1 RAPORT ŞTIINŢIFIC ŞI TEHNIC – ETAPA 3 / 2013 Obiectivul etapei Desfăşurarea experimentului de electroterapie în vederea eradicării virusurilor la viţa-de-vie şi cartof Rezultate aşteptate - evaluarea acţiunii curentului electric asupra evoluţiei subculturilor prin măsurători biometrice şi cuantificarea unor compuşi biochimici; - model al interacţiei câmp electromagnetic – material biologic; - monitorizarea proceselor fiziologice la plantele de viţă-de-vie şi cartof selecţionate sănătoase prin chimioterapie, - elaborarea tehnologiilor de eliminare a virusurilor specifice la viţa-de-vie şi cartof (2), - diseminarea rezultatelor prin publicaţii. Rezumat Stimularea electrică în cuva de electroforeză orizontală constituie una din metodele de eliminare a virusurilor la viţa-de-vie şi cartof. Electroterapia se bazează pe aplicarea unui câmp electric intens în apropierea materialului vegetal care duce prin efect corona, la apariţia în apropierea membranei celulare a unor distribuţii de sarcină electrică spaţială, ce face ca tensiunea transmembranară şi curentul transmembranar să fie diferite de cele corespunzătoare stării staţionare şi să inducă modificări intracelulare soldate cu inactivarea proteinei virale. Tratamentul lăstarilor erbacei cu diferite intensităţi ale curentului electric (40, 50, 100 mA) timp de 5, 10, 15 minute şi inocularea lor pe medii de cultură specifice nu a influenţat în sens negativ viabilitatea explantelor. Eventuala influenţă a tratamentului electric a fost apreciată prin cuantificarea ratelor de multiplicare şi a unor compuşi biochimici, pe parcursul a trei subculturi. La viţa-de-vie, la prima subcultură, apexurile tratate electric au multiplicat semnificativ diferit pe variantele experimentale, la ambele genotipuri studiate, fără o variaţie liniară cu creşterea intensităţii curentului sau a timpului, în timp ce la fragmentele nodale nu s -au înregistrat diferenţe semnificative comparativ cu martorul. La următoarele două subculturi, variaţia ratelor de multiplicare pe variante comparativ cu matorul s-a menţinut, valorile acestui indice a crescut conform tehnicii de micropropagare in vitro, asigurând regenerarea unui număr mare de plante. La cartof, rata de multiplicare a crescut în toate variantele experimentale faţă de martorul netratat, ceea ce denotă faptul că, efectul benefic al electroterapiei este mai intens decât al altor tehnici convenţionale de devirozare (cultura de meristem, termoterapia). Rata de multiplicare a explantelor in vitro a fost influenţată semnificativ atât de tipul virusului, cât şi de intensitatea curentului şi durata tratamentului. După prima subcultură post tratament electric cuantificarea unor indicatori biochimici (conţinutul în zaharuri solubile, polifenoli totali, pigmenţi clorofilieni şi carotenoizi) la plantulele de viţă-de-vie, nu a pus în evidenţă diferenţe semnificative la variantele experimentale comparativ cu martorul. Diferite intensităţi ale curentului precum şi timpi de tratament diferiţi nu şi -au manifestat acţiunea pe termen lung, indicatorii evaluaţi nu au înregistrat diferenţe semnificative comparativ cu martorul pe parcursul celor trei subculturi. La cartof, dozarea conţinutului în amidon a înregistrat o dependenţă direct proporţională cu intensitatea curentului electric şi implicit cu durata de expunere. După trei subculturi consecutive, la explantele infectate cu ambele virusuri s-a înregistrat o scădere a conţinutului de proteină brută, în special în cazul variantelor de tratament mai severe şi mai ales la materialul infectat cu virusul Y. Analiza unor indicatori fiziologici (intensitatea fotosintezei, a respiraţiei, pigmenţi clorofilieni etc.) a pus în evidenţă diferenţe semnificative la plantele de viţă-de-vie şi cartof regenerate libere de virusuri, care nu pot fi puse numai pe seama prezenţei chimioterapicelor, ci şi a influenţelor induse de condiţiile
20
Embed
RAPORT ŞTIINŢIFIC ŞI TEHNIC ETAPA 3 / 2013 Obiectivul …sanoplant.org.ro/docs/raport_faza_3.pdf · - evaluarea acţiunii curentului electric asupra evoluţiei subculturilor prin
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
1
RAPORT ŞTIINŢIFIC ŞI TEHNIC – ETAPA 3 / 2013
Obiectivul etapei
Desfăşurarea experimentului de electroterapie în vederea eradicării virusurilor la viţa-de-vie şi
cartof
Rezultate aşteptate
- evaluarea acţiunii curentului electric asupra evoluţiei subculturilor prin măsurători biometrice şi
cuantificarea unor compuşi biochimici;
- model al interacţiei câmp electromagnetic – material biologic;
- monitorizarea proceselor fiziologice la plantele de viţă-de-vie şi cartof selecţionate sănătoase prin
chimioterapie,
- elaborarea tehnologiilor de eliminare a virusurilor specifice la viţa-de-vie şi cartof (2),
- diseminarea rezultatelor prin publicaţii.
