RAPPORT D’ESSAI R-DDVCON00_A page 1 / 31 REPRODUCTION ET DIFFUSION INTERDITES SANS AUTORISATION. Rapport d’essai R-DVVCON001_A Détermination de l’activité bactéricide, fongicide, levuricide, mycobactéricide et virucide du dispositif de désinfection par la vapeur _ selon le protocole du projet de la norme NF T72-110 CLIENT A CONCEPT VAPEUR A l’attention de JC Martinez 40, rue Nicephore Niepce 42000 St Etienne PRESTATION EFFECTUÉE PAR S.A.S VIRHEALTH Site Laennec-La Buire, 2éme étage, Bat B 7-11 rue Guillaume Paradin, 69372 Lyon Cedex 08 CONTRIBUTION TECHNIQUE Anaïs Proust, responsable laboratoire Approbateur/Validation Qualité Nom : Dr Vincent Moulès, CEO Date : Lyon, le 02/05/2018 Signature : Ce rapport comporte 31 pages
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Rapport d’essai R-DVVCON001 A · RAPPORT D’ESSAI R-DDVCON00_A page 5 / 31 REPRODUCTION ET DIFFUSION INTERDITES SANS AUTORISATION. II. RÉSUMÉ DE L’ESSAI L’essai consiste
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REPRODUCTION ET DIFFUSION INTERDITES SANS AUTORISATION.
A CONCEPT VAPEUR A l’attention de JC Martinez 40, rue Nicephore Niepce 42000 St Etienne
PRESTATION EFFECTUÉE PAR
S.A.S VIRHEALTH Site Laennec-La Buire, 2éme étage, Bat B 7-11 rue Guillaume Paradin, 69372 Lyon Cedex 08
CONTRIBUTION TECHNIQUE
Anaïs Proust, responsable laboratoire
Approbateur/Validation Qualité
Nom : Dr Vincent Moulès, CEO Date : Lyon, le 02/05/2018 Signature :
Ce rapport comporte 31 pages
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SOMMAIRE
I. CONCLUSION..........................................................................................................4
II. RÉSUMÉ DE L’ESSAI..............................................................................................5III. DOCUMENTS CONTRACTUELS...........................................................................6IV. DONNÉES CONCERNANT LES ÉCHANTILLONS ET LES CONDITIONS D’ESSAI................................................................................................................................7
IV.IIdentification des échantillons.........................................................................................................7IV.II Conditions expérimentales.....................................................................................................7
A. Conditions d’essai..................................................................................................................7
a. Activité bactéricide ................................................................................... 7b. Activités fongicide et levuricide ...................................................................... 8c. Activité mycobactéricide ............................................................................. 8d. Activité virucide ...................................................................................... 8
V. RESULTATS..............................................................................................................9V.I Activité bactéricide du dispositif de désinfection par la vapeur......................................................9
A. Staphylococcus aureus...........................................................................................................9
a. Essais préliminaires ................................................................................... 9b. Suspension d’essai et surfaces témoins .............................................................. 9c. Essai .................................................................................................. 10
B. Escherichia coli...................................................................................................................12
a. Essais préliminaires .................................................................................. 12b. Suspension d’essai et surfaces témoins ............................................................. 12c. Essai .................................................................................................. 13
V.IIActivité fongicide et levuricide du dispositif de désinfection par la vapeur..................................15A. Aspergillus brasiliensis........................................................................................................15
a. Essais préliminaires .................................................................................. 15b. Suspension d’essai et surfaces témoins ............................................................. 15c. Essai .................................................................................................. 16
B. Candida albicans.................................................................................................................18
a. Essais préliminaires .................................................................................. 18b. Suspension d’essai et surfaces témoins ............................................................. 18c. Essai .................................................................................................. 19
V.III Activité mycobactéricide du dispositif de désinfection par la vapeur..................................21A. Mycobacterium terrae..........................................................................................................21
a. Essais préliminaires .................................................................................. 21
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b. Suspension d’essai et surfaces témoins ............................................................. 21c. Essai .................................................................................................. 22
