RAPORTARE STIINTIFICA Raport stiintific si tehnic -Rezumat- Principalele rezultate obtinute in aceasta faza a Proiectului sunt prezentate succint in continuare: Utilizarea microbiotei prezente în stațiile de epurare a apelor reziduale municipale ca material de pornire a condus la izolarea unor ansambluri de populații microbiene îmbunatățite, unele in activitatea de denitrificare iar altele in activitatea de oxidare a amoniului (Activitatea 1.1.1). In privinta activitatii denitrificatorii, performanta o constituie o rata de 66 mg de nitrat eliminat/ 24 de ore/ 50 mL de namol activ iar pentru microorganismele care oxideaza amoniul se remarca faptul ca microbiota imbogatita realizeaza o crestere in 24 de ore a concentratiei de nitrat (ca urmare a oxidarii amoniului) de 2804,9 μg/mL comparativ cu o crestere de doar 29,8 μg/mL in cazul variantei in care nitrificarea a fost inhibata. In mod corespunzator, scaderea concentratiei de amoniu este de 2000 μg/mL in proba fara inhibitor al nitrificarii. Utilizarea microbiotei prezente în biofiltrele de tratare a apelor reziduale din acvacultura ca material de pornire a condus la izolarea, printre altele, a 4 ansambluri microbiene capabile de oxidarea amoniului si a 8 ansambluri microbiene capabile sa reduca nitratul din apele uzate (Activitatea 1.2.1). Cea mai mare rata de denitrificare s-a obtinut pentru ansamblul A3, de 90 mg NO3/L/24 h iar proba FBB s-a dovedit o buna sursa de bacterii amoniu oxidante. Ansamblurile microbiene selectate vor fi utilizate pentru imbogatirea namolului activ in etapele urmatoare, prin realizarea de consortii microbiene special create pentru o anumita compozitie a apei reziduale. Rata maxima a denitrificarii obtinuta prin folsosirea unui inocul imbogatit timp de 9 saptamani a fost de 544 mg NO3/24 ore/L de namol activ. Selectarea a trei consortii de microorganisme fotosintetizante (cianobacterii și microalge) cu capacitatea ridicata de a prelua nitratul din apele reziduale sintetice, au fost configurate astfel incat separarea fizica intre biocatalizator si apa de epurat sa fie un proces facil. Ratele maxime de eliminare a NO3, prin reducere asimiliatorie, de catre aceste consortii au fost de 33,6 si 5,0 mg NO3/24 de ore. Sinteza de consorții de microorgansime prin realizarea la nivel de laborator a unei simbioze artificiale intre microorganisme fotosintetizante si microorganisme care oxideaza amoniul. Microorganismele fotosintetizante singure realizeaza o indepartare a azotului total de 0,016 mg AT/24 ore/g biomasa umeda iar aceleasi microorganisme fotosintetizante, in simbioza cu MOA realizeaza o indepartare a azotului total de 0,809 mg AT/24 ore/g biomasa umeda. Stabilirea unor parametrii fizico-chimici (temperatura, intensitatea luminii, inclusiv variante de pozitionare a sursei de lumina arficificiala, etc) necesari proiectarii statiei experimentale. Analiza celor 5 tipuri de SAM concepute si realizate de catre DFR Systems sub aspectul capacitatii de a sustine formarea biofilmelor microbiene. In cazul variantei nr. 4 a fost determinata si dinamica formarii biofilmului precum si activitatea metabolica de ansamblu, prin cuantificarea activitatii dehidrogenazice, cu un maxim de 386 pg resazurina redusa/min/5 exememplare SAM. Valorificarea de pana acum a rezultatelor obtinute, la patru luni de la semnarea Contractului, consta: a) intr-un rezumat trimis, acceptat si prezentat in 2017 (PRIOCHEM 2017, Editia a XIII-a, 25-27 octombrie 2017, Bucuresti),
13
Embed
RAPORTARE STIINTIFICA Raport stiintific si tehnic -Rezumat- · microorganisme a namolului activ de la o statie de epurare a apelor menajere orasenesti, care a fost cultivat selectiv
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
RAPORTARE STIINTIFICA
Raport stiintific si tehnic
-Rezumat-
Principalele rezultate obtinute in aceasta faza a Proiectului sunt prezentate succint in
continuare:
Utilizarea microbiotei prezente în stațiile de epurare a apelor reziduale municipale ca
material de pornire a condus la izolarea unor ansambluri de populații microbiene îmbunatățite,
unele in activitatea de denitrificare iar altele in activitatea de oxidare a amoniului (Activitatea
1.1.1). In privinta activitatii denitrificatorii, performanta o constituie o rata de 66 mg de nitrat
eliminat/ 24 de ore/ 50 mL de namol activ iar pentru microorganismele care oxideaza amoniul
se remarca faptul ca microbiota imbogatita realizeaza o crestere in 24 de ore a concentratiei
de nitrat (ca urmare a oxidarii amoniului) de 2804,9 µg/mL comparativ cu o crestere de doar
29,8 µg/mL in cazul variantei in care nitrificarea a fost inhibata. In mod corespunzator,
scaderea concentratiei de amoniu este de 2000 µg/mL in proba fara inhibitor al nitrificarii.
