RAPORT ŞTIINŢIFIC ŞI TEHNIC – ETAPA 2/2013 Obiectivul etapei Elaborarea modelului conceptual, obţinerea materialului biologic necesar aplicării electroterapiei Rezultate aşteptate - aprecierea influenţei chimioterapicelor asupra culturilor de viţă-de-vie şi cartof prin cuantificarea unor compuşi biochimici şi selecţia plantelor sănătoase; - modelul experimental de eliminare a virusurilor la viţa-de-vie şi cartof prin electroterapie; - iniţierea culturilor pe variantele experimentale (2 virusuri/specie) Rezumat Prezentul proiect propune utilizarea concomitentă a viricidelor ribavirină şi oseltamivir, în vederea creşterii ratei de eliminare a virusurilor specifice viţei-de-vie şi cartofului, luate în studiu. Efectul fitotoxic indus de prezenţa chimioterapicelor a fost cuantificat prin ratele de multiplicare pe variantele experimentale precum şi prin monitorizarea concentraţiilor unor elemente minerale şi compuşi biochimici ale explantelor cultivate pe mediu. Atât la viţa-de-vie cât şi la cartof, ratele de multiplicare au scăzut comparativ cu martorul, pe variantele experimentale şi, odată cu mărirea numărului de zile de tratament, fără a fi înregistrată mortalitatea inoculilor. În ceea ce priveşte concentraţia unor elemente minerale, azotul şi implicit proteina brută a crescut semnificativ la V1 comparativ cu martorul, la ambele specii. În mod similar au evoluat hidraţii de carbon la viţa-de-vie, în timp ce polifenolii totali au înregistrat valori mai scăzute comparativ cu martorul. Fiecare plantă de viţă-de-vie şi cartof, regenerată în urma tratamentelor cu viricide a fost testată prin ELISA în vederea stabilirii eficienţei metodei de devirozare. La viţa-de-vie s-a înregistrat eficienţă maximă în cazul eliminării virusului fleck în timp ce la GLRaV-1 a fost înregistrată cea mai mare rată (13,3%) la V2 după două subculturi, iar GFLV a fost eliminat în proporţie de 6,8% la V2 după prima subcultură de tratament. Infecţia complexă a fost eliminată în proporţie de 100% la GFkV şi doar de 9% la GVA, astfel că a fost obţinut un număr mic de plante libere de ambele virusuri. La cartof, chimioterapia a fost eficientă cu o eliminare de 89,8% în cazul PVX1, 91,7% la PVX2, 95,4% la PVY1 la varianta V3 (20mg/L ribavirină+80mg/L oseltamivir). Dimpotrivă, tratamentul cu chimioterapice nu a condus la regenerarea de plante libere de virus în cazul infecţiei cu PVY2. Pe baza rezultatelor obţinute de diverşi cercetători, a fost elaborat modelul experimental de aplicare a unei alte metode de devirozare care utilizează acţiunea curentului electric. Stimularea electrică a avut loc în cuva de electroforeză orizontală în tampon salin, cu curenţi de 40, 50, 100 mA, timp de 5, 10, 20 min. Materialul biologic a fost reprezentat atât la viţa-de-vie cât şi la cartof, de fragmente de lăstari erbacei proveniţi de la plante infectate cu virusuri. Curentul electric nu a produs efecte detrimentale asupra explantelor cultivate ulterior pe mediu, procesele de caulogeneză declanşându-se pe toate variantele experimentale. Culturile vor fi monitorizate, iar plantele regenerate vor fi testate serologic în vederea aprecierii eficienţei metodei. Descrierea ştiinţifică şi tehnică 1. Desfăşurarea experimentului de chimioterapie in vitro la viţa-de-vie şi cartof: cuantificarea unor compuşi biochimici - P1 Utilizarea chimioterapicelor în mediul de cultură in vitro în scopul regenerării de plante de viţă-de-vie libere de virusuri a pus numeroase întrebări, în legătură cu posibilul efect fitotoxic al acestora asupra explantelor cultivate pe mediu. Experimentele de eradicare a virusului
20
Embed
RAPORT ŞTIINŢIFIC ŞI TEHNIC ETAPA 2/2013 Obiectivul ...sanoplant.org.ro/docs/raport_faza_2.pdf · ... (N total x 6,25), ... Rossi JA (1965) - Colorimetry of total phenolics with
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
mare concentraţie de viricide (V1), pe parcursul a
trei subculturi consecutive, la genotipul Roclas
infectat cu câte două izolate ale PVX şi PVY
Fig. 1.6 Vitroplante de cartof, V1S3
(stânga) comparativ cu martorul
(dreapta), genotip Roclas infectat cu
PVX2
mare de viricide, carbonul şi sulful s-au menţinut la valori apropiate, în timp ce hidrogenul a
înregistrat variaţii proporţionale cu concentraţia chimioterapicelor (Fig. 1.7).