V.IV Activité virucide du dispositif de désinfection par la vapeur...............................................24A. Norovirus murin de type 1...................................................................................................24
a. Essais préliminaires .................................................................................. 24b. Essai et surfaces témoins ............................................................................ 24
B. Adénovirus de type-5...........................................................................................................26
a. Essais préliminaires .................................................................................. 26b. Essai et surfaces témoins ............................................................................ 26
VI. ANNEXES................................................................................................................28VI.IMatériels et réactifs.......................................................................................................................28
A. Activités bactéricides...........................................................................................................28
B. Activités fongicide et levuricide..........................................................................................28
C. Activités Mycobactéricide...................................................................................................29
D. Activité virucide..................................................................................................................29
E. Préparation des réactifs........................................................................................................30
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I. CONCLUSION
Il est considéré que le dispositif de désinfection par la vapeur (DVV) satisfait au projet de norme NF
T72-110 s’il induit, dans un essai valide avec la substance interférente définie pour la condition de
saleté du domaine médical, une réduction d’au moins 5 LOG lorsque les microorganismes d’essai sont
les bactéries : Staphylococcus aureus et Escherichia coli, une réduction d’au moins 4 LOG lorsque les
microorganismes d’essais sont les moisissures Aspergillus brasiliensis et la levure Candida albicans,
une réduction d’au moins 4 LOG lorsque les microorganismes d’essai sont les mycobactéries
Mycobacterium terrae et une réduction d’au moins 4 LOG lorsque les microorganismes d’essai sont
les virus norovirus murin de type-1 (MNV-1) et l’adénovirus de type 5.
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II. RÉSUMÉ DE L’ESSAI L’essai consiste à déterminer l’activité désinfectante des dispositifs de désinfection par la vapeur.
L’activité bactéricide du DDV sur les bactéries Staphylococcus aureus et Escherichia coli, l’activité
fongicide et levuricide sur la moisissure Aspergillus brasiliensis et sur la levure Candida albicans,
l’activité mycobactéricide sur les mycobactéries Mycobacterium terrae et l’activité virucide sur
l’adénovirus de type 5 et sur le norovirus murin (MNV-1) selon les conditions expérimentales
obligatoires du projet de norme NF T72-110 en condition de saleté du domaine médical.
Les résultats ont montré que le couple générateur accessoire Box vapeur du DDV en condition de
saleté du domaine médical induit :
- un abattement logarithmique supérieur à 5 sur les bactéries Staphylococcus aureus
Escherichia coli
- un abattement logarithmique supérieur à 4 sur la moisissure Aspergillus brasiliensis et sur la
levure Candida albicans
- un abattement logarithmique supérieur à 4 sur les mycobactéries Mycobacterium terrae
- un abattement logarithmique supérieur à 4 sur les virus : l’adénovirus de type 5 et le norovirus
murin (MNV-1)
Les résultats obtenus sont conformes aux exigences du projet de norme NF T72-110 dans les conditions de l’essai.
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III. DOCUMENTS CONTRACTUELS Il a été demandé à la société VIRHEALTH d'effectuer des essais selon le projet de norme :
- NF T72-110
Pour le compte de la société : CONCEPT VAPEUR
L’essai a été réalisé sur le Dispositif de Désinfection par la Vapeur suivant : - Générateur : Box vapeur - Accessoire : brosse de 23 cm munie d’une chaussette microfibre (150 g/m2)
La présente prestation est définie par les documents suivants :
. Devis 1804DEPP001
. Commande Bon pour accord en date du 05/04/2018
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IV. DONNÉES CONCERNANT LES ÉCHANTILLONS ET LES CONDITIONS D’ESSAI
IV.I Identification des échantillons
ProcédédedésinfectionNom Générateur vapeur Box vapeurNuméro de série 1801127
Nom de l’accessoireBrosse 23 cm +
chaussette microfibre (150g/m2)
Producteur Date de production
CONCEPT VAPEUR Janvier 2018
Type d’application Manuelle avec contactCaractéristiques techniques Volume chaudière Puissance de chauffe Gestion de la température
Temps de séchage des supports 45 minutes Méthode pour arrêter l’action du biocide 10 mL de milieu infection sans SVF Dates de l’essai et de l’essai préliminaire 17/04/2018 et 27/04/2018
Tableau 5 : conditions expérimentales pour évaluer l’activité virucide
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V. RESULTATS
V.I Activité bactéricide du dispositif de désinfection par la vapeur
Explications : - n1 = nombre de colonies obtenues par dénombrement en gélose de la solution de recueil des
surfaces exposées non inoculés (UFC/mL) mise en contact avec la suspension d’essai - N1 = nombre de colonies obtenues par dénombrement en gélose de la suspension d’essai
(UFC/mL) Dans les conditions de l’essai, les potentiels résidus de la vapeur n’ont pas d’effets résiduels
sur la gélose. La vapeur n’induit pas d’effet inhibiteur sur la bactérie Staphylococcus aureus
dans les conditions de l’essai une fois l’activité du produit arrêtée.
