1 Rapport annuel d'activité, année 2015 Laboratoire National de Référence Listeria monocytogenes Nom du responsable du LNR Barre Léna Nom de l'unité où l'activité du LNR est mise en œuvre, le cas échéant précisez les noms des unités associées au LNR USEL Nom du laboratoire où l'activité du LNR est mise en œuvre, le cas échéant précisez les noms des laboratoires associés au LNR LSAl Nombre de laboratoires agréés et/ou reconnus dans le réseau 85 Précisez la catégorisation du danger (en SA) sinon la justification de l'existence du LNR (SA, SV et SSA) Existence d'un LRUE pour Listeria monocytogenes
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Rapport annuel d'activité, année 2015
Laboratoire National de Référence
Listeria monocytogenes
Nom du responsable du LNR
Barre Léna
Nom de l'unité où l'activité du LNR est mise en œuvre, le cas échéant précisez les
noms des unités associées au LNR
USEL
Nom du laboratoire où l'activité du LNR est mise en œuvre, le cas échéant précisez les
noms des laboratoires associés au LNR
LSAl
Nombre de laboratoires agréés et/ou reconnus dans le réseau
85
Précisez la catégorisation du danger (en SA) sinon la justification de l'existence du
LNR (SA, SV et SSA)
Existence d'un LRUE pour Listeria monocytogenes
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Les faits marquants de l'année
- Marché public pour la sélection d'un prestataire de service en vue de la préparation des
EILA du LNR Lm
- Sollicitation du LNR sur l’évolution de la validation des méthodes certifiées AFNOR suite à
des remontées terrain sur tests de détection/confirmation.
- Actions menée au sein de l’action 3 de l’UMT ARMADA
- Projet France Agrimer filière viande blanche pour le projet « Typage et persistance de
Listeria monocytogenes dans la filière porc.
1. Méthodes développées ou révisées
Nombre de méthodes développées ou révisées proposées à l’autorité compétente
0
Nombre de méthodes développées ou révisées qui sont susceptibles d’être prêtes
pour être proposées à l’autorité compétente au cours de l’année 2016
0
2. Matériels biologiques ou chimiques, échantillons et souches
d'intérêt
Information disponible auprès du LNR
3. Activités d'analyse
3.1. Analyses officielles de première intention
Nombre d'analyses officielles de première intention réalisées dans l'année (de
Le LNR reçoit des souches en provenance de laboratoires d’analyses vétérinaires et agro-
alimentaires publics ou privés. L’envoi de ces souches se fait sur la base du volontariat,
excepté pour les souches « alerte-produit DGAl», qui doivent obligatoirement être
adressées au CNR des Listeria (Institut Pasteur) qui les retransmet ensuite au LNR.
Ainsi, compte-tenu du système mis en place, il n’est pas possible de réaliser un bilan de
surveillance des isolats de façon fiable et exhaustive.
Le LNR ainsi que la mission "Alertes et Vigilances" de l’Anses/DER, participent à la Cellule
Listeria, chargée de la coordination de la surveillance nationale des cas humains de
listériose. En particulier, le LNR peut être interrogé par l’InVS et/ou le CNR sur les données
dont il dispose en situation d’investigation de cas groupés de listériose, lorsque le véhicule
alimentaire n’est pas identifié. Le LNR reçoit régulièrement en provenance du CNR toutes
les informations concernant les cas groupés de listériose et leur profil PFGE associé. Le
LNR effectue une comparaison régulière des profils PFGE des souches « alerte produit
DGAl » avec ceux des cas groupés humains investigués sur la même période.
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La base de données du LNR peut être interrogée en situation d’investigation de cas groupés
de listériose, lorsque les données du CNR sont insuffisantes. Le CNR doit nous
retransmettre régulièrement le profil PFGE des cas groupés si celui-ci est nouveau et
différent de ceux déjà observés. Dans ce cas, le LNR lance une recherche dans sa base
pour identifier d’éventuelles souches présentant le même profil. En 2015, nous avons été
sollicités dans le cadre de 17 signalements différents.
