Recherche des facteurs génétiques en cause dans les ... · V maladie du foie chez les adultes V V 1AT Wild-type Z-1AT 1AT Z-1AT Absence de sécrétion: Emphysème Cirrhose ... Maladie

Marion Bouchecareilh INSERM U1053 Bordeaux

3ème journée Filfoie, 16 Novembre 2017, Paris

Recherche des facteurs génétiques en cause dans les hépatopathies associées au déficit en Alpha 1-Antitrypsine

Surface Cellulaire

!  Glycoprotéine de 52 kDa

!  Produite et sécrétée principalement par les hépatocytes

!  Inhibiteur général des sérine-protéases

!  Activité essentielle au niveau des poumons - Dégradation de l’élastine composante clé de la matrice extracellulaire des alvéoles

!  Production hépatique cruciale pour maintenir:

- Balance de protéases/antiprotéases - Intégrité des poumons

Golgi

Noyau

V

V

V

Réticulum Endoplasmique

(RE)

1AT

1AT

Alpha 1-Antitrypsine (1AT)

V

V

V

1AT Wild-type Absence de

sécrétion: Emphysème

Z-1AT 1AT

!  Plusieurs mutations d’1AT = 1ATD (1/2500)

!  Absence de trafic et de sécrétion

Déficit en Alpha 1-Antitrypsine (1ATD)



!  Mutant Z (E342K):

- le plus sévère et le plus commun

-Substitution d’un glutamate en lysine à la position 342

V

V

V

1AT Wild-type

Z-1AT

Z-1AT 1AT

Absence de sécrétion:

Emphysème







- Formation et accumulation d’agrégats

V

V

V

1AT Wild-type

Z-1AT

Z-1AT 1AT


Emphysème








V

V

V

1AT Wild-type

Z-1AT

Z-1AT 1AT


Emphysème








V

V

V

1AT Wild-type

Z-1AT

Z-1AT 1AT


Emphysème


Z-1AT

Biologie du mutant Z-1AT

Z-1AT

Z-1AT

1


Z-1AT

Z-1AT

1

2


Z-1AT

Z-1AT

1

2 3








- Cirrhose (≈ 8% des patients ZZ)

V

V

V

1AT Wild-type

Z-1AT

Z-1AT 1AT


Emphysème

Cirrhose

toxic








- Cirrhose (≈ 8% des patients ZZ)

- Cause beaucoup plus fréquente de maladie du foie chez les adultes V

V

V

1AT Wild-type

Z-1AT

Z-1AT 1AT


Emphysème

Cirrhose

toxic


!  Variabilité considérable dans la survenue et la sévérité des dommages hépatiques associés au déficit en 1AT

!  Impossibilité de prédire quelles sont les personnes à risque de développer des dommages au foie

Déficit en Alpha 1-Antitrypsine (1ATD) et foie

Quels sont les facteurs génétiques associés au déficit en 1AT et impliqués dans les dommages

hépatiques?

!  Variabilité considérable dans la survenue et la sévérité des dommages hépatiques associés au déficit en 1AT

!  Impossibilité de prédire quelles sont les personnes à risque de développer des dommages au foie

Déficit en Alpha 1-Antitrypsine (1ATD) et foie

Crible génétique

Identification de gènes candidats

Validation dans cellules humaines

Gènes validés: cibles thérapeutiques

biomarqueurs

Séquençage d’Exome ADN de fratries

(Frères/sœurs ZZ avec et sans atteintes hépatiques)

Approche Expérimentale

Crible génétique



Gènes validés: cibles thérapeutiques

biomarqueurs

Séquençage d’Exome

Pr. A. Lachaux Cohorte DEFI-ALPHA/

POLYGEN (≈150 patients, informations et échantillons biologiques)

ADN de fratries (Frères/sœurs ZZ avec et sans atteintes hépatiques)


Séquençage d’Exome

Crible génétique


Herp

HRD1

Pr. A. Lachaux Cohorte DEFI-ALPHA/

POLYGEN

Collaboration Gitler Lab (Standford, CA, USA)