b. Suspension d’essai et surfaces témoins
Suspension d’essai (N)
Suspension d’essai N1 9,9.108
N2 1,0.109
5.107≦ N1 ≦2.109 ☒ oui ☐ non
Explications :
- N1 = nombre de colonies obtenues par dénombrement en gélose de la suspension d’essai (UFC/mL) - N2 = nombre de colonies obtenues par dénombrement sur membrane de la suspension d’essai (UFC/mL)
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Surfaces témoin (T)
Surface témoin T Log T
6,3.107 7,8
Validation Log T ≥ 5+1 LOG ☒ oui ☐ non
Explications :
- T = Moyenne du nombre de bactéries dans les 10 mL de milieu de récupération des trois surfaces témoins inoculées mais non exposées (C4, C5 et C6).
Surfaces témoin effet mécanique (TEM)
Surface témoin TEM Log TEM
5,0.107 7,7
Validation Log T ≥ 5+1 LOG ☒ oui ☐ non
Explications :
- TEM = Moyenne du nombre de bactéries dans les 10 mL de milieu de récupération des trois surfaces témoins inoculées, non soumises à l’effet de la vapeur mais soumises à l’effet mécanique de l’accessoire (poids et mouvement de l’accessoire).
Explications : - n1 = nombre de colonies obtenues par dénombrement en gélose de la solution de recueil des
surfaces exposées non inoculés (UFC/mL) mise en contact avec la suspension d’essai - N1 = nombre de colonies obtenues par dénombrement en gélose de la suspension d’essai
(UFC/mL) Dans les conditions de l’essai, les potentiels résidus de la vapeur n’ont pas d’effets résiduels
sur la gélose. La vapeur n’induit pas d’effet inhibiteur sur la bactérie Escherichia coli dans les
conditions de l’essai une fois l’activité du produit arrêtée.
b. Suspension d’essai et surfaces témoins
Suspension d’essai (N)
Suspension d’essai N1 6,8.108
N2 1,0.109
5.107≦ N1 ≦2.109 ☒ oui ☐ non
Explications :
- N1 = nombre de colonies obtenues par dénombrement en gélose de la suspension d’essai (UFC/mL) - N2 = nombre de colonies obtenues par dénombrement sur membrane de la suspension d’essai (UFC/mL)
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Surfaces témoin (T)
Surface témoin T Log T
1,5.106 6,2
Validation Log T ≥ 5+1 LOG ☒ oui ☐ non
Explications :
- T = Moyenne du nombre de bactéries dans les 10 mL de milieu de récupération des trois surfaces témoins inoculées mais non exposées (C4, C5 et C6).
Surfaces témoin effet mécanique (TEM)
Surface témoin TEM Log TEM
2,1.106 6,3
Validation Log T ≥ 5+1 LOG ☒ oui ☐ non
Explications :
- TEM = Moyenne du nombre de bactéries dans les 10 mL de milieu de récupération des trois surfaces témoins inoculées, non soumises à l’effet de la vapeur mais soumises à l’effet mécanique de l’accessoire (poids et mouvement de l’accessoire).