Rezumat
Stimularea electrică în cuva de electroforeză orizontală constituie una din metodele de eliminare
a virusurilor la viţa-de-vie şi cartof. Electroterapia se bazează pe aplicarea unui câmp electric intens în
apropierea materialului vegetal care duce prin efect corona, la apariţia în apropierea membranei
celulare a unor distribuţii de sarcină electrică spaţială, ce face ca tensiunea transmembranară şi curentul
transmembranar să fie diferite de cele corespunzătoare stării staţionare şi să inducă modificări
intracelulare soldate cu inactivarea proteinei virale. Tratamentul lăstarilor erbacei cu diferite intensităţi
ale curentului electric (40, 50, 100 mA) timp de 5, 10, 15 minute şi inocularea lor pe medii de cultură
specifice nu a influenţat în sens negativ viabilitatea explantelor. Eventuala influenţă a tratamentului
electric a fost apreciată prin cuantificarea ratelor de multiplicare şi a unor compuşi biochimici, pe
parcursul a trei subculturi. La viţa-de-vie, la prima subcultură, apexurile tratate electric au multiplicat
semnificativ diferit pe variantele experimentale, la ambele genotipuri studiate, fără o variaţie liniară cu
creşterea intensităţii curentului sau a timpului, în timp ce la fragmentele nodale nu s-au înregistrat
diferenţe semnificative comparativ cu martorul. La următoarele două subculturi, variaţia ratelor de
multiplicare pe variante comparativ cu matorul s-a menţinut, valorile acestui indice a crescut conform
tehnicii de micropropagare in vitro, asigurând regenerarea unui număr mare de plante. La cartof, rata de
multiplicare a crescut în toate variantele experimentale faţă de martorul netratat, ceea ce denotă faptul
că, efectul benefic al electroterapiei este mai intens decât al altor tehnici convenţionale de devirozare
(cultura de meristem, termoterapia). Rata de multiplicare a explantelor in vitro a fost influenţată
semnificativ atât de tipul virusului, cât şi de intensitatea curentului şi durata tratamentului. După prima
subcultură post tratament electric cuantificarea unor indicatori biochimici (conţinutul în zaharuri
solubile, polifenoli totali, pigmenţi clorofilieni şi carotenoizi) la plantulele de viţă-de-vie, nu a pus în
evidenţă diferenţe semnificative la variantele experimentale comparativ cu martorul. Diferite intensităţi
ale curentului precum şi timpi de tratament diferiţi nu şi-au manifestat acţiunea pe termen lung,
indicatorii evaluaţi nu au înregistrat diferenţe semnificative comparativ cu martorul pe parcursul celor
trei subculturi. La cartof, dozarea conţinutului în amidon a înregistrat o dependenţă direct proporţională
cu intensitatea curentului electric şi implicit cu durata de expunere. După trei subculturi consecutive, la
explantele infectate cu ambele virusuri s-a înregistrat o scădere a conţinutului de proteină brută, în
special în cazul variantelor de tratament mai severe şi mai ales la materialul infectat cu virusul Y.
Analiza unor indicatori fiziologici (intensitatea fotosintezei, a respiraţiei, pigmenţi clorofilieni etc.) a
pus în evidenţă diferenţe semnificative la plantele de viţă-de-vie şi cartof regenerate libere de virusuri,
care nu pot fi puse numai pe seama prezenţei chimioterapicelor, ci şi a influenţelor induse de condiţiile
2
de mediu şi genotip. Rezultatele cercetărilor obţinute până în această fază de derulare a proiectului au
fost valorificate prin publicarea de lucrări ştiinţifice.
