mai mare dect n cazul glucozei.
n final cercettorii la Genomatica au obinut o producie de
1,4-butandiol la o concentraie
de 20 g/L, cea ce momentan nu este economic, o concentraie n jur
de 100 g/L este necesar
pentru ca procesul s fie fezabil [1].
Cercetrile n continuarea au rolul de a proiecta un proces ct mai
economic, nu doar prin
optimizarea procesului de fermentare, dar ct i prin
identificarea noilor ci.
Identificarea noilor ci pentru producerea de 1,4-butandiol este
un proces foarte complicat, i
necesit o expertiz de nivel nalt. Astfel am decis evaluarea i
evidenierea unor dintre cele
cinci ci identificate de Genomatica (Figura 12). Evaluarea const
din urmtoarele:
- Identificarea enzimelor care particip la proces
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
34
- Construirea modelului n format SBML
- Analiza echilibrului de flux a modelului
- Identificarea genelor care trebuie s fie eliminate
- Construirea plasmidelor i efectuarea experimentelor n
laborator
- dezvoltarea modelului, folosind rezultatele experimentelor
Procesul ncepe cu alfa-ketoglutarate, metabolit de la ciclul
acidului citric. Enzimele
prezentate n Figura de mai sus sunt numai propuneri, sunt enzime
ale cror funcii cunoscute
sunt similare cu funcia care trebuie s fie ndeplinit n calea
metabolic pentru producerea
de 1,4-butandiol. Un set de enzime au fost identificate, ele
sunt prezentate n Tabelul 5:
Alpha - ketoglutarate
5 hydroxy 2
oxopentanoic acid
4 - hidroxybutanal
1,4 - butanediol
Alfa ketoglutaryl -
CoA
2.8.3 6.2.1
1.1.1
4.1.1
1.1.1
Figura 12: drumul metabolic ales dintre cei 5 ci
identificate
de Genomatica
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
35
Tabel 5: Enzimele identificate pentru procesul prezentat n
Figura 12
Numr
EC
Numele
genului
ID de gene
bank Numele enzimei
Substratul
cunoscut
Numrul
acidelor
amino
KM
mM Organism
2.8.3.18 cat1
succinyl-
CoA:acetate CoA-
transferase succinate 505 0.9 Acetobacter aceti
2.8.3.18 cat1 P38946.1
Succinyl-
CoA:coenzyme A
transferase succinate 538 n/a
Clostridium
kluyveri
2.8.3.8 cat2
acetate CoA-
transferase Acetate 216 110 Acetobacter aceti
2.8.3.- cat2 P38942.2
4-hydroxybutyrate
coenzyme A
transferase
4-hydroxi
Butyrate 429 n/a
Clostridium
kluyveri
2.8.3.12 gctA CAA57199.1
glutaconate CoA-
transferase glutarate 320 0.7
Acidaminococcus
fermentans
2.8.3.8 atoA P76459.1
acetate CoA-
transferase butanoate 216 n/a Escherichia coli
2.8.3.8 atoD P76458.1
acetate CoA-
transferase butanoate 220 n/a Escherichia coli
3.1.2.18 tesB NP_414986
acyl-CoA
thioesterase 2 adipyl-CoA 286 n/a Escherichia coli
6.2.1.5 sucCD NP_415256.1
Succinate-CoA
ligase succinate 388 0.25 Escherichia coli
6.2.1.5 sucCD AAC73823.1
Succinate-CoA
ligase succinate 289 0.25 Escherichia coli
6.2.1.14 bioW NP_390902.2
6-
Carboxyhexanoate-
CoA ligase
6-carboxy
hexanoate 258 n/a Bacillus subtilis
1.1.1.c adhE2 AAK09379.1
alpha-ketoglutaryl
CoA reductase
butanoyl-
CoA 858 -
Clostridium
acetobutylicum
1.1.1.c mcr AAS20429.1
alpha-ketoglutaryl
CoA reductase malonyl-CoA 1220 30
Chloroflexus
aurantiacus
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
36
4.1.1.a pdc P06672.1
5-hydroxy-2-
oxopentanoic acid
decarboxylase
2-
oxopentanoic
acid 568 4.7
Zymomonas
mobilus
4.1.1.a mdlC P20906.2
5-hydroxy-2-
oxopentanoic acid
decarboxylase
2-
oxopentanoic
acid 528 0.056
Pseudomonas
putida
1.1.1.a yqhD NP_417484.1
1,4-butanediol
dehydrogenase >C3 387 0.67 Escherichia coli
1.1.1.a 4hbd L21902.1
1,4-butanediol
dehydrogenase
Succinate
semialdehyde 371 0.055
Clostridium
kluyveri
La identificarea enzimelor am folositbaza de date NCBI (National
Center of Biotechnological
Information), pentru identificarea informaiilor cinetice sursa a
fost baza de date BRENDA.