Explications : - n1 = nombre de colonies obtenues par dénombrement en gélose de la solution de recueil des
surfaces exposées non inoculés (UFC/mL) mise en contact avec la suspension d’essai - N1 = nombre de colonies obtenues par dénombrement en gélose de la suspension d’essai
(UFC/mL) Dans les conditions de l’essai, les potentiels résidus de la vapeur n’ont pas d’effets résiduels
sur la gélose. La vapeur n’induit pas d’effet inhibiteur sur la moisissure Aspergillus
brasiliensis dans les conditions de l’essai une fois l’activité du produit arrêtée.
b. Suspension d’essai et surfaces témoins
Suspension d’essai (N)
Suspension d’essai N1 5,9.106
N2 5,1.106
5.106≦ N1 ≦1.107 ☒ oui ☐ non
Explications :
- N1 = nombre de colonies obtenues par dénombrement en gélose de la suspension d’essai (UFC/mL) - N2 = nombre de colonies obtenues par dénombrement sur membrane de la suspension d’essai (UFC/mL)
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Surfaces témoin (T)
Surface témoin T Log T
1,1.105 5,0
Validation Log T ≥ 4+1 LOG ☒ oui ☐ non
Explications :
- T = Moyenne du nombre de moisissures dans les 10 mL de milieu de récupération des trois surfaces témoins inoculées mais non exposées (C4, C5 et C6).
Surface témoin effet mécanique (TEM)
Surface témoin TEM Log TEM
1,1.105 5,0
Validation Log T ≥ 4+1 LOG ☒ oui ☐ non
Explications :
- TEM = Moyenne du nombre de moisissures dans les 10 mL de milieu de récupération des trois surfaces témoins inoculées, non soumises à l’effet de la vapeur mais soumises à l’effet mécanique de l’accessoire (poids et mouvement de l’accessoire).
Explications : - n1 = nombre de colonies obtenues par dénombrement en gélose de la solution de recueil des
surfaces exposées non inoculés (UFC/mL) mise en contact avec la suspension d’essai - N1 = nombre de colonies obtenues par dénombrement en gélose de la suspension d’essai
(UFC/mL) Dans les conditions de l’essai, les potentiels résidus de la vapeur n’ont pas d’effets résiduels sur la
gélose. La vapeur n’induit pas d’effet inhibiteur sur la levure Candida albicans dans les conditions de
l’essai une fois l’activité du produit arrêtée.
b. Suspension d’essai et surfaces témoins
Suspension d’essai (N)
Suspension d’essai N1 4,5.107
N2 5,0.107
2.107≦ N1 ≦1.108 ☒ oui ☐ non
Explications :
- N1 = nombre de colonies obtenues par dénombrement en gélose de la suspension d’essai (UFC/mL) - N2 = nombre de colonies obtenues par dénombrement sur membrane de la suspension d’essai (UFC/mL)
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Surface témoin (T)
Surface témoin T Log T
3,7.105 5,6
Validation Log T ≥ 4+1 LOG ☒ oui ☐ non
Explications :
- T = Moyenne du nombre de levures dans les 10 mL de milieu de récupération des trois surfaces témoins inoculées mais non exposées (C4, C5 et C6).
Surfaces témoin effet mécanique (TEM)
Surface témoin TEM Log TEM
1,0.105 5,0
Validation Log T ≥ 4+1 LOG ☒ oui ☐ non
Explications :
- TEM = Moyenne du nombre de levures dans les 10 mL de milieu de récupération des trois surfaces témoins inoculées, non soumises à l’effet de la vapeur mais soumises à l’effet mécanique de l’accessoire (poids et mouvement de l’accessoire).
Explications : - n1 = nombre de colonies obtenues par dénombrement sur gélose de la solution de recueil des
surfaces exposées non inoculés (UFC/mL) mise en contact avec la suspension d’essai - N1 = nombre de colonies obtenues par dénombrement sur gélose de la suspension d’essai
(UFC/mL) Dans les conditions de l’essai, les potentiels résidus de la vapeur n’ont pas d’effets résiduels
sur la gélose. La vapeur n’induit pas d’effet inhibiteur sur la mycobactérie Mycobacterium
terrae dans les conditions de l’essai une fois l’activité du produit arrêtée.
b. Suspension d’essai et surfaces témoins
Suspension d’essai (N)
Suspension d’essai N1 6,5.107
N2 5,6.107
1.107≦ N1 ≦1.108 ☒ oui ☐ non
Explications :
- N1 = nombre de colonies obtenues par dénombrement sur gélose de la suspension d’essai (UFC/mL) - N2 = nombre de colonies obtenues par dénombrement sur membrane de la suspension d’essai (UFC/mL)
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Surface témoin (T)
Surface témoin T Log T
6,0.107 6,8
Validation Log T ≥ 4+1 LOG ☒ oui ☐ non
Explications :
- T = Moyenne du nombre de mycobactéries dans les 10 mL de milieu de récupération des trois surfaces témoins inoculées mais non exposées (C4, C5 et C6).
