1 Raport stiintific sintetic privind implementarea proiectului „Bio-platforma miniaturizata pentru testarea simultana a terapiei combinate si tumorigenicitatii melanomului” 131PED - MiniBioLab in perioada Ianuarie – Decembrie 2017 Context: Statistici recente, plaseaza cancerul ca fiind una dintre pricipalele cauze ale morbiditatii si mortalitatii din lume. Organizatia Mondiala a Sanatatii (WHO - World Health Organization) a evidentiat ca ~14 milioane de cazuri noi de cancer au fost raportate in 2012, in timp ce 8.2 milioane au fost cauzatoare de moarte. Din nefericire, perspectivele nu sunt deloc optimiste, incidenta cancerului fiind asteptata sa creasca cu aproape 70% (22 milioane de cazuri) in urmatoarele doua decenii [1]. Ne putem astfel gandi, ca populatia unei tari imaginare, avand populatia similara tarii noastre ar putea probabil disparea complet! Cele mai agresive si mortale forme de cancer cunoscute sunt cele ce afecteaza plamanii, ficatul si stomacul, insa si alte tipuri de cancer, ca de exemplu melanomul (cancerul de piele) [2], s-a dovedit extrem de agresiv datorita rezistentei ridicate la medicamente, ratei mari de recurenta si ratei de supravietuire foarte scazute [3]. La fel de agresive pot fi considerate si alte tipuri de cancer ca cel de colon, de sani sau alte tipuri de boli degenerative. Studii recente [4,5] au aratat ca celulele tumorale pot dezvolta un fenomen de „plasticitate”, ca raspuns la caracteristicile micromediului. Lee et al. [6], au evidentiat cum proprietatile interfaciale ale suprafetelor (ca de exemplu caracteristici geometrice ca forma si perimetru microstructurilor) influenteaza o populatie de celule tumorale, care pot ghida celulele canceroase spre o stare asemenatoare celulelor stem. Pe de alta parte, desi s-a demonstrat o eficienta terapeutica ridicata in tratamentul cancerului ca urmare a utilizarii de nanomateriale, aceasta reprezinta doar o latura a unei probleme mult mai complexe. O intelegere avansata a mecanismelor implicate in eliberarea de medicamente controlata si a tumorigenicitatii celulare sunt la fel de importante pentru a adresa probleme clinice reale [3]. Scopul proiectului MiniBioLab il reprezinta designul, dezvoltarea si testarea performantelor unei bio-platforme miniaturizate pentru investigarea simultana a : i) efectului sinergistic al unui amestec combinatorial precis de inhibitori de cai de semnalizare si modulatori epigenetici asupra celulelor de melanom; si ii) evaluarea tumorigenicitatii celulelor de melanom ghidata de caracteristicile geometrice ale patternurilor asamblate pe substraturi solide. Intr-adevar, melanomul este cel mai periculos cancer de piele, fiind cauzat de transformarea melanocitelor ce au suferit modificari genetice, generand astfel o proliferare si diseminare anormala. Melanomul malign este o tumoare heterogena ce poate fi tratata daca este descoperita devreme, dar care odata ajunsa in noduli limfatici sau alte organe, face ca supravietuirea medie a pacientilor sa scada sub 9 luni, doar 15% dintre ei traind mai mult de 3 ani. Principalele terapii s-au dovedit ineficiente pentru cresterea ratei de supravietuire deoarece celulele tumorale, dezvoltand o subpopulatie rezistenta la medicamente, se comporta ca o „tinta miscatoare”. Cercetarile recente din domeniu au evidentiat ca doar o terapie combinata reprezinta solutia pentru tratarea melanomului cu rezistenta ridicata. Acest proiect reprezinta o dezvoltare fireasca a proiectului TE186 intitulat „Sinteza de biblioteci compozitionale de filme subtiri prin procedee laser combinatoriale pentru selectarea de agenti cu tinta moleculara in melanom – COLASMEL”, implementat de catre aceeasi echipa de cercetare si care a fost finalizat in luna Noiembrie 2017. Am demonstrat ca acoperiri combinatoriale realizate prin tehnici laser inovative de nanomateriale din familia grafenelor (GFN – din engleza Graphene Family Nanomaterials) functionalizate cu proteine si inhibitori de cai de semnalizare (BRAFi) si modulatori epigenetici (HDACi) sunt eficiente, si mai mult, prezinta un efect sinergistic asupra celulelor de melanom (linia celulara SK28 izolata de la un pacient ce prezenta mutatie genetica a proteinei BRAF V600E ).