Protéines Mal-conformées

HRD1 Herp

ERAD:Endoplasmic Reticulum Associated Degradation

Voie de signalisation: ERAD

Modèles cellulaires du déficit en 1AT Crible génétique/Séquençage d’Exome



ER

1AT

Secreted

Golgi

Nucleus

1AT

Z-AAT

Z-AAT

Cell Surface

Z-1AT 1AT

Validation des gènes candidats




ER

1AT

Secreted

Golgi

1AT

Z-1AT

Z-1AT

Cell Surface

Z-1AT 1AT


Nucleus

-HRD1

Z-1AT 1AT

-HRD1

1

Cel

l Via

bilit

y

siRNA: HRD1 Scr

15000

30000

45000

0

*

WT-1AT

Z-1AT




L’extinction d’HRD1 diminue la viabilité des cellules exprimant

le mutant Z


Herp

Z-1AT Z-1AT

Herp R50H





Herp

Z-1AT Z-1AT

Herp R50H

Modèles cellulaires du déficit en 1AT

*

0

50

100

pcDNA Herp R50H pcDNA Herp R50H 0

50

100

Num

ber o

f cel

ls (%

)

Le variant Herp R50H diminue la prolifération et la viabilité cellulaires

Crible génétique/Séquençage d’Exome




Z-1A

T Scr HRD1 Herp

Hsp90

siRNA:

0

2,5

5

scr si hdr1 si herp Scr HRD1 Herp 0

5

2.5

Rel

ativ

e Z-

1AT

prot

ein

*

*

*

*

Immature (I): Forme du RE Mature (Mat): Forme post-RE

Mat I

siRNA:

L’extinction de Herp et HRD1 augmente la forme immature du mutant Z-1AT


Z-1A

T Scr HRD1 Herp

Hsp90

siRNA:

0

2,5

5

scr si hdr1 si herp Scr HRD1 Herp 0

5

2.5

Rel

ativ

e Z-

1AT

prot

ein

*

*

*

*

Immature (I): Forme du RE Mature (Mat): Forme post-RE

Mat I

siRNA:

Z-1AT

GAPDH

Insoluble Soluble

siRNA:

L’extinction de Herp et HRD1 augmente la formation des agrégats du mutant Z-1AT

L’extinction de Herp et HRD1 augmente la forme immature du mutant Z-1AT


Z-1AT

Défaut ERAD

Z-1AT

ERAD - mutant Z-1AT

Z-1AT

Unfolded Protein Response (UPR)

Z-1AT

ERAD - mutant Z-1AT - Hypothèse

Z-1AT

Z-1AT

Unfolded Protein Response (UPR)

Défaut ERAD

ERAD - mutant Z-1AT - Hypothèse

Z-1AT 1AT

Mesure de l’UPR: Marqueurs BiP et Herp

Déficit en 1AT et Unfolded Protein Response

Les agrégats seuls du mutant Z-1AT n’activent pas l’UPR

Herp

Hsp90

Bip

WT-1AT - - + + Tun

Z-1AT WT-AAT Z-AAT


Les cellules exprimant le mutant Z-1AT présentent une hyperactivation de l’UPR

WT-1AT - - + + Tunicamycine

Z-1AT WT-1AT Z-1AT

Herp

Hsp90

Bip


Les cellules exprimant le mutant Z présentent une hyperactivation à l’UPR suite à l’extinction d’HDR1 et de Herp

Une dérégulation de l’ERAD induit la mort cellulaire via une hyperactivation de l’UPR

Scr HRD1 Herp Z-1AT WT-1AT

Tun

0

0,5

1

1,5

2

2,5

scr si hrd1

0

0,5

1

1,5

2

scr si hrd1 0

0.5

1.0

2.0

2.5

1.5

0

0.5

1.0

2.0

1.5

Scr siHRD1 Scr siHRD1

* *

WT-1AT

Z-1AT

NS *H

erp

expr

essi

on

(fold

cha

nge)

BIP

exp

ress

ion

(fo

ld c

hang

e)

Herp

Hsp90

Bip

Scr HRD1 Herp Tun Scr HRD1 Herp Tun

siRNA:

siRNA: Z-1AT

Scr HRD1 Tun

WT-1AT

Hsp90

siRNA: siRNA:

Z-1AT 1AT

Mesure de l’UPR: Marqueurs BiP et Herp


HFE rs1799945 C187G H63D

Pr. A. Lachaux Cohorte DEFI-ALPHA/POLYGEN

ADN de fratries

Séquençage Exome Analyse Bionformatique

Collaboration Gitler Lab (Standford, CA, USA)

(Frères/sœurs ZZ avec et sans atteintes hépatiques)


Crible génétique/Séquençage d’Exome


Pipeline expérimental: Séquençage d’Exome

Surface Cellulaire

Golgi

Noyau

RE

HFE

Régulation cellulaire du métabolisme du fer

HFE

Surface Cellulaire

Golgi

Noyau

RE

HFE H63D

Hémochromatose: Maladie génétique

associée à des hépatopathies

HFE H63D

- Les patients déficitaires en 1AT et porteurs de la mutation HFE-H63D développent une cirrhose plus précocement.