Fig.1.7 Concentraţia în elemente minerale la plantulele cultivate pe medii cu chimioterapice
aparţinând genotipului Fetească neagră 7Od, infectat cu GFLV, după două subculturi.
Valorile sunt medii, barele reprezintă deviaţiile standard, literele indică semnificaţiile
diferenţelor la P<0,05
Dozarea glucidelor solubile şi a amidonului (metoda cu antronă, Pánczél şi Eifert, 1960)
din plantulele de viţă-de-vie supuse chimioterapiei a pus în evidenţă o variaţie direct
proporţională a concentraţiilor acestor compuşi biochimici, cu concentraţia viricidelor utilizate în
mediul de cultură, la subcultura a doua şi a treia. Comparativ cu martorul, valorile acestor
compuşi au crescut pe variantele experimentale.
Patogenii induc un răspuns defensiv în plantele gazdă care le protejează împotriva
aceluiaşi sau altui agent infecţios. Răspunsul la infecţie este distribuit sistemic în plantă şi
produce o rezistenţă sistemică dobândită. Inducerea căilor fenilpropanoidelor pare să constituie
un rol important în răspunsul de rezistenţă. Activarea acestora produce acumularea metaboliţilor
fenolici care ar putea avea activitate antivirală (Kassemayer şi colab., 1997). Dozarea
polifenolilor totali (Singleton şi Rossi1965) şi a celor flavonoizi (Zhishen şi colab. 1999) a
condus indirect la aprecieri asupra polifenolilor neflavonoizi (stilbeni, resveratrol), care ar fi
responsabili cu rezistenţa la atacul agenţilor patogeni. Acest lucru nu se confirmă în cazul
experimentului de chimioterapie, concentraţia în polifenoli totali fiind mai mică pe variantele
experimentale, comparativ cu martorul, după 2-3 subculturi de tratament. În ceea ce priveşte
conţinutul în proteină brută acesta a crescut datorită creşterii conţinutului în azot (N total x 6,25),
în mod paradoxal, pe variantele cu chimioterapice, comparativ cu martorul netratat (Tabelul 1.1)
Bibliografie
Pánczél, M., Eifert, J., 1960 - Die Bestimung des Zuckerund Stärkegehaltes der Weinrebe
mittels Anthronreagens. Mitt. Klosterneuburg 10:102–110. Singleton VL, Rossi JA (1965) - Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-
phosphotungstic acid reagents. Am J Enol Vitic 16 (3):144-158. Zhishen J, Mengcheng T, Jianming W (1999) - Research on antioxidant activity of flavonoids
from natural materials. Food Chem 64:555-559.
Tabelul 1.1
Concentraţia unor compuşi biochimici, sub influenţa chimioterapicelor după două respectiv trei
subculturi de tratament, la genotipul Fetească neagră 7Od infectat iniţial cu GFLV
Subcultura Varianta Glucide
solubile
% s.u.
Amidon
% s.u.
Polifenoli
totali
g acid galic/
100 g s.u.
Flavonoide
totale
g catechina/
100 g s.u.