Utilizarea microbiotei prezente în biofiltrele de tratare a apelor reziduale din
acvacultura ca material de pornire a condus la izolarea, printre altele, a 4 ansambluri
microbiene capabile de oxidarea amoniului si a 8 ansambluri microbiene capabile sa reduca
nitratul din apele uzate (Activitatea 1.2.1). Cea mai mare rata de denitrificare s-a obtinut
pentru ansamblul A3, de 90 mg NO3/L/24 h iar proba FBB s-a dovedit o buna sursa de bacterii
amoniu oxidante. Ansamblurile microbiene selectate vor fi utilizate pentru imbogatirea
namolului activ in etapele urmatoare, prin realizarea de consortii microbiene special create
pentru o anumita compozitie a apei reziduale. Rata maxima a denitrificarii obtinuta prin
folsosirea unui inocul imbogatit timp de 9 saptamani a fost de 544 mg NO3/24 ore/L de namol
activ.
Selectarea a trei consortii de microorganisme fotosintetizante (cianobacterii și
microalge) cu capacitatea ridicata de a prelua nitratul din apele reziduale sintetice, au fost
configurate astfel incat separarea fizica intre biocatalizator si apa de epurat sa fie un proces
facil. Ratele maxime de eliminare a NO3, prin reducere asimiliatorie, de catre aceste consortii
au fost de 33,6 si 5,0 mg NO3/24 de ore.
Sinteza de consorții de microorgansime prin realizarea la nivel de laborator a unei
simbioze artificiale intre microorganisme fotosintetizante si microorganisme care oxideaza
amoniul. Microorganismele fotosintetizante singure realizeaza o indepartare a azotului total
de 0,016 mg AT/24 ore/g biomasa umeda iar aceleasi microorganisme fotosintetizante, in
simbioza cu MOA realizeaza o indepartare a azotului total de 0,809 mg AT/24 ore/g biomasa
umeda.
Stabilirea unor parametrii fizico-chimici (temperatura, intensitatea luminii, inclusiv
variante de pozitionare a sursei de lumina arficificiala, etc) necesari proiectarii statiei
experimentale.
Analiza celor 5 tipuri de SAM concepute si realizate de catre DFR Systems sub aspectul
capacitatii de a sustine formarea biofilmelor microbiene. In cazul variantei nr. 4 a fost
determinata si dinamica formarii biofilmului precum si activitatea metabolica de ansamblu,
prin cuantificarea activitatii dehidrogenazice, cu un maxim de 386 pg resazurina redusa/min/5
exememplare SAM.
Valorificarea de pana acum a rezultatelor obtinute, la patru luni de la semnarea
Contractului, consta:
a) intr-un rezumat trimis, acceptat si prezentat in 2017 (PRIOCHEM 2017, Editia a XIII-a,
25-27 octombrie 2017, Bucuresti),
b) doua rezumate trimise si acceptate pentru manifestari ce vor avea loc in 2018 (ECO-BIO
Challenges in Building a Sustainable Biobased Economy 2018 si 4th Annual International
Conference on Biology, 25-28 June 2018, Athens, Greece.
c) intr-un manuscris stiintific acceptat de catre o revista ISI din Romania, manuscris avand
ca autor principl pe dr. Corina Moga si coautori participanti si din celelalte doua institutii
(Aquaterra si Institutul de Biologie Bucuresti, Academia Romana) (a se vedea acceptul de
la Editori).
Descrierea stiintifica si tehnica, cu punerea in evidenta a rezultatelor etapei si
gradul de realizare a obiectivelor; (se vor indica rezultatele)
Activitatea 1.1.1. Utilizarea microbiotei prezente în stațiile de epurare a apelor reziduale
municipale ca material de pornire pentru izolarea unor ansambluri de populații
microbiene îmbunatățite cu scopul de a fi folosite în sistemele de acvacultură cu
recirculare (SAR)
A. Imbogatirea in microorganisme denitrificatoare
O prima strategie de imbogatire in denitrificatori a constat in folosirea ca sursa de
microorganisme a namolului activ de la o statie de epurare a apelor menajere orasenesti, care
a fost cultivat selectiv in apa de evacuare care a fost suplimentata cu sursa de carbon (etanol)
si azotat, in diverite cantitati.