18
Embed
Raport stiintific sintetic privind implementarea ...lspi.inflpr.ro/2017/PED/PED131/Scientific_Report_2017_Axente_E.pdf · pentru cresterea ratei de supravietuire deoarece celulele
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
1
Raport stiintific sintetic
privind implementarea proiectului „Bio-platforma miniaturizata pentru testarea simultana a
terapiei combinate si tumorigenicitatii melanomului”
131PED - MiniBioLab
in perioada Ianuarie – Decembrie 2017
Context:
Statistici recente, plaseaza cancerul ca fiind una dintre pricipalele cauze ale morbiditatii si
mortalitatii din lume. Organizatia Mondiala a Sanatatii (WHO - World Health Organization) a
evidentiat ca ~14 milioane de cazuri noi de cancer au fost raportate in 2012, in timp ce 8.2 milioane
au fost cauzatoare de moarte. Din nefericire, perspectivele nu sunt deloc optimiste, incidenta
cancerului fiind asteptata sa creasca cu aproape 70% (22 milioane de cazuri) in urmatoarele doua
decenii [1]. Ne putem astfel gandi, ca populatia unei tari imaginare, avand populatia similara tarii
noastre ar putea probabil disparea complet! Cele mai agresive si mortale forme de cancer cunoscute
sunt cele ce afecteaza plamanii, ficatul si stomacul, insa si alte tipuri de cancer, ca de exemplu
melanomul (cancerul de piele) [2], s-a dovedit extrem de agresiv datorita rezistentei ridicate la
medicamente, ratei mari de recurenta si ratei de supravietuire foarte scazute [3]. La fel de agresive pot
fi considerate si alte tipuri de cancer ca cel de colon, de sani sau alte tipuri de boli degenerative.
Studii recente [4,5] au aratat ca celulele tumorale pot dezvolta un fenomen de „plasticitate”, ca
raspuns la caracteristicile micromediului. Lee et al. [6], au evidentiat cum proprietatile interfaciale ale
suprafetelor (ca de exemplu caracteristici geometrice ca forma si perimetru microstructurilor)
influenteaza o populatie de celule tumorale, care pot ghida celulele canceroase spre o stare
asemenatoare celulelor stem. Pe de alta parte, desi s-a demonstrat o eficienta terapeutica ridicata in
tratamentul cancerului ca urmare a utilizarii de nanomateriale, aceasta reprezinta doar o latura a unei
probleme mult mai complexe. O intelegere avansata a mecanismelor implicate in eliberarea de
medicamente controlata si a tumorigenicitatii celulare sunt la fel de importante pentru a adresa
probleme clinice reale [3].
Scopul proiectului MiniBioLab il reprezinta designul, dezvoltarea si testarea
performantelor unei bio-platforme miniaturizate pentru investigarea simultana a :
i) efectului sinergistic al unui amestec combinatorial precis de inhibitori de cai de
semnalizare si modulatori epigenetici asupra celulelor de melanom; si
ii) evaluarea tumorigenicitatii celulelor de melanom ghidata de caracteristicile geometrice
ale patternurilor asamblate pe substraturi solide.
Intr-adevar, melanomul este cel mai periculos cancer de piele, fiind cauzat de transformarea
melanocitelor ce au suferit modificari genetice, generand astfel o proliferare si diseminare anormala.
Melanomul malign este o tumoare heterogena ce poate fi tratata daca este descoperita devreme, dar
care odata ajunsa in noduli limfatici sau alte organe, face ca supravietuirea medie a pacientilor sa scada
sub 9 luni, doar 15% dintre ei traind mai mult de 3 ani. Principalele terapii s-au dovedit ineficiente
pentru cresterea ratei de supravietuire deoarece celulele tumorale, dezvoltand o subpopulatie rezistenta
la medicamente, se comporta ca o „tinta miscatoare”. Cercetarile recente din domeniu au evidentiat ca
doar o terapie combinata reprezinta solutia pentru tratarea melanomului cu rezistenta ridicata.