Descrierea ştiinţifică şi tehnică
1. Parcurgerea etapelor de regenerare in vitro a plantulelor de viţă-de-vie libere de virusuri, după
aplicarea electroterapiei - P1
Viţa-de-vie este una din speciile horticole cele mai susceptibile a fi infectate de diverşi agenţi
infecţioşi printre care şi virusurile. Selecţia riguroasă din punct de vedere al prezenţei infecţiei virale, a
plantelor utilizate la producerea materialului de înmulţire horticol constituie obiectivul principal atât al
amelioratorilor cât şi al cultivatorilor agricoli. Într-adevăr, începând cu 1960, state sau uniuni de state,
ca fosta Comunitate Economică Europeană, s-au implicat în definirea cadrului legal privind statutul
fitosanitar al viţei-de-vie (68/93 EEC), plante ornamentale (77/93 EEC) şi pomi fructiferi (92/34 EEC).
O abordare similară a fost întreprinsă de Organizaţia Nord Americană pentru Protecţia Plantelor
(NAPPO) (Panattoni şi colab., 2013).
Eliminarea virusurilor şi obţinerea materialului de înmulţire viticol sănătos a devenit necesară în
cazul genotipurilor de interes economic, în curs de omologare şi menţinerea unei surse de material
necesar amelioratorilor, liber de virusuri.
În cadrul proiectului a fost experimentată o modalitate de utilizare a curentului electric în
blocarea multiplicării virale. Fragmente erbacee provenite de la plante de viţă-de-vie infectate au fost
tratate electric în cuva de electroforeză orizontală la intensităţi crescătoare ale curentului (40, 50, 100
mA) şi timpi de stimulare diferiţi (5, 10, 15 minute). Materialul biologic luat în studiu a fost reprezentat
de genotipurile Tămâioasă românească 3-2-2 în curs de omologare aparţinând INCDBH Ştefăneşti-
Argeş, infectat cu fleck (GFkV) şi Frâncuşă 15 Od infectat cu virusul asociat răsucirii frunzei serotip 1
(GLRaV 1) aparţinând SCDVV Odobeşti.
Lăstarii trataţi au fost fragmentaţi în apexuri şi fragmente nodale, sterilizaţi şi cultivaţi pe mediu
specific viţei-de-vie în condiţii aseptice. Culturile au fost incubate în camere de creştere cu parametri
controlaţi (25±10C, 16/8 fotoperioada). După iniţiere, explantele au fost transvazate pe mediu proaspăt
la fiecare 30 de zile, timp de 3 subculturi.
După fiecare subcultură a fost cuantificată rata de multiplicare pe variantele experimentale, ca
indicator al evoluţiei proceselor de organogeneză ale explantelor tratate electric. Fiecare explant a fost
evaluat individual astfel încât, ratele de multiplicare constituie medii pe variantele experimentale.
Evaluarea ratelor de multiplicare după prima subcultură a pus în evidenţă atât la genotipul
Tămâioasă românească 3-2-2 cât şi la Frâncuşă 15 Od, diferenţe semnificative pe variante
experimentale comparativ cu martorul, în cazul apexurilor, ca tip de explant cu care au fost iniţiate
culturile.
Astfel, la genotipul Tămâioasă românească 3-2-2 infectat cu GFkV, stimularea electrică cu 40
mA conduce la scăderea semnificativă a ratei de multiplicare la 10 minute timp de tratament (V2). O
creştere a intensităţii curentului de numai 10 mA conduce la scăderea semnificativă a ratei la 5 minute
timp de stimulare, după care, creşterea timpului determină o mărire semnificativă a numărului de
fragmente de multiplicare, după 15 minute de stimulare a explantului iniţial. Dublarea intensităţii
curentului determină scăderea ratei de multiplicare la 5 minute, după care, indicatorul creşte
semnificativ odată cu creşterea timpului de tratament. Aşadar, o stimulare cu 50 mA timp de 15 minute
a unui apex şi cultivarea acestuia pe mediu de cultură steril conduce la o creştere semnificativă a
numărului de fragmente de multiplicare (Fig. 1.1). Stimularea electrică în cuva de electroforeză
orizontală a fragmentelor nodale nu s-a soldat cu diferenţe semnificative ale ratelor de multiplicare,
indiferent de varianta experimentală.
Comportarea diferită la stimuli electrici a diferitelor tipuri de explante demonstrează încă o dată
că, regenerarea plantelor prin micropropagare depinde de numeroşi factori printre care: genotipul,
stadiul fiziologic al explantului cultivat pe mediul de cultură, condiţiile de cultură, mediul de cultură,
3
precum şi interacţiile dintre aceşti factori (Svetleva şi colab., 2003). În cazul de faţă, la toate acestea se
adaugă prezenţa infecţiei virale, care are un rol determinant în declanşarea proceselor regenerative ale
explantelor cultivate in vitro (Guţă şi colab., 2009). Mai mult decât atât, curentul electric sub formă de
pulsuri determină stimularea diferenţierii in vitro a plantulelor (Goldsworthy, 1997). A fost raportată
îmbunătăţirea regenerării plantelor de cartof prin expunerea explantelor la curent electric (Lozoya-
Saldana şi colab., 1996).