Tabel nr. 1. Evolutia in timp a ratelor de denitrificare in conditiile unui raport C/N de 250-1
Raport
C/N Varianta Data
mg nitrat/50ml namol
activ/24 ore
mg nitrat/100ml namol
activ/24 ore
250-1 a 13.10.2017
37,23
250-1 b 33,04
250-1 a 20.10.2017
36,02
250-1 b 31,89
250-1 a 27.10.2017
35,95
250-1 b 36,13
In Tabelul nr. 2 sunt prezentate ratele de consumare ale nitratului obtinute in varianta in
care raportul dintre sursa de C si cea de nitrat este de 10/1 (varianta a) sau 5/1 (varianta b),
iar volumul de namol activ este constant in ambele variante (50 mL namol activ in 500 mL
volum de reactie).
Tabelul nr. 2. Evolutia in timp a ratelor de denitrificare in conditiile unui raport C/N de 10-
1, respectiv 5-1.
Raport
C/N Varianta Data mg nitrat/50ml namol activ/24 ore
10-1 a 13.11.2017
63,63
5-1 b 63,5
10-1 a 20.11.2017
51,38
5-1 b 50,82
B. Imbogatirea in microorganisme care oxideaza amoniul (MOA)
In Figura 1 sunt prezentate rezultatele consumului de oxigen molecular al unei probe
initiale de namol activ, neimbogatite in MOA, cuantificat cu BOD Direct (HACH) folosind trei
volume diferite de namol activ suspendat in apa reziduala sintetica ce contine amoniu ca sursa
de electroni specifica MOA. In plus, fiecare din cele trei variante este in duplicat, unul fiind
martorul iar in celalalt vas s-a adaugat inhibitor specific pentru nitrificare ATH (Allyl Thiourea,
HACH LANGE LZQ087). Folosirea acestui inhibitor metabolic specific permite cuantificarea
consumului de oxigen folosit pentru oxidarea amoniului (Sheela et al., 2014). Asa cum se
remarca in aceasta figura consumul de oxigen este mai mare pe masura ce volumul de proba
de analizat este mai mare (proba 1 -157mL; proba 2-244ml iar proba 3 360mL), in
conformitate cu literatura de specialitate. Ceea ce este interesant pentru subiectul nostru, asa
cum se remarca si din Figura 1, este absenta inhibitiei consumului de oxigen in prezenta
inhibitorului specific al oxidarii amoniului. Aceste rezultate sugereaza ca, in stadiul initial nu
exista activitate de oxidare a amoniului (cel putin detectabila prin aceasta metoda clasica).
Figura 1. Evolutia in timp a consumului de oxigen molecular utilizand microbiota
neimbogatita in MOA, in prezenta si in absenta inhibitorului de nitrificare ATH (HACH LANGE
LZQ087).
In Figura 2 sunt prezentate rezultatele unui experiment similar facut insa dupa ce
microbiota din experimentul anterior a fost cultivata selectiv in apa reziduala sintetica
pregatita pe baza datelor din literatura, a corectarii valorii de pH si a inspiratiei cercetatorilor.
Figura 2. Evolutia in timp a consumului de oxigen molecular utilizand microbiota imbogatita
in MOA, in prezenta si in absenta inhibitorului specific al nitrificarii, ATH (HACH LANGE
LZQ087).
Asa cum se remarca, exista o diferenta uriasa intre consumul de oxigen molecular al probei
martor (fara inhibitorul HACH LANGE LZQ087) si al aceleiasi probe in prezenta de inhibitor.
Aceasta diferenta demonstreaza clar existenta unei puternice activitati de oxidare
mirobiologica a amoniului, consecinta a imbogatirii microbiotei initiale in MOA.
Analizele chimice referitore la concentratia nitratului si amoniului sunt prezentate in
Tabelul nr.4.
Tabelul nr. 4. Modificarile concentratiilor de amoniu si azotat in acelasi experiment ca cel din
Figura 2, la inceputul si la finalul experimentului.
