Estratégias de Optimziación Adriana Freire Machado MSc Especialista de Aplicação Eppendorf do Brasil Realplex Adriana Freire Machado Eppendorf do Brasil Optimización de la Reacción • Preparo da reacción (pipetas calibradas) • Cualidad del template (molde) • Diseño de los primers (dimers) • Condiciones de termociclagem • Característica del equipo • Concentración de los reactivos (MgCl2) • Tamaño del amplicon Diseño de primers • Es la etapa mas importante para establecer una nueva reacción de PCR • Un buen diseño no es garantía, pero esto aumenta la posibilidad de suceso e de esa forma, ahorra: Realplex Adriana Freire Machado Eppendorf do Brasil
20
Embed
Realplex Optimización de la Reacción - Blog de ESPOLblog.espol.edu.ec/grakavas/files/2012/01/optimizacion1.pdf · Diseño de primers Realplex Adriana Freire Machado Eppendorf do
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Estratégias de Optimziación
Adriana Freire Machado MScEspecialista de AplicaçãoEppendorf do Brasil
Realplex
Adriana Freire Machado
Eppendorf do Brasil
Optimización de la Reacción
• Preparo da reacción (pipetas calibradas)
• Cualidad del template (molde)
• Diseño de los primers (dimers)
• Condiciones de termociclagem
• Característica del equipo
• Concentración de los reactivos (MgCl2)
• Tamaño del amplicon
Diseño de primers
• Es la etapa mas importante para establecer una nueva reacción de PCR
• Un buen diseño no es garantía, pero esto aumenta la posibilidad de suceso e de esa forma, ahorra:
Realplex
Adriana Freire Machado
Eppendorf do Brasil
Diseño de primers
• Busque la secuencia de interese http://www.ncbi.nlm.nih.gov
• Tamaño:18 a 30 bases
• Cuantidad GC: 30 a 80%(ideal 40 a 60%)
• Temp. de melting: 60ºC (dos pasos)
• ∆Tm primer forward y reverse primer ≤ 4 °C
• Evitar nt idênticos, especialmente de 3 o mas Gs o Cs en el final 3´
• Tamaño del fragmento: 80 a 150 pb
Realplex
Adriana Freire Machado
Eppendorf do Brasil
Diseño de primers
• Evitar estructuras secundarias
• Evitar dímeros de primers
Realplex
Adriana Freire Machado
Eppendorf do Brasil
Diseño de primers
• Verificar se los primers son únicos y específicos
BLAST
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast
Realplex
Adriana Freire Machado
Eppendorf do Brasil
Diseño de primers
Realplex
Adriana Freire Machado
Eppendorf do Brasil
Diseño de primers
Realplex
Adriana Freire Machado
Eppendorf do Brasil
Diseño de sonda
• Busque una región rica en GC
• Tm sonda 10ºC > Tm primers
• Tm 70ºC la sonda se hibrida inmediatamente antes de la mayor eficiencia de la polimerasa
• GC: 20-80%
• Verificar especificidad
• Nunca puede haber G en el extremo 5’ (quenchernatural)
Adriana Freire Machado
Diseño de sondas
• Cheque estructura secundaria
• Cheque se existe complementariedad entre primers y
• A340 ~0,0 =fuera indica presencia de material particulado
33
Photometria consejos & trucos
• pH 7 - 8.5: Comportamiento da absorción de AN depende de
pH & fuerza iónica. En bajo contenido de sal el pH debe ser 7-8.5 (TRIS). La agua lleva a resultados falsos
• Blank: use lo mismo buffer para blank & muestras para
medidas precisas
• Clear sample: burbujas de aire o partículas interfieren
fuertemente en la medida
3403.08.2010
Rafal GrzeskowiakEppendorf AG
Photometría consejos & trucos
• Mezcle: Diferencias en la concentración llevan a medidas
inestables y falsas!
Frecuentemente sub-estimado!
30 sec in separate tube
MixMate: 2D Mix control
Adriana Freire Machado
real-time PCR efficiency and amplification performance
PCR inhibitors:Hemoglobin, Urea, Heparin
Organic or phenolic compounds
Glycogen, Fats, Ca2+
Tissue matrix effectsLaboratory items, powder, etc.