Proteina
bruta
%
S 2 V1 8,8 3,6 2,6 0,7 42,2
V2 5,6 2,4 5,4 2,3 34,4
V3 5,3 1,9 5,6 2,4 32,8
Martor 4,7 2,0 6,2 2,7 30,8
S 3 V1 5,6 3,1 9,1 2,7 33,7
V2 5,8 2,5 8,9 2,7 36,2
V3 3,5 3,0 11,2 2,9 29,8
Martor 4,1 3,0 11,6 2,7 29,8
2. Evaluarea acţiunii chimioterapicelor asupra dezvoltării plantulelor de cartof pe parcursul
subculturilor prin cuantificarea unor compuşi biochimici - P2
Nutriţia minerală a plantelor este un proces fiziologic de aprovizionare a plantelor cu
substanţe nutritive. Plantele verzi absorb în mod predominant substanţele minerale, din care, prin
asimilaţie clorofiliană, sunt sintetizate substanţele organice.
Elementele chimice, din nutriţia plantelor cu substanţe anorganice sau cu substanţe
organice, devin elemente de constituţie ale unor substanţe care participă la structura
protoplasmei şi a pereţilor celulari. De asemenea, aceste elemente intră şi în structura chimică a
unor substanţe energetice, dintre care cele mai importante sunt hidraţii de carbon, grăsimile şi
proteinele, care, prin degradare aerobă sau anaerobă, furnizează energia necesară proceselor
vitale.
Azotul este un element plastic. Este unul dintre elementele fundamentale ale vieţii
plantelor. Necesarul de azot al diferitelor specii de plante este variabil; astfel, sfecla de zahăr,
cartoful, cânepa, varza, tomatele, cerealele necesită mari cantităţi de azot. Cât priveşte sulful, el
intră în constituţia chimică a unor aminoacizi, a unor enzime şi a unor coenzime.
Analiza elementelor în plantulele de cartof tratate cu chimioterapicele ribavirină şi
oseltamivir a dorit să evalueze un posibil efect fitotoxic al viricidelor asupra dezvoltării
explantelor, în vederea stabilirii dozelor de tratament care să permită supravieţuirea culturilor,
coroborată implicit cu eliminarea infecţiei virale. Astfel, concentraţia cea mai mare în ribavirina
(V1) a condus la ambele izolate ale virusului X al cartofului, la scăderea conţinutului în azot
după prima subcultură, urmată de creşterea acestuia la subculturile doi şi trei, comparativ cu
martorul. În ceea ce priveşte concentraţia de sulf, valorile sunt în general mai mici comparativ
cu martorul la ambele suşe virale (Tabelul 2.1).
Comparaţii ale concentraţiilor în proteina brută, la plantulele infectate cu cele două
izolate ale virusului X, supuse acţiunii chimioterapicelor, au evidenţiat valori descrescătoare
odată cu scăderea concentraţiei viricidelor, dar mai mari comparativ cu martorul, la subcultura a
doua (Fig. 2.1).
Tabelul 2.1
Concentraţia în elemente minerale în plantulele de cartof pe parcursul a două subculturi,
sub influenţa celei mai mari concentraţii de chimioterapice, la genotipul Roclas infectat artificial
cu două izolate ale PVX
Virus Element Varianta Subcultura1 Subcultura 2 Subcultura 3
PVX 1
N % V1 8,26 11,08 11,42
M 9,22 9,04 10,19
C % V1 36,65 32,97 33,07
M 34,90 35,03 33,80
S % V1 0,61 0,97 0,58
M 0,72 0,67 0,81
H % V1 5,23 4,82 4,98
M 5,02 4,533 5,18
PVX 2
N % V1 8,96 10,91 10,51
M 9,12 9,11 9,22
C % V1 35,42 32,60 33,98
M 32,12 34,36 34,26
S % V1 0,38 0,49 0,64
M 0,58 0,60 0,82
H % V1 4,95 5,14 5,26
M 5,16 4,87 5,04
După trei subculturi consecutive pe medii suplimentate cu chimioterapice, explantele
infectate cu PVX s-au comportat prin creşterea conţinutului în proteină brută la V1 comparativ
cu martorul, în timp ce la explantele infectate cu PVY a scăzut concentraţia în proteină (Fig. 2.2).