NH4 la T0 (g/L) 9,3 9,3
NH4 la Tf (g/L) 1,5 1,7
NO3 la T0 (µg/ml) 92,5 92,5
NO3 la Tf (µg/ml) 2897,4 122,3
Se remarca buna omogenizare chimica a probei care a fost impartita in mod egal intre
cele doua variante experimentale (concentratii identice la timpul zero pentru amoniu si nitrat)
diferenta uriasa aparand in ceea ce priveste concentratia finala de nitrat care este foarte mica
in proba cu inhibitor (122,3 µg/L) si semnifictiv mai mare (2897,4 µg/L) in proba in care a
avut loc oxidarea amoniului. Aceste rezultate argumenteaza imbogatirea semnificativa in MOA
a microbotei initiale. Acest amestec de populatii este conservat in Centrul nostru si este folosit
(a se vedea Activitatea 1.4.1) in continuare in simbioza indusa cu microorganisme
fotosintetizante selectionate separat (a se vedea Activitatea 1.3.1) pentru experimente la
nivel de laborator cu consortii imbogatite.
Activitatea 1.2.1. Utilizarea microbiotei prezente în biofiltrele de tratare a apelor reziduale
din acvacultura, ca material de pornire pentru izolarea unor ansambluri de populații
microbiene îmbunătățite cu scopul de a fi folosite în SAR
A) Obtinere de ansambluri microbiene imbogatite in microorganisme nitrificatoare,
microorganisme care oxideaza amoniul (MOA)
Dintre toate probele testate, 7 au prezentat crestere pozitiva insa numai 4 (Acvariu FBB,
Raja 1, Raja 2, si Frasin C) s-au putut mentine si cultiva in conditii de laborator.
La probele cu crestere pozitiva s-a testat si concentratia de NH4 prezenta in mediul de
cultura la inceputul (T0) si la momentul decolorarii mediului (Tf) (Tabelul nr. 5). S-a observat
o scadere semnificativa a concentratiei de amoniu din mediul de cultura, ceea ce confirma
prezenta bacteriilor nitrificatoare.
Tabelul nr. 5. Concentratiile de amoniu (NH4) pe parcursul cresterii bacteriilor nitrificatoare
(T0 – momentul initial; Tf – momentul final)
Concentratia NH4 (mg/L)
T0 Tf
FBB 333.9 191.6
Raja 1 130.2 43.7
Raja 2 108.5 14.2
Frasin C 165.7 16.9
B) Obtinere de ansambluri microbiene imbogatite in bacterii denitrificatoare
aerobe/microaerofile
Pentru selectarea microorganismelor denitrificatoare aerobe/microerofile, am folosit probe de
apa provenind din biofiltrele si bazinele cu apa uzata din sistemul RAS al partenerului de
consorțiu AQUATERRA (sat Plutonița, orașul Frasin, județul Suceava) (probele A1, A2, A3,
A4), din bazinele de crestere a pestilor de la Pastravaria Bratioara (sat Candesti, com. Albesti
de muscel, judetul Arges) (PBb, PBs), din biofiltrul si apa unui acvariu al Facultatii de Biologie
Bucuresti (FBB).
Confirmarea activitatii denitrificatoare a ansamblurilor microbiene selectate s-a efectuat
prin masurarea ratei de reducere a NO3 folosind folosind o metoda spectrofotometrica, cu
ajutorul kit-ului Spectroquant® Nitrate test kit (1.09713.0001-Merck). Toate concentratiile
NO3 au fost calculate pe baza unei curbe standard trasata cu ajutorul solutiei Nitrate IC-STD
(119811 -Merck).
Figura 9. Denitrificarea aeroba/microaerofila realizata de ansamblurile microbiene selectate,
provenind din diferite probe naturale. (a) Scaderea in timp a concentratiei de NO3- si (b) rata
de reducere a NO3 de catre ansamblurile microbiene imbogatite in microorganisme
denitrificatoare aerobe/microaerofile.
Toate probele testate au permis selectarea si imbogatirea in bacterii denitrificatoare,
insa s-au inregistrat diferente destul de mari in ceea ce priveste capacitatea lor
denitrificatoare. Astfel, probele provenite din biofiltrele si bazinele cu apa uzata din sistemul
RAS al partenerului de consorțiu AQUATERRA (A1-A4), au prezentat cea mai buna activitate
denitrificatoare comparativ cu ansamblurile microbiene izolate din probele de apa provenind
de la Pastravaria Bratioara (PBb si PBs).
In Tabelul nr. 6 sunt prezentate rezultatele sintetice obtinute in acest tip de experiment
de imbogatire. Ratele sunt de denitrificare sunt exprimate in mg azotat consumat/ 24ore/1L
namol activ.