Acest proiect reprezinta o dezvoltare fireasca a proiectului TE186 intitulat „Sinteza de
biblioteci compozitionale de filme subtiri prin procedee laser combinatoriale pentru selectarea
de agenti cu tinta moleculara in melanom – COLASMEL”, implementat de catre aceeasi echipa de
cercetare si care a fost finalizat in luna Noiembrie 2017. Am demonstrat ca acoperiri combinatoriale
realizate prin tehnici laser inovative de nanomateriale din familia grafenelor (GFN – din engleza
Graphene Family Nanomaterials) functionalizate cu proteine si inhibitori de cai de semnalizare
(BRAFi) si modulatori epigenetici (HDACi) sunt eficiente, si mai mult, prezinta un efect sinergistic
asupra celulelor de melanom (linia celulara SK28 izolata de la un pacient ce prezenta mutatie genetica
a proteinei BRAFV600E).
2
Proiectul a demarat cu reuniunea echipelor de cercetare INFLPR si IB-AR pentru stabilirea
planului de experimente si a directiilor de urmat in cadrul Etapei I, dar si pregatirea strategiei de
achizitii din 2017, pentru ducerea la indeplinire a obiectivelor propuse. Am acordat o atentie deosebita
selectiei inhibitorilor de cai de semnalizare si a modulatorilor epigenetici astfel incat sa fie eficienti la
concentratii cat mai mici, in domeniul nM, pentru a creste sansele de reusita ale proiectului. Inhibitorii
propusi in proiect fac parte din doua categorii: inhibitori ai unor enzime care moduleaza aparitia
cancerului prin mecanisme epigenetice (HDACi) si inhibitori de cai de semnalizare (BRAFi) care
targeteaza grupul majoritar de pacienti cu mutatie in BRAF care activeaza calea constitutiv. Tot in
aceasta etapa au fost achizitionate marea majoritate a reactivilor si kit-urilor pentru testele biologice si
biochimice pentru a asigura cursivitatea necesara experimentelor si caracterizarilor. Pe baza
experientei anterioare, am selectat urmatorii inhibitori din fiecare clasa :
- Din clasa HDACi: Trichostatin A (TSA) – are formula chimica C17H22N2O3, greutatea
moleculara 302.4, si este solubil in apa, DMSO si etanol, astfel ca va putea fi relativ usor
de pregatit sub forma unei tinte criogenice. Coeficientul IC50 (half maximal inhibitory
concentration) reprezinta o masura a eficacitatii unei substante de a inhiba o functie
biologica sau biochimica specifica. Studiile au aratat o valoare IC50 de ~1.8 nM pentru TSA
fiind folosit de asemenea in studii privind cancerul mamar sau de plamani [7].
- Din clasa BRAFi: Dabrafenib/GSK2118436 – are formula chimica C23H20F3N5O2S2,
greutatea moleculara 519.56, si este solubil in apa, DMSO si etanol. Coeficientul IC50 este
de ~3.2 nM pentru B-raf si 0.8 nM pentru B-RafV600E fiind folosit de asemenea in studii
privind cancerul melanomului mutant si de colon [8].
Am stabilit impreuna achizitionarea unui echipament pentru investigarea caracterului
hidrofil/hidrofob al suprafetelor, deoarece atat morfologia cat si chimia suprafetelor pot influenta
decisiv comportamentul celular (in concordanta cu planificarea prevazuta in propunerea de proiect).