Dans le cadre de l’UMT Armada, la base de données du LNR a été modifiée afin de pouvoir
être ouverte aux centres techniques français impliqués dans la surveillance de souches de
Lm isolées de filières alimentaires spécifiques. Une plateforme informatique a été mise en
place et est opérationnelle depuis fin mai 2013 (http://moleculartyping-db.anses.fr). Pour
anticiper l’ouverture de la future base de données de surveillance moléculaire Européenne
de l’EFSA, la base de données du LNR. En 2015, a été connectée au pilote de la base de
données EFSA. Un premier test de soumission de 45 profils moléculaire a été réalisé, ainsi
que le développement d’un script de conversion des données françaises dans le langage de
la base de données EFSA Foodex 2. Ce travail permettra de potentiellement soumettre sur
les bases de données de surveillance Européenne (Base de données EFSA), toutes les
données moléculaires collectées par le LNR. L’EFSA a envoyé dans le cadre du lancement
de sa base de données une demande officielle aux autorités françaises pour permettre la
soumission des données de surveillance nationales. Une réunion de présentation du
système de base de données EFSA et du système mis en place par le LNR à été faite à la
DGAl, la DGS et la DGCCRF le 17 Septembre 2015.
Trois réunions téléphoniques individuelles ont été effectuées avec l’ADRIA développement
de Quimper, pour former ce centre technique à l’utilisation de la base de données de typage
du LNR ainsi que la réalisation d’une feuille de route pour l’intégration de cet outil dans leur
processus d’analyse PFGE. Tous les centres techniques de l’UMT ont été contactés par un
mail circulaire, pour participer aux sessions de formation. En 2015 trois centres techniques
étaient formés, l’IFIP, ACTALIA la Roche sur Foron et ADRIA développement.
Depuis 2012 et encore en 2015, des données issues de la base de données du LNR ont
alimenté la base de données européenne du LRUE Lm. En 2015 cette base de données a
été utilisée pour la préparation des LNR Européen y compris le LNR Français. La base de
données du LRUE Lm cessera de fonctionner lors de l’entrée en production de la base de
données lancée depuis 2015 par l’EFSA. Le système de base de données développé par le
LRUE Lm est décrit dans l’article : Pulse Field Gel Electrophoresis Methods and Protocols,
K.J.M. Dalmasso, ed. (Springer Protocols, Humana Pres), pp. 9-28).
Le LNR a été sollicitée à plusieurs reprises au cours de l’année 2015 pour rechercher des
profils moléculaires similaires à ceux de souches humaines qui ont fait l’objet d’alertes ou
d’investigations, en France (cf ci-dessus), en Europe et au niveau international.
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7.2.2 Gestionnaire du dispositif
Indiquer qui est le gestionnaire de ce dispositif de surveillance
Décrit précédemment
7.2.3 unités intégrées dans le dispositif
Préciser si d'autres unités/entités de l'agence sont intégrées dans ce dispositif à vos
cotés
Oui
Lesquelles ?
La mission "Alertes et Vigilances" de l’Anses/LRUELm
7.2.4 Les partenaires et acteurs de ce dispositif de surveillance
Sont acteurs ou partenaires de ce dispositif (plusieurs réponses possibles) :
INVS, CNRS, EFSA, DGAl
7.2.5 Modalités de surveillance
Préciser si ce dispositif repose (plusieurs réponses possibles) :
Sur des modalités de surveillance événementielles (notification de cas par des acteurs de
terrain)
Sur des modalités de surveillance programmées (active)
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8. Activités de recherche en lien avec l’activité de référence
8.1. Recherches méthodologiques pour la référence
Détaillez ici les recherches méthodologiques que vous avez réalisées dans l'année :
objectifs, partenariats, apports du LNR, projets retenus dans le cadre d'appels à
projets...
Les différents projets de recherche cités ci-dessous ont pour but de développer des
approches moléculaires innovantes afin d’évaluer la diversité génétique des souches
alimentaires de Listeria monocytogenes.