HFE H63D induit une activation des caspases et réduit la proliferation cellulaire et ceci est associé avec une activation prolongée de l’UPR

Liu et al 2011

HFE et 1ATD

0

20

40

60

80

100

120

scr hrd1 herp IB3 M scr+H63D

IB3 M si hrd1

+H63D

IB3 M si herpud +H63D

0

60

100

Num

ber o

f cel

ls (%

)

20 40

80

120 WT-1AT

Z-1AT

* *

Scr siHRD1 siHerp siRNA: Scr siHRD1 siHerp

*

*

+ HFE-H63D

Z-1AT 1AT

L’expression HFE H63D associé à un défaut de l’ERAD diminue la prolifération et la viabilité des cellules du mutant Z

HFE H63D et 1ATD

Variants Herp R50H et HFE H63D : facteurs génétiques impliqués dans la progression des dommages au foie associés à l’1ATD.

HFE H63D et 1ATD

Modèle

Modèle

Cohorte DEFI-ALPHA

Séquençage Exome Analyse Bioinformatique

Validation and caractérisation

… To be continued

Biomarqueurs?

Conclusion et Perspectives

Cohorte DEFI-ALPHA

Séquençage Exome Analyse Bioinformatique

Validation and caractérisation

… To be continued

Biomarqueurs?


Autres sous-groupes de patients?

Autre maladies rares

pédiatriques du foie

(Mucoviscidose, Wilson…)?

Inhibiteurs de l’UPR comme

thérapeutique?


Association de la microdissection laser à la spectrométrie de masse

Quels sont les modificateurs associés aux maladies rares pédiatriques du foie?

(Bordeaux, France)

Perspectives

Alpha 1-Antitrypsine

Mucoviscidose

Maladie de Wilson

Atrésie des voies Biliaires

Foie sain

Pr. A. Lachaux Pr S. Collardeau-

Frachon

Perspectives


Mucoviscidose

Maladie de Wilson




Mucoviscidose

Maladie de Wilson


Perspectives


Mucoviscidose

Maladie de Wilson


Identification de cibles candidates

Validation échantillons biologiques et cellules

humaines

cibles thérapeutiques biomarqueurs

Perspectives

A plus long terme…

Equipe Dr. Moreau (BaRITOn – U1053) Violaine Moreau Frédéric Saltel Paulette Bioulac Anne-Aurélie Raymond Sylvaine Di Tommaso

Equipe Pr. Cullin Christophe Cullin Christelle Marchal Hélène Vignaud

Equipe Pr. Lachaux Abdelouahed Belmalih Sophie Collardeau-Frachon Philippe Joly Alain Lachaux Lioara Restier

Equipe Pr. Arveiler Benoit Arveiler Patricia Maurin

Gitler Lab Julien Couthouis

Remerciements

Cellular tools

Genomic screen

Identification of candidates genes

Transformation with Z-AAT

Humanortholog

Gene DescripBon

YNL330C/RPD3HistonedeacetylaseHDAC2

YNL041C/COG6ComponentofOligomericCOG6GolgiComplex6

YPL180W/TCO89SubunitofTORC1mTORC1

YDR116C/MRPL1MitochondrialribosomalMRLP1

YOL013C/HRD1UbiquiBn-proteinligaseHRD1

Genomic screen

Outils cellulaires

Genomic screen

Identification of candidates genes

Genomic screen

Empty Vector Wild type AAT

Z-AAT

Expression Not Induced

Expressioninduced

HRD1∆

BY4247

Empty Vector Wild type AAT

Z-AAT

0

15000

30000

45000

mTOR RpTOR HD2 HRD1 COG6 MRLP1 NT Mg nontraité

1 WT-AAT Z-AAT

#

Cel

l Via

bilit

y - Candidates Genes - Candidates Genes

Validation of Candidates genes

mTOR RpTOR HD2 HRD1 COG6 MRLP1 Scr

15000

30000

45000

0

Unfolded Protein Response

DecreaseproteintranslaBon

Commonresponses:ERprocessing/Chaperones/Expansion;Vesicular

trafficking;Lipidmetabolism/ERAD

RIDD

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