Sistemul permite masurarea unghiului de contact dintre picaturi de lichid (metoda sessile drop) si o
suprafata solida si a energiei libere a suprafetelor. A fost achizitionat de la firma Kruss GmbH,
Germania, model DSA25, o imagine de ansamblu a sistemului si a principalelor componente ale
acestui fiind prezentate in figura 1. Asa cum se poate vedea in figura, dispozitivul este prevazut cu
doua sisteme de dozare independente, controlate de calculator pentru dozarea precisa si reproductibila
a picaturilor, pana la volume de 0.5 µL. Unul dintre sisteme permite dozarea simultana a doua lichide
(apa si diiodometan) pe baza de presiune, denumit „double pressure dosing”, si care este utilizat pentru
determinarea rapida a energiei libere a suprafetelor (Figura 2).
Sistemul DSA25 este prevazut cu o camera rapida (2000 fps) de mare rezolutie (1200 x 800
px), conectata la calculator printr-un port USB 3.0. Colectarea imaginii se face cu un sistem optic cu
marire de 6.5x. Sursa de iluminare este LED monocromatic de mare putere, ce emite la lungimea de
unda dominanta de 470 nm. Proba de analizat se monteaza pe un sistem de translatie x-y micrometric.
Tot protocolul de masurare a unghiului de contact si determinare a energiei libere a suprafetelor este
realizat cu ajutorul software-ului Advance. Acesta ofera un protocol de lucru intuitiv pentru pregatirea
experimentului, masurarea, analizarea si exportul datelor catre calculator. In plus, dispunem de o larga
baza de date cu privire la lichidele de utilizat si proprietatile acestora. Este de asemenea posibila
realizarea de experimente de masurare a unghiului de contact la diverse temperaturi, intre temperatura
ambianta si 130°C, cu ajutorul unei camere speciale termostatate.
In continuare, am demarat experimente preliminare privind designul si fabricarea cu laserul de
masti ce vor fi utilizate pentru asamblarea micro-patternurilor si cofigurarea montajului experimental,
conform Obiectivului O.1 al proiectului. Prima activitate desfasurata a constat in selectia materialelor
si a designului asistat de calculator pentru fabricarea mastilor. Materialele utilizate vor trebui sa
indeplineasca simultan mai multe cerinte: sa prezinte rezistenta chimica si la coroziune ridicata fata de
solventii utilizati in experimentele ADD-MAPLE, sa fie stabile pe durata sterilizarii cu radiatie UV
sau la temperaturi ridicate, sa fie compatibile pentru a fi curatate in baia cu ultrasunete, sa aiba
stabilitate mecanica mare si sa asigure realizarea de patternuri cu rezolutie spatiala mare, sa fie
3
compatibile pentru procesare laser. Ne-am propus initial fabricarea de masti metalice din otel
inoxidabil si eventual polimerice.
Figura 1. Sistem pentru masurarea unghiului de contact si a energiei libere a suprafetelor.
Figura 2. Sistem pentru dozare simultana a doua lichide si determinarea energiei libere a
suprafetelor. Exemplu al unei astfel de masuratori cu softul Advance.
Experimentele de procesare laser a mastilor au fost efectuate in cadrul CETAL, INFLPR
(http://cetal.inflpr.ro/), in Laboratorul de Procesarea Materialelor. Am ales sa utilizam o platforma
laser cu picosecunde (Lumera, Coherent) ce este prezentata in Figura 3, datorita versatilitatii
experimantale ridicate. Principalele caracteristici ale acesteia sunt sintetizate in Figura 3. Asa cum se
poate observa, este vorba de un laser cu durata pulsului de 5 ps, ce poate fi operat atat in UV, la
lungimea de unda de 355 nm, dar si in vizibil la 532 nm. Puterea laserului poate fi variata intr-o gama
larga de valori (5-500 mW) si rate de repetitie de pana la 500 kHz, ceea ce poate diminua semnificativ
timpul de procesare.
Platorma contine de asemena axe de translatie XY motorizate de mare precizie (PlanarDL
Aerotech), cu viteza de deplasare variabila de pana la 750 mm/s, controlate de calculator. Toata
platforma de scriere directa cu laserul este controlata de un software dedicat, ce permite designul unor
patternuri cu orice tip de forme si dimensiuni, stabilite de catre utilizator. Procesul este monitorizat cu
ajutorul unei camere CCD, utilizata si pentru ajustarea focalizarii fasciculului laser pe suprafata sau in