Tabelul nr. 6. Evolutia pe parcursul a 9 saptamani, a capacitatii microbiotei imbogatite de a
realiza denitrificare
Saptamana 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Rata denitrificarii
mg NO3/24ore/1L
0 0 0 40 90 200 136 400 544
Asa cum se remarca in Tabelul nr. 6, in primele trei saptamani nu s-a putut calcula o rata
a denitrificarii deoarece dupa 24 de ore, concentratia acestuia era mai mare decat la inceputul
experimentului. Aceste prime rezultate atrag atentia asupra complexitatii interrealatiilor
dintre microorganismele ce compun namolul activ. Este foarte putin probabil ca acel amestec
(b) (a)
de biomasa rezultata din filtrele de acvacultura (Frasin) sa fie lipsit de denitrificatori, insa pur
si simplu in primele saptamani raportul cantitativ dintre procesele care produceau nitrat in
sistemul experimental si cele care il consumau erau in favoarea primelor. O explicatie ar putea
fi, un raport crescut al microorganismelor nitrificatoare comparativ cu cel al denitrificatorilor.
Experimentul a continuat si rezultatele asteptate au inceput sa fie obtinute. Biomasa cu
activitate denitrificatorie imbunatatita a fost apoi utilizata intr-un experiment mai complex, in
cadrul caruia s-a procedat nu doar la cuantificarea concentratiei de azotat dar si la
determinarea concentratiei de amoniu, a azotului total, precum si a carbonului organic si
anorganic total. In Figura 11 sunt prezentate aceste rezultate atat la inceputul experimentului
cat si la finalul sau, dupa 23 de ore de incubare.
Figura 11. Variatia valorilor parametrilor analizati (azot total - TN), amoniu (NH4), nitrat
(NO3), carbon organic total (TOC) si carbon anorganic total (TIC), de la inceputul
experimentului (T0) la finalul sau (Tf), dupa 23 de ore.
Se remarca scaderea cu putin peste 50% a concentratiei de NO3, reflectata si in scaderea
concentratie de azot total precum si scaderea marcanta a concentratiei de carbon organic, de
la 85,21 mg/mL la 44,16 mg/mL. Si in acest experiment, ca si in cele de imbogatire care au
pregatit consortiul microbian, unica sursa de carbon organic adaugata a fost acetatul. Acest
experiment demonstreaza cu claritate eficienta inoculului imbogatit in conditii microaerofile
in denitrificatori, de eliminare a peste 50 % din nitratul prezent initial in sistemul
experimental, in 23 de ore.
Activitatea 1.3.1. Selectarea de microorganisme fotosintetizante (cianobacterii și microalge)
pentru epurarea apelor reziduale rezultate din SAR.
Pe baza rezultatelor originale obtinute de catre noi (Manea si Ardelean, 2016) in domeniul
utilizarii microorganismelor fotosintetizante pentru indepartarea nitratului, rezultate obtinute
anterior contractarii proiectului ABAWARE, a devenit evidenta importanta acestora pentru
subiectul nostru, in concordanta cu datele din literatura stiintifica, internationala si nationala.
Sursele de microorganisme fotosintetizante, amestecuri complexe de populatii, au fost
urmatoarele:
a) amestecuri de populatii existente in Centrul de Microbiologie al IBB-AR, care au constituit
in ultimii 20 de ani materialul biologic pentru diferite tipuri de cercetari;
b) amestecuri de populatii existente in crescatoria de pesti de la Plutonita.
In Tabelul nr. 7 este prezentata evolutia in timp a capacitatii microorganismelor
fotosintetizante imobilizate pe bumbac, plastic dar si a celor ce formeaza agregate
macroscopice, de a indeparta nitratul din apa reziduala sintetica, model pentru compozitia
apei de iesire/recirculare dintr-un bazin operat pe principiile sistemelor de acvacultura
recirculanta.
Tabelul nr. 7. Evolutia pe parcursul a 9 saptamani a capacitatii consortiilor de
microorganisme fotosintetizante de a indeparta azotatul din faza lichida (mediul BG11
modificat). Vasul 1 - fototrofe imobilizate pe suport hidrofob; 2 - fototrofe imobilizate pe
suport hidrofil; 3 - fototrofe libere, autoasamblate in mod natural. Ratele de indepartare a
azotatului sunt exprimate in mg azotat/24 de ore, cu precizarea ca la vasele 1 si 2 fototrofele
sunt imobilizate pe o suprafata de 200cm2 iar in cazul vasului 3, volumul biomasei fototrofelor