Partenariat nationaux
Partenariat LNR /Ifip
Dans la continuité du travail réalisé en 2014, un projet intitulé « Typage et persistance de
Listeria monocytogenes dans la filière porc » (juillet 2015-Décembre 2016) a été soumis et a
remporté l’appel d’offre de France –Agrimer en Septembre 2015. L’objectif de ce projet est
de mieux connaître les propriétés des souches persistantes dans les ateliers de
transformation de viande de porc. Pour cela, nous proposons de (1) caractériser la diversité
génétique des souches, isolées de la filière porc, ces vingt dernières années par PFGE et
MLST et (2) d’identifier des marqueurs génétiques associés aux souches persistantes dans
les ateliers. La base de données développée dans le cadre de l’UMT Armada sera utilisée
ici. L’ensemble des résultats obtenus permettra aux professionnels de mieux appréhender le
risque sanitaire lié à L. monocytogenes dans la filière porc, en offrant de nouvelles
perspectives pour le suivi et l’élimination des souches persistantes. A terme, ce travail
permettra le développement de tests moléculaires rapides ciblant ces marqueurs d’intérêt.
Ce projet regroupe l’IFIP partenaire principal du projet et neuf laboratoires collaborateurs
dont deux laboratoires français l’ISAE et Aérial. Le projet prévoit l’analyse du génome de
souches issues de 11 lignées de souches persistantes dans un environnement industriel de
transformation de la viande de porc. L’analyse de ces souches persistantes se fera au
regard de la diversité génétique de plus de 500 souches issues d’aliments à base de viande
de porc collectées par le LNR.
Partenariat LNR/ laboratoires Européens
-Projet de recherche Doctorat européen
Un projet de thèse intitulé « Genomics and Phenomics of Listeria monocytogenes strains of
food origin “est porté par le LNR, depuis Décembre 2013. Pour cela, le LNR a developpé un
partenariat avec deux chercheurs de l’Université Technique du Danemark (DTU)°(Dr
F.Aarestrup, Dr R. Hendriksen). Ces chercheurs font partie du « National Food institute » et
en particulier de la «Division of Bacterial Genomics and Epidemiology ». La thèse, conduite
sous label Européen, est financée par l’Anses. Dans ce cadre presque deux cent souches
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du LNR appartenant à des complexes clonaux d’intérêt ont été entièrement séquencées.
Les analyses sont en cours, menées en étroite collaboration entre notre laboratoire, le DTU.
Les analyses sur la structure des populations de souches alimentaires de Listeria
monocytogenes, ont mené à la rédaction d’un article qui sera soumis très prochainement
dans Applied and Environnemental Microbiology. Ce travail est prolongé par le séquençage
du génome de 204 souches qui permettront d’approfondir au niveau génétiques les
variations observé au sein des populations de souches alimentaires. Les objectifs principaux
de ce travail sont : la détection de marqueurs génétiques expliquant la différence de
répartition des groupes génétiques des souches isolées d’aliments et de cas cliniques.
- Projets de recherche inscrits dans le programme de travail LRUE
Dans un proche avenir, l'utilisation à large échelle de la technique du séquençage du
génome entier (Whole genome sequencing, WGS) est certainement amenée à supplanter la
PFGE. Cette technique a été utilisée avec succès comme outil d’analyse épidémiologique
de souches de L. monocytogenes (Orsi et al., 2008 ; Gilmour et al., 2010).
Le LRUE a débuté en 2015 un travail de validation des méthodes de séquençage
disponibles à ce jour en comparaison avec la méthode de référence, la PFGE. Ce projet
nécessite de regrouper une diversité importantes de souches reliées épidemiologiquement.
Le LNR a pris part à cette étude ainsi que d’autres laboratoires nationaux et Européens.
-Projet EFSA OC/EFSA/BIOCONTAM/2014/01
De plus, le LNR participe actuellement à un projet Européen de comparaison des données
de séquençage génomique, obtenues par WGS, de souches de L.monocytogenes
prélevées dans différents compartiments de la chaîne alimentaire ou isolées de cas
humains (OC/EFSA/BIOCONTAM/2014/01). Ce projet d’une durée de deux ans a
commencé en octobre 2014. Il s’inscrit dans la continuité d’une enquête européenne
précédemment menée pour estimer la prévalence et les niveaux de contamination dans
trois aliments prêts à consommer: poisson fumé ou mariné, produits de viande et fromages
à pâte molle ou semi-molle. Les données de WGS seront analysées à partir de mars 2015,
au Public Health England (PHE, UK), partenaire de ce projet. Le séquençage de 1156
souches de ce projet a été réalisé. Une base de données regroupant la description
épidémiologique des 818 souches alimentaires et 338 souches cliniques a été constituée.