Surface témoin effet mécanique (TEM)
Surface témoin TEM Log TEM
6,8.107 6,8
Validation Log T ≥ 4+1 LOG ☒ oui ☐ non
Explications :
- TEM = Moyenne du nombre de mycobactéries dans les 10 mL de milieu de récupération des trois surfaces témoins inoculées, non soumises à l’effet de la vapeur mais soumises à l’effet mécanique de l’accessoire (poids et mouvement de l’accessoire).
- n’1 = nombre de colonies dans 10 mL de liquide de récupération des trois surfaces inoculées et exposées
- d = réduction logarithmique pour chaque support d’essai : log TEM - log n’1
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Essais n’
Validation Surface C1-C3 et C7-C15
< 10 UFC
Essai C1 < 10 UFC ☒ oui ☐ non
Essai C2 < 10 UFC ☒ oui ☐ non
Essai C3 < 10 UFC ☒ oui ☐ non
Essai C7 < 10 UFC ☒ oui ☐ non
Essai C8 < 10 UFC ☒ oui ☐ non
Essai C9 < 10 UFC ☒ oui ☐ non
Essai C10 < 10 UFC ☒ oui ☐ non
Essai C11 < 10 UFC ☒ oui ☐ non
Essai C12 < 10 UFC ☒ oui ☐ non
Essai C13 < 10 UFC ☒ oui ☐ non
Essai C14 < 10 UFC ☒ oui ☐ non
Essai C15 < 10 UFC ☒ oui ☐ non
Explications :
- n’ = nombre de colonies écouvillonnées directement sur les surfaces C1 à C3 et C7 à C15 non inoculées mais exposées.
Le couple générateur accessoire Box vapeurévalué selon le protocole du projet de norme NF
T72-110 présente une activité bactéricide sur la mycobactérie Mycobacterium terrae
supérieure à 4 LOG (4,1 LOG) en condition de saleté du domaine médical (3g/L BSA +
3mL/L d’érythrocytes de moutons défibrinés).
Le dispositif de désinfection à la vapeur est conforme aux exigences du projet de norme NF
T72-110 pour l’activité bactéricide sur Mycobacterium terrae dans les conditions de l’essai.
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V.IV Activité virucide du dispositif de désinfection par la vapeur
A. Norovirus murin de type 1
a. Essais préliminaires
Explications :
- S-C4 = solution de récupération de la surface C4 témoin non inoculée avec du virus mais exposée - S-C5 = solution de récupération de la surface C5 témoin non inoculée avec du virus mais exposée - S-C6 = solution de récupération de la surface C6 témoin non inoculée avec du virus mais exposée - Milieu infection (MI) = solution de récupération d’un support témoin non inoculé avec du virus et
non exposé au DDV
Dans les conditions de l’essai, la vapeur ne provoque pas d’effets cytopathogènes (ECP) sur
les cellules RAW 264.7.
Dans les conditions de l’essai, la vapeur n’affecte pas la sensibilité des cellules RAW 264.7 à
l’infection par le virus MNV-1.
La récupération des supports d’essai avec 10 mL de milieu froid sans SVF permet d’arrêter
efficacement l’action du produit biocide sur le virus MNV-1.
b. Essai et surfaces témoins
Témoins Solution d’essai Niveau de cytotoxicité
LOG DICT50/mL Validation
Arrêt de l’activité de produit
S-C4 < 0,5 8,5 Différence avec MI < 0,5 LOG ☒ oui ☐ non
S-C5 < 0,5 8,5 S-C6 < 0,5 8,5
Milieu infection < 0,5 8,5
Sensibilité des cellules
S-C4 < 0,5 8,7 Différence avec MI < 1 LOG ☒ oui ☐ non
S-C5 < 0,5 9,0 S-C5 < 0,5 8,5
Milieu infection < 0,5 9,3
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Surfaces témoins
Essai Cytotoxicité LOG DICT50 Validation
Surface témoin C4 n.a
6,7 n.a Surface témoin C5 6,5
Surface témoin C6 6,1 Surface TEMC4
n.a 6,5
TEM ≥ 4 LOG ☒ oui ☐ non Surface TEMC5 6,5
Surface TEMC6 6,1
Explications :
- Support témoin : surface inoculée non exposée au DDV Support TEM support témoin non exposé à la vapeur mais soumises à l’effet mécanique de l’accessoire (poids et mouvement de l’accessoire). - n.a : non applicable Dans les conditions de l’essai, l’accessoire associé au générateur Box vapeursans la vapeur
n’a pas d’effet mécanique sur le norovirus murin (MNV-1).