Fig. 1.1 Influenţa curentului electric asupra ratei de multiplicare după prima subcultură,
la genotipul Tămâioasă românească 3-2-2 infectată cu GFkV. Valorile sunt medii pe 3 repetiţii, barele
indică deviaţiile standard ale mediilor, literele reprezintă semnificaţiile mediilor comparativ cu
martorul la P<0,05
Genotipul Frâncuşă 15 Od infectat cu GLRaV 1 se comportă similar, în sensul că ratele de
multiplicare ale explantelor provenite din apexuri stimulate electric, prezintă diferenţe semnificative
comparativ cu martorul, pe variantele experimentale, spre deosebire de cele determinate de evoluţia
fragmentelor nodale. Tratamentul apexurilor cu curent electric de 40, 50 mA conduce la scăderea
semnificativă a ratelor de multiplicare, în timp ce 100 mA determină creşterea semnificativă a
proceselor de regenerare după numai 5 minute de tratament. Mărirea timpului de stimulare electrică
influenţează în sens negativ declanşarea proceselor de morfogeneză (Fig. 1.2)
Fig. 1.2 Influenţa curentului electric asupra ratei de multiplicare după prima subcultură,
la genotipul Frâncuşă 15 Od infectată cu GLRaV 1. Valorile sunt medii pe 3 repetiţii, barele indică
deviaţiie standard ale mediilor, literele reprezintă semnificaţiile mediilor
comparativ cu martorul la P<0,05
a
a
b
a
a
a
b
a
a a
d a
b
a c a c
a a
a
0
2
4
6
8
1 2
Rat
a d
e m
ult
iplic
are
(x)
Tip de explant: 1-apex; 2-fragment nodal
V1
V2
V3
V4
V5
V6
V7
b
a
b
a
c a
b
a
b a b
a
d a
a a
b
a
a
a
0
1
2
3
4
5
1 2Rat
a d
e m
ult
iplic
are
(x)
Tip de explant: 1-apex;2-fragment nodal
V1
V2
V3
V4
V5
V6
V7
4
Este normal ca influenţa curentului electric să fie resimţită de către explante, la prima
subcultură. Apexurile ambelor genotipuri subcultivate pe mediu proaspăt (S2, S3), continuă să prezinte
diferenţe semnificative ale ratelor de multiplicare pe variantele experimentale comparativ cu martorul.
Valorile sunt crescătoare asigurând micropropagarea şi regenerarea unui număr mare de plante de viţă-
de-vie. Diferenţele de mărime între ratele celor două genotipuri studiate derivă din diferenţa dintre
virusuri şi chiar datorită potenţialului regenerativ diferit, specific soiului de viţă-de-vie (Fig. 1.3 şi 1.4).
Fragmentele nodale stimulate electric parcurg încă o subcultură fără modificări semnificative
ale ratelor de multiplicare. La subcultura a treia, genotipul Tămâioasă românească 3-2-2 înregistrează
cea mai mare valoare a indicatorului la varianta trei (40 mA, 15 min) şi anume, 19,33 ± 1,5275
comparativ cu 11 ± 8,7178, martorul. Genotipul Frâncuşă 15 Od se comportă similar, cea mai mare rată
de multiplicare diferenţiindu-se la prima variantă (40 mA, 5 min), (21,33 ± 4,1633) comparativ cu
martorul (7 ± 1,00).
Fig. 1.3 Influenţa curentului electric asupra ratei de multiplicare a apexurilor, în dinamică,
pe subculturi, la genotipul Tămâioasă românească 3-2-2 infectată cu GFkV. Valorile sunt medii pe 3
repetiţii, barele indică deviaţiile standard ale mediilor, literele reprezintă semnificaţiile mediilor
comparativ cu martorul la P<0,05
Fig. 1.4 Influenţa curentului electric asupra ratei de multiplicare a apexurilor, în dinamică, pe
subculturi, la genotipul Frâncuşă 15 Od infectată cu GLRaV 1. Valorile sunt medii pe 3 repetiţii, barele
indică deviaţiie standard ale mediilor, literele reprezintă semnificaţiile mediilor
a b
d
a a
b c
d c
a
d
i
a
c
h
a b
g
d
f
g
e
e
f
b
c
e
a a
a
0
5
10
15
20
25
S1 S2 S3
Rat
a m
ult
iplic
are
(x)
Subculturi
V1
V2
V3
V4
V5
V6
V7
V8
a a
a
b
a
d
a a
a
b a
b
c
c
e
e
d a
b
b
a
d
f
c
d
e
e
a a
a
0
5
10
15
20
25
S1 S2 S3
Rat
a m
ult
iplic
are
(x)
Subculturi
V1
V2
V3
V4
V5
V6
V7
V8
5
comparativ cu martorul la P<0,05
Bibliografie
Goldsworthy A., 1997 - Electrical stimulation of tissue culture growth and morphogenesis. Agriculture
cell report 8, 14.