Le projet est maintenant la phase d’analyse des données obtenues. Il mènera à la rédaction
d’un article dans une revue scientifique internationale à comité de lecture.
-Projet « COMPARE“-Horizon 2020”
De plus, le LNR participe au 8ème programme cadre recherche et développement pour la
période 2014-2020 (Horizon H2020 : « Improving the control of infectious epidemics and
foodborne outbreaks through rapid identification of pathogens ») par le biais du projet
COMPARE. Ce projet, d’une durée de 5 ans est coordonné par le DTU et implique 29
partenaires européens. Ce projet collaboratif COMPARE a pour objectif la mise en place
d’une infrastructure d’échanges d’informations au niveau européen pour la gestion des
épidémies humaines ou animales. Le LNR s’implique dans ce projet, en développant et
validant de nouvelles méthodes de caractérisation utilisables pour l’épidémiologie
moléculaire. Listeria a été retenu parmi les pathogènes transmissibles par les aliments qui
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doivent faire l’objet d’une étude pilote, avant d’élargir à l’ensemble des bactéries, virus et
parasites, représentant un risque dans la chaine alimentaire.
La première étape de ce projet porte sur l’évaluation de la diversité génétique connues de
chaque pathogènes et le récemment des génomes de référence disponibles.
-Influence des modalités de prise d’essai sur l’incertitude de mesure, et optimisation de la
prise d’essai pour assurer une meilleure représentativité de la contamination de l’échantillon
pour laboratoire
En particulier, l’hétérogénéité de la contamination des matrices alimentaires par Lm a été
étudiée sur différentes catégories d’aliments.
-Etude l’applicabilité de la norme EN ISO 11290 aux nouvelles espèces de listeria.
Récemment, de nouvelles espèces du genre Listeria ont été isolées à partir d'aliments et
d'autres niches environnementales. Les normes en cours de révision incluront à présent
dans leur domaine d’application Listeria spp. car elles peuvent être utilisées comme
indicateurs d’une contamination potentielle par L. monocytogenes.
Dans le cadre de la révision de la norme, il a été nécessaire de vérifier la capacité des
méthodes à récupérer et à détecter les espèces de Listeria nouvellement identifiées. En
particulier, certaines de leur caractéristiques restaient inconnues, telles que: leurs
caractéristiques de croissance et l’aspect des colonies sur géloses d'isolement sélectif, leurs
réactions aux tests biochimiques utilisés pour la confirmation, leur interférence possible
avec la détection de L. monocytogenes.
-Etude de l’impact du poolage sur la détection de Listeria monocytogenes, selon la norme
11290-1
-Evaluation de techniques d’inoculation de matrices solides
-Synthèse bibliographique sur les techniques de confirmation
- Suivi du devenir de Listeria monocytogenes soumise aux stress rencontrés dans les
ateliers agro-alimentaires réfrigérés et étude du transcriptome après application de ces
stress.
L’objectif général du projet est d’utiliser la déshumidification de l’air pour empêcher la
persistance de Listeria monocytogenes dans les ateliers agro-alimentaires réfrigérés tout en
réduisant l’impact environnemental des opérations d’hygiène. Pour cela, nous cherchons la
stratégie de déshydratation la plus destructrice et évaluons le retard de croissance des
cellules survivantes. Des efforts sont ensuite portés sur la compréhension des mécanismes
moléculaires impliqués dans la réponse de la bactérie au stress hydrique mais également
aux autres stress (chimique, salin, etc.) rencontrés dans les ateliers. Il est question
d’identifier des marqueurs de viabilité afin de développer un outil permettant de détecter,
dans les environnements industriels, les cellules non détectables par les méthodes
culturales actuelles (les cellules viables non cultivables ou VNC). Les travaux sur la
recherche des conditions de séchage optimale pour la destruction de L. monocytogenes ont
montré que les principaux facteurs qui affectent la survie est l’amplitude de séchage et la
cinétique de réhydratation. Dans le cas de L. monocytogenes, un séchage à 68% d’humidité
relative suivi d’une réhydratation cellulaire rapide est la condition la plus destructrice. De
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plus, nous avons montré que le séchage permet une optimisation de l’opération d’hygiène
lorsqu’il est couplé à une étape de nettoyage et désinfection, en réduisant plus fortement la
viabilité des cellules sur les surfaces.