- Surface essai : surface inoculée et exposée au DDV - Réduction log = LOG DICT50 surface TEM – LOG surface essai - n.a : non applicable
Le couple générateur accessoire Box vapeurévalué selon le protocole du projet de norme NF
T72-110 présente une activité virucide sur le virus MNV-1 supérieure à 4 LOG (6,4 LOG)
en condition de saleté du domaine médical (3g/L BSA + 3mL/L d’érythrocytes de moutons
défibrinés).
Le dispositif de désinfection à la vapeur est conforme aux exigences du projet de norme NF
T72-110 pour l’activité virucide sur le norovirus murin (MNV-1) dans les conditions de
l’essai.
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B. Adénovirus de type-5
a. Essais préliminaires
Explications :
- S-C4 = solution de récupération de la surface C4 témoin non inoculée avec du virus mais exposée - S-C5 = solution de récupération de la surface C5 témoin non inoculée avec du virus mais exposée - S-C6 = solution de récupération de la surface C6 témoin non inoculée avec du virus mais exposée - Milieu infection (MI) = solution de récupération d’un support témoin non inoculé avec du virus et
non exposé au DDV
Dans les conditions de l’essai, la vapeur ne provoque pas d’effets cytopathogènes (ECP) sur
les cellules A549.
Dans les conditions de l’essai, la vapeur n’affecte pas la sensibilité des cellules A549 à
l’infection par l’adénovirus humain de type 5.
La récupération des supports d’essai avec 10 mL de milieu froid sans SVF permet d’arrêter
efficacement l’action du produit biocide sur l’adénovirus humain de type 5.
b. Essai et surfaces témoins
Témoins Solution d’essai Niveau de cytotoxicité
LOG DICT50/mL Validation
Arrêt de l’activité de produit
S-C4 < 0,5 8,5 Différence avec MI < 0,5 LOG ☒ oui ☐ non
S-C5 < 0,5 8,3 S-C6 < 0,5 8,3
Milieu infection < 0,5 8,5
Sensibilité des cellules
S-C4 < 0,5 8,3 Différence avec MI < 1 LOG ☒ oui ☐ non
S-C5 < 0,5 8,5 S-C5 < 0,5 8,5
Milieu infection < 0,5 8,5
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Surfaces témoins :
Essai Cytotoxicité LOG DICT50 Validation
Surface témoin C4 n.a
5,7 n.a Surface témoin C5 5,2
Surface témoin C6 5,5 Surface TEMC4
n.a 5,9
TEM ≥ 4 LOG ☒ oui ☐ non Surface TEMC5 5,3
Surface TEMC6 5,5
Explications :
- Support témoin : surface inoculée non exposée au DDV Support TEM support témoin non exposé à la vapeur mais soumises à l’effet mécanique de l’accessoire (poids et mouvement de l’accessoire). - n.a : non applicable Dans les conditions de l’essai, l’accessoire associé au générateur Box vapeursans la vapeur
n’a pas d’effet mécanique sur l’adénovirus de type 5.
- Surface essai : surface inoculée et exposée au DDV - Réduction log = LOG DICT50 surface TEM – LOG surface essai - n.a : non applicable Le couple générateur accessoire Box vapeurévalué selon le protocole du projet de norme NF
T72-110 présente une activité virucide sur l’adénovirus humain de type 5 supérieure à 4
LOG (5,6 LOG) en condition de saleté du domaine médical (3g/L BSA + 3mL/L
d’érythrocytes de moutons défibrinés).