Dup cum se vede i n Tabelul 5, enzimele sunt specifice,
activitatea lor depinde de substrat,
de organism n care sunt prezente, i de condiii de mediu (pH i
temperatura). Valorile
prezentate n tabel sunt numai orientative, un set de experimente
trebuie s fie efectuate
pentru a determina activitatea specific a enzimelor n calea
pentru producerea de 1,4-
butandiol.
Enzimele identificate i substraturile sunt examinate, dac sunt
capabile pentru formarea
complexului enzim-substrat, prin metoda andocare molecular.
Metoda andocare molecular
este o metod care precizeaz orientarea preferat de o molecul
ctre alta cnd se leag s
formeze un complex stabil. Cunoaterea asocierilor preferate
poate fi folosit pentru a prezice
puterea de asociere ntre dou molecule, folosind funciile
scoring. Majoritatea funciilor
scoring se bazeaz pe cmpul forelor de mecanic molecular. O
energie negativ sczut
indic stabilitatea sistemului. De asemenea, andocarea (docking)
este o unealt esenial
pentru procedeele de screening virtual, n cadrul crora o
categorie de compui sunt andocai
ntr-o int i sunt calculate cele mai bune interaciuni. Din acest
motiv, andocarea este
utilizat frecvent i n prezicerea afinitii de legare a unor
molecule mici (medicamente) de
proteine int sau a activitilor biologice ale acestor molecule
(medicamente) [25].
Noi am folosit programul AutoDock Vina pentru andocarea
substraturilor i enzimelor.
AutoDock este unul dintre cel mai citate softwareruri in
literatur de specialitate, programul
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
37
este open-source, este disponibil gratuit pentru toi.
Rezultatele andocrii sunt prezentate n
tabelul urmtor:
Tabel 6: Afinitate de legare a substraturilor cu enzimele
[26]
Substraturi Substraturi cunoscute
Numele enzimelor
Organisme gazde
Afinitatea de legare
sb1 kcal/mol
Afinitatea de legare
sb test kcal/mol
Alfaketoglutarate Succinate
Succinyl-CoA:coenzyme A transferase
Clostridium kluyveri(pighearth)
-4.7 -4.6
Alfaketoglutarate Succinate
succinyl-CoA:acetate CoA-transferase Acetobacter aceti
-5 -4.7
Alfaketoglutarate Butanoate acetate CoA-transferase Escherichia
coli
-5 -3.7
Alfaketoglutarate adipyl CoA acyl-CoA thioesterase 2 Escherichia
coli
-5.6 -7.7
Alfaketoglutarate Succinate Succinate-CoA ligase Escherichia
coli
-5.2 -5.1
Alfaketoglutarate Succinate Succinate-CoA ligase
Escherichia coli (AAC738231)
n/a n/a
AlfaketoglutarylCoA n/a
3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase Escherichia coli
-8.1 n/a
AlfaketoglutarylCoA Butanoyl CoA
alcohol dehydrogenase (NADP+)
Clostridium acetobutylicum
-6.3 -6
AlfaketoglutarylCoA Malonyl CoA alpha-ketoglutaryl CoA
reductase
Chloroflexus aurantiacus
-7.8 -8.2
5 hydroxy 2 oxopentanoicacid
2 oxopentanoic acid
pyruvate decarboxylase Zymomonas mobilus
-5.3 -5
4 hydroxybutanal >C3 (9) 1,4-butanediol dehydrogenase
Escherichia coli
-3.9 n/a
Afinitatea de legare este capabilitatea de asociere a ligandelor
cu un receptor. Afinitatea de
legare depinde de forele de atragere ntre liganzi i receptoare.
Valorile de afinitate de legare
mai mici nseamn o legtur ntre receptor i ligand mai mare.
n tabelul de mai sus (Tabel 6) sunt prezentate afinitile de
legare ntre enzimele care
particip la calea pentru producerea de 1,4-butandiol propus de
genomatica (Figura 12) i
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
38
substraturile intermediare. Lng asta am fcut i simulri pentru
identificarea afinitilor de
legare ntre enzimele menionate i substraturile lor cunoscute, n
cazul crora tim c
complexul enzim-substrat se formeaz. Dup cum se vede nu sunt
diferene semnificative
ntre valorile cu substraturi cunoscute i cu substraturi din
calea identificat de Genomatica.
Putem trage concluzia c teoretic reacia ntre substraturile i
enzimele propuse este posibil.
n continuare sunt prezentate rezultatele detaliate al andocrii.
Imaginile de 2D prezint
structurile moleculare a liganzilor i modul de legare a lor cu
receptoare. n tabelul urmtor
sunt definite simbolurile folosite la prezentarea detaliat al
andocrii:
Simbol Descriere
Reziduuri implicate n legturi de hidrogen
Reziduuri implicate n legturi Van der Waals.
Molecule de ap
Atomi de metal
Reziduuri implicate n legtur covalent
Suprafaa accesibil de solveni a reziduului
Suprafaa accesibil de solveni a atomului
Interaciuni de legtur de hidrogen cu reziduuri care nu sunt
aminoacizi
Interaciuni de legtur hidrogen cu aminoacizi din lanul
primar
Interaciuni de legtur hidrogen cu aminoacizi din lanul
secundar
Interaciuni electromagnetice
Interaciuni Pi
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
39
Numele enzimei: Succinyl-CoA:coenzyme A transferase
Organism gazd: Clostridium kluyveri(pighearth)
Numele substratului: Alfaketoglutarate. -4.7 kcal/mol
Numele substratului: Succinate. -4.6 kcal/mol
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
40
Numele enzimei: succinyl-CoA:acetate CoA-transferase
Organism gazd: Acetobacter aceti
Numele substratului: Alfaketoglutarate. -5 kcal/mol
Numele substratului: Succinate. -4.7 kcal/mol
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
41
Numele enzimei: acetate CoA-transferase
Organism gazd: Escherichia coli
Numele substratului: Alfaketoglutarate. -5 kcal/mol
Numele substratului: Butanoate. -3.7 kcal/mol
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
42
Numele enzimei: acyl-CoA thioesterase 2
Organism gazd: Escherichia coli
Numele substratului: Alfaketoglutarate. -5.6kcal/mol
Numele substratului: adipyl CoA. -7.7kcal/mol
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
43
Numele enzimei: Succinate-CoA ligase
Organism gazd: Escherichia coli
Numele substratului: Alfaketoglutarate. -5.2kcal/mol
Numele substratului: Succinate. -5.1kcal/mol
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
44
Numele enzimei: 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase
Organism gazd: Escherichia coli
Numele substratului: AlfaketoglutarylCoA. -8.1kcal/mol
Numele enzimei: 1,4-butanediol dehydrogenase
Organism gazd: Escherichia coli
Numele substratului: 4 hydroxybutanal. -3.9kcal/mol
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
45
Numele enzimei: alcohol dehydrogenase (NADP+)
Organism gazd: Clostridium acetobutylicum
Numele substratului: AlfaketoglutarylCoA. -6.3kcal/mol
Numele substratului: Butanoyl CoA. -6kcal/mol
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
46
Numele enzimei: alpha-ketoglutaryl CoA reductase
Organism gazd: Chloroflexus aurantiacus
Numele substratului: AlfaketoglutarylCoA. -7.8kcal/mol
Numele substratului: Malonyl CoA. -8.2kcal/mol
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
47
Numele enzimei: pyruvate decarboxylase
Organism gazd: Zymomonas mobilus
Numele substratului: 5 hydroxy 2 oxopentanoicacid.
-5.3kcal/mol
Numele substratului: 2 oxopentanoic acid. -5kcal/mol
n imaginile de mai sus sunt prezentate interaciunile ntre atomii
liganzilor i aminoacizi a
receptoarelor. Liganzii sunt prezentate la nivel atomic,
receptoarele sunt prezentate la nivel
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
48
molecular. Pentru o analiz mai detaliat, identificarea
interaciunilor la nivel atomic la
ambele pri ar fi necesar. Majoritatea interaciunilor sunt
legturi intermoleculare de
hidrogen, iar sunt i exemple de interaciuni pi i de interaciune
electrostatice.
n continuare vom analiza interaciunile ligand-receptor la nivel
atomic.
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
49
6 Bibliografie
[1] Harry Yim, Robert Haselbeck, Wei Niu, Catherine
Pujol-Baxley, Anthony Burgard, Jeff
Boldt,Julia Khandurina, John D Trawick, Robin E Osterhout,
Rosary Stephen, Jazell
Estadilla, Sy Teisan, H Brett Schreyer, Stefan Andrae, Tae Hoon
Yang, Sang Yup Lee,
Metabolic engineering of Escherichia coli for direct production
of 1,4 - butanediol,
Nature Chemical Biology, vol. 7, 2011.
[2] Prospectus, Is Bio-Butandiol here to stay?, Chemsystems
Online, New York, 2012.
[3] Genomatica, Inc., Genomatica Sustainable Chemicals,
[Interactiv]. Available:
http://www.genomatica.com/products/genobdoprocess/. [Accesat 01
06 2014].
[4] B. C. Stockton, D. J. Mitchell, K. Grohmann, M. E. Himmel,
Optimum-D-glucosidase
supplementation of cellulase for efficient conversion of
cellulose to glucose,
Biotechnology Letters, vol. 1, pp. 57-62, 1991.
[5] Wikipedia contributors, Biodiesel production, Wikipedia, The
Free Encyclopedia., 10
07 2014. [Interactiv]. Available:
http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Biodiesel_production&oldid=616326940.
[Accesat 14 07 2014].
[6] S. S. Yazdani i R. Gonzalez, Engineering Escherichiacoli for
the efficient conversion
of glycerol to ethanol and co-products, Metabolic Engineering,
vol. 10, p. 340351,
2008.
[7] Wikipedia contributors, 1,4-Butanediol, Wikipedia, The Free
Encyclopedia., 08 07
2014. [Interactiv]. Available:
http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=1,4-
Butanediol&oldid=616101300. [Accesat 14 07 2014].
[8] R. E. Bibolet, G. E. Fernando i S. M. Shah, Renewable
1,4-Butanediol, Pennsylvania:
Department of Chemical & Biomolecular Engineering,
University of Pennsylvania,
2011.
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
50
[9] Han-Yu Chuang, Matan Hofree, Trey Ideker, A Decade of
Systems Biology, Annual
Review of Cell and Developmental Biology, vol. 26, pp. 721-744,
2010.
[10] B. M. Woolston, S. Edgar i G. Stephanopoulos, Metabolic
Engineering: Past and
Future, Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering,
vol. 4, p. 25988,
2013.
[11] P. Jouhten, Metabolic modelling in the development of cell
factories by synthetic
biology, Computational and Structural Biotechnology Journal,
vol. 3, 2012.
[12] Ayoun Cho, Hongseok Yun, Jin Hwan Park, Sang Yup Lee,
Sunwon Park, Prediction
of novel synthetic pathways for the production of desired
chemicals, BMC Systems
Biology, 2010.
[13] Vassily Hatzimanikatis, Chunhui Li, Justin A. Ionita,
Christopher S. Henry, Matthew D.
Jankowski and Linda J. Broadbelt, Exploring the diversity of
complex metabolic
networks, Bioinformatics, vol. 21, pp. 1603-1609, 2005.
[14] J. Nielsen, Applied Microbiology and Biotechnology,
Metabolic Engineering, vol. 55,
pp. 263-283, 2001.
[15] Marnix H. Medema, Renske van Raaphorst, Eriko Takano and
Rainer Breitling,
Computational tools for the synthetic design of biochemical
pathways, Glasgow, 2012.
[16] Priti Pharkya, Anthony P. Burgard, Costas D. Maranas,
OptStrain: A computational
framework for redesign of microbial production systems, Genome
Research, vol. 14,
pp. 2367-2376, 2004.
[17] Priti Pharkya, Costas D. Maranas, OptStrain: A hierarchical
metabolic pathway
discovery and design framework for microbial production
systems.
[18] Edwards, J., Ibarra, R. & Palsson, B, In silico
predictions of Escherichia coli metabolic
capabilities are consistent with experimental data, Nature
Biotechnology, vol. 19, p.
125130, 2001.
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
51
[19] Sara Correia, Miguel Rocha, Computational tools for strain
optimization by adding
reactions.
[20] Bioinformatics and Systems Biology Interdisciplinary
Interactive, OptFlux 3 Beginner'
tutorial, 2012.
[21] Superpathway of (R,R)-butanediol biosynthesis, MetaCyc ,
[Interactiv]. Available:
http://biocyc.org/META/new-image?type=PATHWAY&object=P125-PWY&detail-
level=2&ENZORG=TAX-1718#. [Accesat 09 06 2014].
[22] From Metabolite to Metabolite, Department of Biological
Science and Technology,
Institute of Bioinformatics National Chiao Tung University,
Hsinchu, Taiwan,
[Interactiv]. Available: http://fmm.mbc.nctu.edu.tw/index.php.
[Accesat 09 06 2014].
[23] Finja Bchel, Nicolas Rodriguez, Neil Swainston, Clemens
Wrzodek, Tobias Czauderna,
Roland Keller, Florian Mittag, Michael Schubert, Mihai Glont,
Martin Golebiewski,
Martijn van Iersel, Sarah Keating, Matthias Rall, Michael
Wybrow, Henning
Hermjakob, etc., Path2Models: large-scale generation of
computational models from
biochemical pathway maps, BMC System Biology, 2013.
[24] W. contributors, Butanediol fermentation, Wikipedia, The
Free Encyclopedia., 29 10
2013. [Interactiv]. Available:
http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Butanediol_fermentation&oldid=579296550.
[Accesat 12 06 2014].
[25] Denisa-Constantina Amzoiu, Prof. univ. dr. Florica Popescu,
Cercetri farmacologice i
modele virtuale predictive asupra implicrii unor derivai din
clasa oxicamilor n tresul
oxidativ la pacieni cu boal artrozic, Universitatea de Medicin i
de Farmacie din
Craiova , 2011.
[26] O. Trott, A. J. Olson, AutoDock Vina: improving the speed
and accuracy of docking
with a new scoring function, efficient optimization and
multithreading, Journal of
Computational Chemistry, vol. 31, pp. 455-461, 2010.
-
Producerea de 1,4-butandiol prin fermentare cu ajutorul
microorganismelor modificate genetic prin inginerie
metabolic.
52