8.2. Recherches associées
Détaillez ici les recherches associées auxquelles vous avez participé dans l'année:
participations à des études cliniques, études d'incidences, modèles d'infections
expérimentales, études toxicologiques, essais vaccinaux...
sans objet
9. Relations avec le CNR
Existence d'un CNR
Oui
Intitulé du CNR
CNR des Listeria
Organisme porteur du CNR
Institut Pasteur
Collaboration dans le cadre de la surveillance, détailler:
Cf ci-dessus
Collaboration dans le cadre de projets de recherche, détailler:
sans objet
Autres collaborations, le cas échéant détailler:
sans objet
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10. Autres mandats
Le LNR détient-il d'autres mandats de référence dans le même domaine de
compétences
Oui
Précisez :
LRUE Listeria monocytogenes
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Annexes
PUBLICATIONS SCIENTIFIQUES INTERNATIONALES
Barre L, Brasseur E, Doux C, Lombard B, Gnounou Besse N. Food Microbiology. 48:171-7
2015. Sensitive enumeration of Listeria monocytogenes and other Listeria species in various naturally
contaminated matrices using a membrane filtration method.
- Lardeux AL., Guillier L., Brasseur E., Doux C., Gautier J., Gnanou-Besse N. 2015. Impact of the contamination level and the background microflora on the growth of Listeria monocytogenes in ready-to-eat diced poultry. Letters in Applied Microbiology (article in press) doi:10.1111/lam.12395
- D. Michelon, A. Leclercq, G. Garric, L. Guillier, A. Beaufort and H. Bergis, 2015. Growth potential assessment of Listeria in milk fat products by challenge testing. Journal of food safety (in press), doi: 10.1111/jfs.12239
Felix B, Roussel S and Pot, B. 2015. Harmonization of PFGE profile analysis by using bioinformatics tools: example of the Listeria monocytogenes European Union Reference Laboratory. In Pulse Field Gel Electrophoresis Methods and Protocols, K.J.M. Dalmasso, ed. (Springer Protocols, Humana Press), pp. 9-28.
Michelon, D., Felix, B., Vingadassalon, N., Mariet, J.F., Larsson, J.T., Moller-Nielsen, E., and Roussel, S. (2015). PFGE Standard Operating Procedures for Listeria monocytogenes: Harmonizing the Typing of Food and Clinical Strains in Europe. Foodborne Pathog Dis.
COMMUNICATIONS NATIONALES
Firmesse, O., 2015. Améliorer l'hygiène dans les ateliers agro-alimentaires réfrigérés : déshumidifier l'air pour lutter contre la persistance microbienne. Revue Générale du Froid & du conditionnement d'air 1153, 19-22.
Firmesse, O., 2015. Ecosec optimise les paramètres de séchage. Process Alimentaire.
Firmesse, O., 2015. La déshumidification de l’air pour éliminer les bactéries dans les ateliers. Revue Laitière Française.
Roussel, S., 2015. Mémoire HDR – Diversité Génétique des souches alimentaires de Listeria monocytogenes. Université Paris XII Val de Marne.
COMMUNICATIONS INTERNATIONALES
Felix, B., Roussel, S., Pot, B. 2015. Harmonization of PFGE profile analysis by using bioinformatics tools: example of the Listeria monocytogenes European Union Reference Laboratory network, In: Methods in Molecular Biology. 9-28.
Félix B, M.D., Mariet JF, Dao TT, Roussel S, Feurer C 2015. A molecular Listeria monocytogenes database to centralize and share typing data from strains isolated from the pork sector in France. Paper presented at: Safe Pork (Porto, Portugal).
Henri C,, Plouchart D, Mariet JF, Dao TT, Lailler R, Feurer C, Roussel S 2015. Genetic diversity of Listeria monocytogenes strains isolated from pork products. Paper presented at: Safe Pork (Porto, Portugal).
Felix, B., Mariet, J.F., Maillet, A., Firmesse, O., Laurent, G., Radomski, N., Felten, A., Touzain, F., Feurer, C., Roussel, S. 2015. Genomic insight into the persistence of Listeria monocytogenes in processing environments of pork products. In Safe Pork, Vieiro-Pinto, M., ed. (Porto, Portugal).