Le dispositif de désinfection à la vapeur est conforme aux exigences du projet de norme NF
T72-110 pour l’activité virucide sur l’adénovirus humain de type 5 dans les conditions de
l’essai.
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VI. ANNEXES
VI.I Matériels et réactifs
A. Activités bactéricides a. Suspensions d’essai
Les suspensions d’essai ont été préparées à partir de solutions fraîches de bactéries :
- Staphylococcus aureus (référence : ATCC_ 6538, lot n° 052-001-W03)
o Suspension initiale : concentration comprise entre 5.107 et 2.109 UFC/mL dans du PBS
(Tampon phosphate, Lonza, lot n°6MB231, 12/2018)
- Escherichia coli (référence : ATCC_10536, lot n° 052-006-W01)
o Suspension initiale : concentration comprise entre 5.107 et 2.109 UFC/mL dans du PBS
(Tampon phosphate, Lonza, lot n°6MB231, 12/2018)
b. Méthode de quantification
Dénombrement en profondeur :
- Déposer 1 mL d’échantillon
- Répartir 12 à 15 mL du milieu gélosé liquide (gélose TSA, Conda, lot n°610181, 10/2020),
préalablement stérilisé par autoclave dans les boîtes de pétri
- Placer les boîtes inoculées lors de l’essai à l’étuve à 37°C durant 24 à 48 heures.
B. Activités fongicide et levuricide a. Suspensions d’essai
Les suspensions d’essai ont été préparées à partir de solutions fraîches de moisissures :
- Aspergillus brasiliensis (référence : ATCC_16404, lot n° 017-001-M03)
o Suspension initiale : concentration comprise entre 5.106 et 1.107 UFC/mL dans du PBS
(Tampon phosphate, Lonza, lot n°6MB231, 12/2018)
- Candida albicans (référence : ATCC_10231, lot n° 017-001-M04)
o Suspension initiale : concentration comprise entre 2.107 et 1.108 UFC/mL dans du PBS
(Tampon phosphate, Lonza, lot n°6MB231, 12/2018)
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REPRODUCTION ET DIFFUSION INTERDITES SANS AUTORISATION.
b. Méthode de quantification
Dénombrement en profondeur
- Déposer 1 mL d’échantillon
- Répartir 12 à 15 mL du milieu gélosé liquide (gélose extrait de malt, Oxoid, lot n°1998265,
02/2022), préalablement stérilisé par autoclave dans les boîtes de pétri
- Placer les boîtes inoculées lors de l’essai à l’étuve à 25°C durant 48 à 72 heures.
C. Activités Mycobactéricide a. Suspensions d’essai
Les suspensions d’essai ont été préparées à partir de solutions fraîches de mycobactéries :
- Mycobacterium terrae (référence : ATCC_15755, lot n° 052-009-W01)
o Suspension initiale : concentration comprise entre 1.107 et 1.108 UFC/mL dans du PBS
(Tampon phosphate, Lonza, lot n°6MB231, 12/2018)
b. Méthode de quantification
Dénombrement sur surface
- Déposer 500 µL d’échantillon sur une boîte de gélose Middlebrook 7H10 déjà coulée (BD, lot
n° 7186263, 25/04/2018), étaler le dépôt à l’aide de billes stériles.
- Placer les boîtes inoculées lors de l’essai à l’étuve à 37°C durant 8 jours.
D. Activité virucide
a. Suspensions d’essai
Lignées cellulaires
Nom: Cellules RAW 264.7 (macrophage) ATCC®-TIB-71™ (lot n°323142)
Nombre de passages : 6
Milieu de culture : DMEM 1,0 g/L (Lonza, lot n°000515663, 11/2018) complémenté avec 10% de
SVF (Dutscher, lot n° S11971S1810), 1% d’antibiotiques (Lonza, lot n° 6MB152, 09/2018) et 1% de
L-glutamine (Lonza, lot n° 6MB149, 08/2018)
RAPPORT D’ESSAI R-DDVCON00_A page 30 / 31
REPRODUCTION ET DIFFUSION INTERDITES SANS AUTORISATION.