Guţă I.C., Buciumeanu E.-C., Vişoiu E., 2009 – Comparative study of in vitro behavior of grapevine
(V.Vinifera L., Fetească neagră cv.) under the influence of various infections. Extended abstacts
16th
Meeting of ICVG, Dijon, France, 31 Aug.- 4 Sept., 247.
Lozoya-Saldaña H.F., Abelló J., García G., 1996 - Electrotherapy and shoot-tip culture eliminate potato
virus X in potatoes. Am. J. Potato Res. 73, 149-154.
Panattoni A., Luvisi A., Triolo E., 2013 – Review. Elimination of viruses in plants: twenty years of
progress. Span. J. Agric. Res.11 (1), 173-188.
Svetleva D., Velcheva M., Bhowmik G., 2003 - Biotechnology as a useful tool in common bean
(Phaseolus vulgaris L.) improvement. Euphytica 13, 189-200.
2. Evaluarea acţiunii curentului electric asupra dezvoltării plantulelor de viţă-de-vie pe parcursul
subculturilor prin cuantificarea unor compuşi biochimici - P1
Micropropagarea este o metodă de înmulţire vegetativă care se bazează pe totipotenţa celulei
vegetale, conform căreia, fiecare celulă conţine întreaga informaţie genetică necesară regenerării unui
alt individ. Mediile de cultură au o compoziţie complexă, combinaţia chimică şi proporţia substanţelor
fiind stabilită pe baza analizelor calitative şi cantitative făcute asupra cenuşii diferitelor specii de plante
şi a gazelor emanate la incinerarea acestora, precum şi din experienţe de nutriţie.
Macroelementele sunt elemente chimice de bază care intră în structura materiei vii: C, O, H, N,
S, P, K, şi Ca. Prezenţa lor este indispensabilă în mediile de cultură. Proporţia între diferiţi
macronutrienți variază de la o plantă la alta, dar, în general se apreciază că oxigenul alcătuieşte 70%
din materia vie, carbonul 18%, hidrogenul 10,5%, cele trei elemente însumate deţinând 98,5% din
compoziţia plantelor. P, K, S şi N sunt participante cu zecimi de procente. Ca şi K joacă un rol
important în funcţionarea celulei, în gradul de fluiditate a citoplasmei, în schimbul ionic, în
permeabilitatea membranei celulare etc. O parte mai redusă o au macroelementele: Mg, Na, Cl, Al, sub
formă de ioni, în mediul de dispersie sau în vacuole. Mg intră în molecula de clorofilă, Na joacă un rol
important în schimburile de ioni, dar excesul de Na poate cauza substituirea K din celule şi
alcalinizarea mediilor. Ionii de Ca în exces pot provoca acidifierea acestora, iar Al serveşte drept
catalizator într-o serie de reacţii metabolice. Aceste 12 elemente realizează cca. 99,99% din substanţa
vie. Microelementele, deși sunt necesare în cantități reduse, devin indispensabile în compoziția
mediilor de cultură, exercitând un rol deosebit asupra ţesuturilor crescute in vitro, deoarece intră în
compoziţia a numeroase combinaţii organometalice, complexe, cu valoare biologică ridicată, alcătuiesc
sisteme enzimatice-metaloenzimale (citocromoxidaza şi peroxidaza) fără de care procesele vitale nu se
pot desfăşura. Suprimarea lor totală produce reducerea creşterilor cu 40% începând cu prima subcultură
şi provoacă moartea explantelor la cea de-a treia subcultură. Fierul, molibdenul şi manganul împreună
măresc ritmul creşterii celulare. Fe intră în compoziţia unor metalo-enzime, este implicat în sinteza
proteică, iar împreună cu Mo sporeşte conţinutul de proteine în celule şi acumularea în ţesuturi de N
neproteic. Cuprul este necesar pentru creşterea rădăcinilor. Manganul este şi el implicat în sinteza
proteinelor, carenţa represând ARN din celule. Mn este necesar pentru creşterea rădăcinilor. Trebuie
avută în vedere proporţia între Mn/Mg, deoarece Mn într-o serie de reacţii metabolice provocând
perturbaţii celulare grave. Se va avea în vedere că unele substanţe chimice pot imobiliza chimic unii
ioni sau pot provoca precipitarea unor săruri. Cu toate că inoculii sunt verzi, celulele lor deşi posedă
cloroplaste, nu au capacitatea de a fi total autotrofe, menţinerea lor în viaţă depinzând de prezenţa unei
surse de carbon glucidic. Ţesuturile devin heterotrofe faţă de carbon. Cu timpul ţesuturile se
depigmentează, semnal că în mediul de cultură sunt absenţi compuşi implicaţi în sinteza clorofilei, ori a
6
slabei funcţionări a cloroplastelor. Acest fenomen de anemie clorofiliană, se poate datora şi lipsei de
fier. Ca sursă de carbon, în mediile de cultură se folosesc glucidele, în special zaharoza. Concentraţia
optimă este de 2%. Sunt situaţii când se cer concentraţii de 8% la care zaharoza fără a devenii toxică
este mai puţin eficientă. Vitaminele sunt prezente în toate mediile de cultură şi sunt indispensabile unei
multiplicări şi creşteri optime. Regulatorii de creștere (auxine, citochinine, gibereline) sunt compuși
similari fitohormonilor, având un rol primordial în multiplicarea, creşterea şi diferenţierea explantelor
cultivate „in vitro”, dar sunt de natură exogenă și nu produși de către organismul plantei ca și
fitohormonii (Petruş, 2009).
De-a lungul timpului, numeroşi cercetători au formulat reţete de mediu pentru diferite specii de
plante, în funcţie de necesităţile lor fiziologice. Momentul de răscruce în acest domeniu, l-a reprezentat
reţeta publicată de Murashige şi Skoog în 1962, care le poartă numele şi care a fost concepută iniţial
pentru cultura ţesuturilor de tutun. Ulterior a fost preluată şi pentru alte specii, fiind în prezent cea mai
utilizată reţetă de mediu. Regenerarea viţei-de-vie prin culturi de ţesuturi utilizează mediul de bază
Murashige-Skoog suplimentat cu concentraţii diferite de hormoni: 1 mg/L benzilaminopurină (BAP) +
0,5 mg/L acid indolilacetic în fazele de multiplicare şi 1,8 mg/L AIA + 0,022 mg/L kinetină la
înrădăcinarea in vitro. Aşadar, ţesuturile de viţă-de-vie cultivate pe mediu de cultură specific dispun de
nutrienţii necesari declanşării proceselor de organogeneză care conduc la regenerarea de noi indivizi.
Electroterapia a constat în cazul de faţă, în stimularea electrică în cuva de electroforeză
orizontală a porţiunilor de lăstari erbacei provenite de la plante infectate cu virusuri şi cultivarea lor
ulterioară pe medii de cultură sterile. Curentul electric a acţionat deci un timp relativ scurt, 5-15 minute
după care, explantele au parcurs etapele specifice micropropagării. Cuantificarea unor compuşi
biochimici în vitroplante pe parcursul subcultivării lor a avut ca scop aprecierea unei eventuale
influenţe a curentului asupra dezvoltării propagulilor.
După prima subcultură post tratament electric cuantificarea unor indicatori (conţinutul în
zaharuri solubile, polifenoli totali, pigmenţi clorofilieni şi carotenoizi) nu a pus în evidenţă diferenţe
semnificative la variantele experimentale comparativ cu martorul (Tabelul 2.1 şi 2.2, Fig. 2.1 şi 2.2).
Fig. 2.1 Evoluţia subculturilor de Tămâioasă românească 3-2-2, după 60 de zile de la tratamentul
electric. De la stânga la dreapta: Martor-V3 (40mA, 15 min), Martor – V6 (50 mA, 15 min),
Martor - V9 (100 mA, 15 min)
7
Tabelul 2.1
Evaluarea unor compuşi biochimici după prima subcultură de la stimularea electrică,
la genotipul Tămâioasă românească 3-2-2 infectat cu GFkV
Indicatori
biochimici
V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 Martor
Substanţă
uscată
%
8,56
±2,55
E-02
9,42
±2,49
E-02
9,70
±1,14
E-02
9,94
±1,51
E-02
8,96
±1,75
E-02
9,05
±2,54
E- 02
8,68
±2,36
E- 02
9,12
±1,1
E-02
8,76
±2,54
E-02
9,01
±0,89
E-02
Carbohidraţi
solubili
mg % s.u.
4,75
±3,48
E-02
5,16
±1,30
E-02
4,64
±2,31
E-02
5,01
±1,00
E-02
4,58
±1,85
E-02
4,83
±1,30
E-02
4,76
±1,35
E-02
5,12
±1,58
E-02
4,95
±1,80
E-02
5,10
±2,20
E-02
Polifenoli
mg % s.u.
4,35
±8,36
E-03
3,68
±1,92
E-02
3,40
±4,58
E-02
4,26
±1,51
E-02
4,56
±1,44
E-02
4,53
±7,35
E-03
5,02
±1,62
E-02
4,85
±6,36
E-03
4,63
±4,56
E-03
4,13
±4,51
E-02
Clorofila a
mg/g s.v
0,614
±8,36
E-04
0,654
±1,58
E-03
0,646
±1,40
E-03
0,670
±6,58
E-03
0,624
±3,38
E-02
0,612
±2,58
E-03
0,646
±1,53
E-03
0,640
±4,18
E-02
0,624
±3,58
E-03
0,634
±2,08
E-03
Clorofila b
mg/g s.v
0,230
±4,03
E-03
0,254
±1,14
E-03
0,221
±1,78
E-03
0,216
±1,14
E-03
0,252
±4,14
E-03
0,231
±2,134
E-02
0,246
±1,54
E-03
0,242
±5,14
E-02
0,213
±1,64
E-03
0,249
±5,14
E-02
Carotenoizi
mg/g s.v
0,410
±1,51
E-03
0,443
±1,30
E-03
0,457
±1,40
E-03
0,480
±1,14
E-03
0,452
±1,59
E-02
0,461
±1,61
E-03
0,450
±2,01
E-03
0,418
±0,96
E-02
0,435
±1,31
E-03
0,427
±2,82
E-03
Fig. 2.2 Evoluţia subculturilor de Frâncuşă 15 Od, după 60 de zile de la tratamentul electric.
De la stânga la dreapta: Martor-V1 (40mA, 5 min), Martor - V5 (50 mA, 10 min),
Martor - V9 (100 mA, 15 min)
Diferite intensităţi ale curentului precum şi timpi de tratament diferiţi nu şi-au manifestat
acţiunea pe termen lung, indicatorii evaluaţi nu au înregistrat diferenţe semnificative comparativ cu
martorul pe parcursul celor trei subculturi (aprox. 100 zile) de multiplicare
Bibliografie
Petruş A., 2009 - Lucrări practice de biotehnologie generală. Universitatea din Oradea. [online].
Martor pozitiv 20,93±0,556 (e) 25,08±1,576 (d) 25,75±1,446 (c) * pentru fiecare variantă s-au testat câte 4 plante regenerate, la fiecare plantă s-a determinat valoarea medie pentru 3
determinari (din diferite zone ale aparatului foliar)
** Literele indică semnificaţiile diferenţelor dintre variante (pe fiecare coloană, pentru fiecare tip de virus) conform
ANOVA şi testului Duncan (P<0.05).
Rezultatele sintetizate în tabelul 6.2 şi figura 6.2 evidenţiază efectul chimioterapicelor utilizate
în variantele experimentale, precum şi diferenţele care există între comportamentul materialului infectat
cu două virusuri diferite.
19
Fig. 6.2 Influenţa tratamentelor chimioterapice asupra dezvoltării plantelor regenerate sănătoase.
Conţinutul de clorofilă (unităţi ACI) determinat cu dispozitivului portabil SPAD 502 (Chlorophyll
Meter) la plante provenite din material biologic infectat cu virusurile PVY şi PVX şi regenerate
după 3 subculturi consecutive (două cu viricide şi unul MS) şi aclimatizat în condiţii de seră.
Barele de eroare reprezintă intervalul de confidenţă al erorilor (CI).
Diferenţele mai mult sau mai puţin semnificative privind anumiţi indicatori fiziologici la
plantele de viţă-de-vie şi cartof, regenerate libere de virusuri în urma tratamentelor cu chimioterapice,
nu pot fi puse strict pe seama concentraţiilor de viricide sau a timpului de tratament, deoarece, fiecare
plantă constituie un individ singular şi complex, care se dezvoltă independent în funcţie de condiţiile de
mediu sau de genotip. Este cunoscut faptul că, procesele de fotosinteză şi respiraţie sunt influenţate
direct de temperatură, umiditate, intensitate luminoasă la nivelul fiecărui individ. Pe de altă parte,
genotipul este răspunzător de dezvoltarea aparatului foliar la plantele regenerate de viţă-de-vie şi cartof.
Important este faptul că, tratamentele cu viricide au condus la obţinerea de plante libere de
virusuri. Ca urmare, a fost atins unul din obiectivele proiectului şi anume, au fost elaborate tehnologii
de eliminare a virusurilor la viţa-de-vie şi cartof prin chimioterapie in vitro cu ribavirină şi oseltamivir.
Proiectul îşi propune în continuare experimentarea aplicării curentului electric pentru
inactivarea proteinei virale, precum şi experimentarea terapiilor combinate, electroterapie urmată de
chimioterapie, în vederea îmbunîtîţirii ratei de eliminare virală. Analiza economică a tehnologiilor va
decide care dintre metodele propuse este cea mai eficientă şi va conduce la brevetarea acesteia.
I. Tehnologie de eliminare a virusului fleck la viţa-de-vie prin chimioterapie in vitro cu ribavirină şi
oseltamivir
1. Identificarea infecţiei virale;
2. Cultivarea in vitro a fragmentelor de lăstari erbacei proveniţi de la plantele infectate, pe mediu de
cultură specific viţei-de-vie (Murashige şi Skoog, 1962; Vişoiu şi Teodorescu, 2001), suplimentat cu
două chimioterapice, ribavirină şi oseltamivir:
- recoltarea lăstarilor, fragmentarea în minibutaşi uninodali, dezinfecţia cu hipoclorit de calciu 6-10%
timp de 4 min;
- inocularea pe mediu agarizat suplimentat cu 20 mg/L ribavirină şi 40 mg/L oseltamivir, în condiţii
sterile la hota cu flux de aer laminar;
- incubarea timp de 30 de zile pe mediu cu viricide, urmată de o subcultură pe mediu fără
chimioterapice, în camere de creştere la temperatura de 24 ± 1C, fotoperioada 16 ore lumină şi
iluminarea 3000-3500 lx;
- înrădăcinarea in vitro pe mediu specific viţei-de-vie;
3. Aclimatizarea şi fortificarea plantelor regenerate (90 de zile).
4. Analiza virologică a plantelor regenerate în vederea selecţiei plantelor libere de virus.
II. Tehnologie de eliminare a virusurilor X, izolatele 1 şi 2 (PVX1, PVX2), Y , izolatele 1 şi 2 (PVY1,
PVY2) ale cartofului prin chimioterapie in vitro cu ribavirină şi oseltamivir
1. Identificarea infecţiei virale;
2. Iniţierea culturilor prin detaşarea colţilor de cartof de 2-3 cm lungime, sterilizarea cu clorură
mercurică 0,5% timp de 3 minute, inocularea pe mediul de cultură specific cartofului (Murashige şi
Skoog, 1962; Nistor şi colab., 2010) şi incubarea în camere de creştere la temperatura de 24 ± 1C,
fotoperioada 16 ore lumină şi iluminarea 3000-3500 lx;
20
3. Butăşirea plantulelor şi cultivarea acestora pe mediu de cultură specific suplimentat cu viricide:
ribavirină 40mg/L + oseltamivir 40 mg/L timp de 2 subculturi (60 zile);
4. Butăşirea plantulelor tratate cu chimioterapice şi cultivarea lor pe mediu fără viricide;
5. Aclimatizarea şi fortificarea plantelor regenerate (90 de zile).
6. Analiza virologică a plantelor regenerate în vederea selecţiei plantelor libere de virus.
Bibliografie
Murashige T. şi Skoog F., 1962 - A revised medium for rapid grow and bioassays with Tabacco tissue
culture. Physiol. Plant. 15, 473-49
Nistor A., Câmpeanu G., Atanasiu N., Chiru N., Caracsoniy D., 2010- Influence of potatto genotypes
on in vitro production of microtubers. Romanian Biotechnological Letters 15 (3), 5317-5324
Vişoiu E. şi Teodorescu Al., 2001 – Biotehnologii de producere a materialului săditor viticol. Ed.
Ceres, Bucureşti.
7. Diseminare rezultate – CO, P1, P2
Rezultatele cercetărilor obţinute până în această fază de derulare a proiectului au fost
valorificate prin publicarea următoarelor lucrări ştiinţifice:
Topală CM (2013). Temperature Effects On The FTIR Spectra Of Ribavirin. Rev Chim 64(2): 132-135.
Topală C., Oprescu B., Tătaru L., 2013 - FT/IR study on changes induced by chemotherapy and
electrotherapy application in grapevine. Analele Universităţii din Craiova, seria Biologie,