Félix, B., Feurer, C. 2015. Listeria monocytogenes: une base de données nationale partagée pour la surveillance et l’amélioration des connaissances. In Colloque UMT ARMADA (Maisons-Alfort).
Michelon, D., Felix, B., Mariet, J.F., Lombard, B., Roussel, S. 2015. Update on activities of European Union Reference Laboratory for Listeria monocytogenes: a road-map toward European harmonization of typing food and clinical strains. In InFORM: Integrated Foodborne Outbreak Response and Management Conference, Laboratories, A.P.H., ed. (Phoenix, United States of America).
L. Barre, N. Gnanou Besse, E. Brasseur, A. Chamoin, B. Lombard Measurement uncertainty for Listeria monocytogenes enumeration: trials on influence of sub-sampling test portion., 11e congrès National de la Société Française de Microbiologie, Institut Pasteur Paris, 24-25 mars 2015. Communication affichée A reçu le prix poster SFM 2015
Gnanou Besse, N., Rollier, P., Guillier L, François, D., Romero, K., Pierru, S., Bouhier, L., Lombard, B. 2015. Validation of EN ISO 11290-1&2 Standard methods for detection and enumeration of L. monocytogenes. In IAFP European Symposium on Food Safety (Cardiff (RU)).
Gnanou Besse, N., Rollier, P., Guillier L, François, D., Romero, K., Pierru, S., Bouhier, L., Lombard, B. 2015. Validation of EN ISO 11290-1&2 Standard methods for detection and enumeration of L. monocytogenes. In 11e congrès National de la Société Française de Microbiologie (Paris)
Overney, A., Jacques‐André‐Coquin, J., Ng, P., Guillier, L., Carpentier, B., Firmesse, O. 2015. Etude de paramètres influençant la persistance de Listeria monocytogenes dans les ateliers agro‐alimentaires réfrigérés. In 7ème Colloque du Réseau National Biofilms (Toulouse).
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CONFÉRENCES SUR INVITATION
Felix, B., Michelon, D., Mariet, J.F., Lombard, B., Roussel, S. 2015. Update on activities of European
Union Reference Laboratory for listeria monocytogenes: a road-map toward European
harmonization of typing food and clinical strains. In Days of Veterinary Pendovski, P.L., ed.
(Struga, Macedonia).
Felix, B., Cadel Six, S., Cherchame, E., Michelon, D., Mariet, J.F., Dao, T.T., Lailler, R., Roussel, S.,
Feurer, C. 2015. Molecular Listeria monocytogenes & Salmonella databases to share typing
data from strains isolated from the pork sector in France. In Journée de restitution des
travaux de l’UMT ARMADA, IFIP, A.-. ed. (Maisons - Alfort, France).
Roussel, S., Henri, C., Felix, B., Michelon, D., Mariet, JF., Guillier, L., Felten, A., Touzain F.,
Radomski, N., Lombard, B., Mistou, MY., Lailler, R. 2015. Characterization of Listeria
monocytogenes strains by Whole Genome Sequencing. MEDVETNET Workshop :
Wednesday 7 October 2015.
Michelon, D., Felix, B., Roussel, S. 2015. EURL Lm PFGE Database Experience Collaboration with
EFSA. Working group on Microbiological Criteria Brussels, October 30th, 2015.
Firmesse, O. 2015. Persistance de Listeria monocytogenes dans les conditions de stress rencontrées sur les surfaces des ateliers agro-alimentaires réfrigérés. In: 11e congrès National de la Société Française de Microbiologie, Institut Pasteur Paris, 24-25 mars 2015.
Lailler, R., Feurer, C. 2015. Epidémio-surveillance de Listeria monocytogenes et Salmonella enterica:
intérêt, structuration et évolution. In Colloque UMT ARMADA (Maisons-Alfort, Fr). Roussel, S., Henri, C., Felix, B., Michelon, D., Mariet, JF., Guillier, L., Felten, A., Touzain F.,
Radomski, N., Lombard, B., Mistou, MY., Lailler, R. 2015. Characterization of Listeria
monocytogenes strains by Whole Genome Sequencing. MEDVETNET Workshop: