Recombinação em estreptomicetos

UERGS

Prof. Dra Adriana Dantas

Características gerais do Gênero Streptomicetos Streptomices são bacterias Semelhança a genética de fungos Bactérias gram positivas Apresentam esporos Produzem colônias com micélio septado Colônias brancas tornando-se acizentadas pela

formação dos esporos Hifas aéreas

Importância para estudos genéticos Distância taxônomica em relação a

outra bactérias Complexidade morfológica Papel aplicado a industria de

antibióticos

Genética de Streptomyces

Cromossomo de Streptomycetos Um procarioto – apresenta um único

cromossomo sem extremidades Mapeamento de genes do S. coelicolor:

262 centimorgans Genes equivalentes se distanciam a

180° Origem provável do cromossomo

S. coelicolor por duplicação cromossômica

Marcos geneticos no cromossomo de Streptomyces coelicolor (180°)

leu A

cys A

ser B

whi B

met Bleu B

CysC; cysD

ser A

whi A

met A

Streptomyces coelicolor é um representante do grupo de solo-moradia, bactérias filamentosas responsáveis pela produção de antibióticos naturais mais utilizados na medicina humana e veterinária.

8.667.507 pares de bases do cromossomo linear deste organismo, que contém o maior número de genes até agora descobertos em uma bactéria.Os 7.825 genes previstos incluem mais de 20 agrupamentos de codificação para conhecidos ou previstos metabólitos secundários.

O genoma contém uma proporção sem precedentes de genes reguladores.

Um sintenia antiga foi revelado entre o "núcleo" central do cromossomo eo cromossomo inteiro de patógenos Mycobacterium tuberculosis e Corynebacterium diphtheriae.

A sequência do genoma vai aumentar muito nossa compreensão da vida microbiana no solo, bem como auxiliando na geração de novos fármacos por engenharia genética.

A

B

C

D

A´

B´

C´

D´

A

D

C

B

A´

B´

C´

D´

A´

B´ C´

D´

A

B

C

D

Origem do cromossomo Streptomyces

Mutantes em Streptomices

Auxotróficosserina, metionina, leucina, cisteína, etc

Resistentes a agentes inibidores: Ultra violeta, streptomicina

Morfológicos bald=micélio aéreo, white=colônia branca, sem

esporos

Resistentes a bacteriófagos Mutantes sensíveis a temperatura (t.o.30°C)

Conjugação Sermonti e Spada-Sermonti (1955) Recombinação sexual

S. colicolor, S rimosus, S fradie, S griseoflavus e S. scabies

Alguns cruzamento chegam a 0,001% de recombinantes

Três tipos de linhagensNF (normal fertility), IF (initial fertility), UF (ultra

fertility)

Plasmidio SCP1 – fator sexual

Transferência por conjugação de replicons circular e linear (a) cromossomo circular plasmídeo (F) e

circular (HFR) em E. coli: em ambos os casos, F-proteínas específicas realizar um evento nicking priming-a ORIT na F DNA, onde a extremidade 5‘ é covalentemente ligado a um das proteínas de transferência (TRAI), e um círculo rolante replicação é iniciada no final do 3.

Em células Hfr, o DNA cromossômico é liderado pela seqüência de F para a célula recipiente como um exogenote.

(b) Linear plasmídeos e cromossomos lineares de Streptomyces. As extremidades TP-capped pode agir como a origem da transferência (ORIT), onde o suposto TP-preparado de replicação é iniciada, e 5 ‘ TP-bound é deslocado e transferido, como para F / Hfr.

Conjugação IF tem plasmidio, SPC1 autônomo: SPC1+ e F+

Perda de IF – origina UF (sem plasmidio) UF sem plasmidio SPC1: F-

IF x UF – transferência de 100% do plasmidio, mas com 0,001% de recombinação

NF tem SPC1 integrado ao cromossomo: Hfr NF x UF – transferência plasmidio e fragmentos

do cromossomoCruzamento Fertilidade

IF x UF 0,01% recombinantes

NF x UF 100% fertilidade

UF x UF 0,001% recombinantes

NF x NF 1% de fertilidade

IF x IF 0,01% fertilidade

NF x IF 10% fertilidade

Reconhecimento dos tipos de fertilidade: Técnica de uma placa-mestra com 24 colônias

-o-o-o-o-o-o--o-o-o-o-o-o--o-o-o-o-o-o--o-o-o-o-o-o-

Placa-mestra (24 colônias)

Crescem:

NF ()IF ()

Crescem:IF ()UF ()

NF ()

Placa testadora: UF

Placa testadora: NF

Transferência Transferência para MM

Transferência para MM

Transferência

Tipos possíveis de cruzamentos

Cruzamento* % recombinação

Fragmentos transferidos

Direção**

SCP1- x SCP1- 0,001 Acaso Não-polarizada

SCP1+ x SCP1+ 0,01 Acaso Não-polarizada

SCP1+ x SCP1- 0,01 Heteroclone Misturada

SCP1 X SCP1 1 Acaso Não-polarizada

SCP1 x SCP1+ 10 Não ao acaso Polarizada

SCP1 x SCP1+ 100 Não ao acaso Polarizada

*SCP1- = UF; SCP1+ = IF; SPC1 = NF**Polarizada = há um doador; Não-polarizada = ambos pais atuam como doador e receptor

Técnicas de cruzamento Cultura mista

duas linhagens auxotróficas, com duas marcas, inoculadas em estria, uma sobre a outra em meio inclinado

Três dias a 30°C Filtragem em açlgodão

adiciona-se 2 mL água destilada esterilizada com

0,01% de espalhante,

Transferência novo tubo, centrifugação: 107 esporos / mL

Cada 106 aparece 103 recombinantes

Seleção dos recombinantes:Semeadura em meios mínimos (MM) com suplementação apropriadaOnde a¯, b¯, c¯ e d¯ são genes para requisitos

nutricionais

Cruza-se: a¯b¯ X c¯d¯

Semea-se:

MM + a + c

MM + a + d

MM + b + c

MM + b + d

Formação dos Heteroclones

Sermonti, Mancinelli e Spada-Sermonti (1960)São colônias pequenas vindas de culturas mistas e

dão esporos recombinantesSão merozigotos, crescem mal em MM

Métodos para marcas próximas e em repulsão : met2 phe1 str1 X his1 ura1

Colônias strr (resistentes) Colônias strs (suscetíveis)

met, ura 5his, ura 17ura 1met 2his 1met, ura, phe 1

met, ura 5his, ura 15ura 3met 0his 0met, ura, phe 0

Heterocariose

Fusão de hifas e transferência de cromossomos para um citoplasma

Ocorre entre linhagens da mesma espécie e entre diferente espécies de mesmo gênero

Obtida por meio de mistura de esporos Apenas parte do genoma é transferido Progênies da mistura de duas linhagens:

Heterocário (segregantes iguais aos pais)Merozigoto (heteroclone)

Formação do merozigoto dando recombinante diretamente ou heteroclone

A´

A A´

A

RecombinantePermuta dupla (ou par)

A

A´

Permuta simples

A