Nom : A549 (carcinome de poumons), ATCC®- CCL-185TM (lot n°58314291)
Nombre de passages : 4 et 8
Milieu de culture : DMEM 1,0 g/L (Lonza, lot n°000515663, 11/2018) complémenté avec 10% de
SVF (Dutscher, lot n° S11971S1810), 1% d’antibiotiques (Lonza, lot n° 6MB152, 09/2018) et 1% de
L-glutamine (Lonza, lot n° 6MB149, 08/2018)
Souches virales Nom : norovirus murin de type 1 (MNV-1)
Numéro de lot : 1611N_005
Méthode de quantification :
- Réalisation des dilutions dans du milieu d’infection DMEM 1,0 g/L (Lonza, lot n°000515663,
11/2018) complémenté avec 10% de SVF (Dutscher, lot n° S11971S1810), 1% d’antibiotiques
(Lonza, lot n° 6MB152, 09/2018) et 1% de L-glutamine (Lonza, lot n° 6MB149, 08/2018)
- Dépôt de 100µL de chaque dilution dans 8 puits des microplaques de culture cellulaire (RAW
264.7)
- Incubation 3-5 jours à 37°C, 5% de C02
Nom : Adénovirus type-5 (Ad5)
Numéro de lot : 1610Ad_002
Méthode de quantification :
- Réalisation de dilutions dans du milieu d’infection DMEM 1,0 g/L (Lonza, lot n°000515663,
11/2018) complémenté avec 2% de SVF (Dutscher, lot n° S11971S1810), 1% d’antibiotiques
(Lonza, lot n° 6MB152, 09/2018) et 1% de L-glutamine (Lonza, lot n° 6MB149, 08/2018)
- Dépôt de 100µL de chaque dilution dans 8 puits des microplaques de culture cellulaire (A549)
- Incubation 7 jours à 37°C, 5% de C02
E. Préparation des réactifs a. Supports d’essai
Préparation du support de PVC (revêtement en polyuréthane) (20x50 cm de diamètre), surface plane,
non poreuse, épaisseur de 2,5 mm :
- Rincer à l’éthanol à 70% et sécher sous PSM
RAPPORT D’ESSAI R-DDVCON00_A page 31 / 31
REPRODUCTION ET DIFFUSION INTERDITES SANS AUTORISATION.
b. Substances interférentes
- Condition de saleté dans le domaine médical :
o Dissoudre 3 g de BSA dans 100 mL d’eau stérile (Aguettant, lot n°3011178),
stérilisation par filtration sur membrane 0,2 µM.
o Centrifuger les érythrocytes de mouton défibriné frais (SR0051B ; OXOID) à 800g
pendant 10min. Eliminer le surnageant, suspendre les érythrocytes dans une solution
saline (PBS). Répéter ce mode opératoire au moins trois fois (jusqu’à ce que le
surnageant soit incolore).
o Mettre en suspension 3 ml d'érythrocytes concentrés dans 97 ml de solution
d'albumine bovine 3 % (m/v).
c. Réactifs pour le dénombrement en profondeur Utilisation de la gélose TSA pour les bactéries :
o Tryptic Soy Agar (Conda, lot n°610181, 10/2020) à 40g/L
o Stériliser par autoclavage 121°C pendant 15 minutes
Utilisation de gélose à l’extrait de malt pour les moisissures :
o Extrait de malt (Oxoid, lot n°1998265, 02/2022) à 50g/L
o Stériliser par autoclavage 121°C pendant 15 minutes
Utilisation du TSB comme diluant pour les bactéries, les moisissures et les mycobactéries:
o Tryptic Soy Both (Conda, lot n°610181, 10/2020) à 30g/L
o Stériliser par autoclavage 121°C pendant 15 minutes
d. Réactifs pour le dénombrement en surface pour les mycobactéries Utilisation de boîtes de gélose 7HT10 déjà coulées :
- Milieu Middlebrook et Cohn 7H10+10% complexe dextrose albumine, acide oléique (BD, lot
n° 7186263, 18/10/2017)
e. Milieu de récupération pour les bactéries, les moisissures et les mycobactéries
Préparation du liquide de récupération dans une solution de TSB et stérilisation par autoclavage après
ajout :
o TSB (Tryptic Soy Broth, Conda, lot n°610181, 10/2020) à 30g/L
o Polysorbate 80 (Sigma Aldrich, lot n° BCBP2881V) à 5g/L