RNA / DNA
degradation
PCR reaction
components
DNA
concentration
tissue
degradation
PCR enhancers:DMSO, Glycerol, BSA
Formamide, PEG, TMANO, TMAC etc.
Special commercial enhancers:Gene 32 protein, Perfect-Match, Taq-
Extender, AccuPrime, E. Coli ss DNA binding
unspecific
PCR productsDNA dyes
lab management
hardware:PCR platform & cups
cycle conditions
Adriana Freire Machado
Principio del equipo
Fuente de luz de ExcitaciónLED
Laser
Lâmpada de Tungstênio
Filter
DetectorCCD
Fotodiiodo
Fotomultiplicador
TermocicladorPeltier
Air
Módulo Óptico
Realplex
Mastercycler ep realplex
Cual es la fuente de excitación del Mastercycler ep
realplex?
El Mastercycler ep realplex usa una matriz de 96 LEDs
longitud onda de excitación de 470 nm.
Real time PCR-fuente de excitación
Leds (Light-Emitting
Diiodes)
lámpara LASER
Media de vida 40.000 horas 2.000 a
3.000 horas
5.000 a 50.000
horas
Necesidad de enfriamiento
no sí si
“efecto borda” no sí no
Pierda de 0,0007% de intensidadDespués 50 corridas por semana cada
reacción con multiplex de 4 alvos durante 50 semanas
Pierda de 5% de intensidad después 7200 anos
Adriana Freire Machado
Función gradiente
RealplexAdriana Freire Machado
Mastercycler ep realplex - Performance
• Fast real-time PCR: Velocidad y Precisión
SR
Y T
aqM
an A
ssa
y
Runtime: 72 min Runtime: 42 min 02 sec
Runtime: 35 min 37 sec Runtime: 23 min 34 sec
Standard ABI like 2-step profile realplex standard 2-step profile
realplex very fast 2-step profilerealplex fast 2-step profile
St.dev.: 0.05 St.dev.: 0.07
St.dev.: 0.08St.dev.: 0.09
Realplex
Mastercycler ep realplex - Desempeño
• Sensibilidad: Detección de Molécula Simple
SRY TaqMan Assay, 1 copy human gDNA
Ø Ct: 37.03
Características Realplex
• Excitación por 96 LEDs
• Tecnología gradiente
• Abierto para consumíbles y reactivos
• Bloque rápido: plata 6°C/s calentamiento y 4,5°C/s enfriamiento. No necesita de reactivos o placas “fast”. El bloque que es rápido. Reacciones en 30min.
• Uso como uno termociclador convencional
• Garantía de 2 años y accesoria científica
Adriana Freire Machado
Adriana Freire Machado
real-time PCR efficiency and amplification performance
PCR inhibitors:Hemoglobin, Urea, Heparin
Organic or phenolic compounds
Glycogen, Fats, Ca2+
Tissue matrix effectsLaboratory items, powder, etc.
RNA / DNA
degradation
PCR reaction
components
DNA
concentration
tissue
degradation
PCR enhancers:DMSO, Glycerol, BSA
Formamide, PEG, TMANO, TMAC etc.
Special commercial enhancers:Gene 32 protein, Perfect-Match, Taq-
Extender, AccuPrime, E. Coli ss DNA binding
unspecific
PCR productsDNA dyes
lab management
hardware:PCR platform & cups
cycle conditions
Real-time PCR Tube Strips y Twin.tec real-time PCR
Adriana Freire Machado
Twin.tec real-time PCR plate
Adriana Freire Machado
Aumento del señal: 10x mas fuerte
Sellador térmico y film adhesivo
Heat Sealer ®
• Selado térmico y hermético de placas
• Protección ideal para la PCR contra la
evaporación, evita la contaminación cruzada
Film adhesivo Mastercycler real-time PCR ®
• está destinado a sellar placas de PCR y
tempo real tanto por fricción como por la presión ejercida por la tapa calentada