Fig. 2.1 Influenţa viricidelor asupra
conţinutului în proteină brută la explantele
de cartof infectate cu PVX1 şi PVX2 după
două subculturi
Fig. 2.2 Influenţa viricidelor asupra
conţinutului în proteină brută
la explantele de cartof infectate cu PVX
şi PVY după trei subculturi de tratament
3. Actualizarea cercetărilor privind eradicarea virusurilor specifice viţei-de-vie şi cartofului
prin electroterapie -CO
Tehnicile tradiţionale de însănătoşire la plante au eşuat în producerea unor cantităţi
suficiente de material sănătos la cele mai multe specii. Deşi din punct de vedere teoretic
fenomenul nu este bine cunoscut, tratamentele care utilizează curentul electric ar putea deveni un
mod de a rezolva această problemă. Electroterapia poate fi explicată ca o termoterapie la nivel
celular, cu temperatură controlată, la care are loc inactivarea nucleoproteinei virale. Probabil
inactivarea preferenţială a particulelor are loc în timpul transportului lor prin spaţiul apoplastic şi
nu în timpul şederii lor în interiorul celulei. De asemenea, pulsurile electrice au fost folosite
pentru stimularea organogenezei și creșterii.
Black (1971) a demonstrat relaţia între stimularea creşterii la plantele de tomate tratate cu
curent electric de joasă densitate (3-15 µA/plantă) timp de 4, 5, 24 ore. Blanchard (1974)
aplicând pulsuri de 1-4 A DC, la 6500 V/oră, după 2-3 zile a observat absenţa microflorei în
ţesuturile tratate. Aceste rezultate stau la baza conceptului de electroterapie. Efectele curentului
electric a fost studiat la butaşi de portaltoi de viţă-de-vie lungi de 30 cm plasaţi orizontal şi
traversaţi de un curent de 30, 60 V, timp de 3, 6, 9 ore. A fost studiată rata de înrădăcinare,
numărul şi greutatea rădăcinilor în funcţie de tratamente. La un curent de 30 V toţi parametrii au
crescut cu creşterea duratei de tratament, în timp ce la 60 V au scăzut când timpul a depăşit 3
ore. Tratamentul cu 60 V - 3 ore a prezentat cea mai mare rată de înrădăcinare (122%) şi număr
de rădăcini (100%) comparativ cu martorul. Aceste rezultate indică posibilitatea îmbunătăţirii
propagării la portaltoii care prezintă dificultăţi de înrădăcinare (Köse, 2007).
Electroterapia a fost aplicată pentru eradicarea PVX din diferite clone infectate (Lozoya–
Saldana și colab., 1996). Utilizând un aparat de electroterapie realizat în Cuba (Patent Cuba
37/95 AO IC/08 1524/97), Hernández şi colab.,1995 au tratat usturoiul (Allium sativum L),
trestia de zahăr (Sacharum sp. hibrido L), cartoful (Solanum tuberosum L) şi araceas
(Xanthosomas şi Colocasia) pentru eliminarea Potyvirusurilor, Carlavirusurilor şi
Luteovirusurilor. În cazul bananului (Musa sp., soiul Bungulan), Hernández şi colab., 1997 au
raportat eliminarea BSV la aproximativ 40-80% din plantele regenerate.
Butaşi de viţă-de-vie proveniţi de la plante infectate cu GFLV au fost supuşi la 34 V/cm
timp de 3 ore. De asemenea, plantele au fost supuse la 1 V/cm şi au fost prelevate probe de
frunze după 1, 5,10, 20, 30, 40, 50, 60 de zile. Evaluarea ELISA a arătat că valorile citirilor
obţinute din probe de plante mamă infectate supuse la 1 V/cm descresc cu creşterea timpului de
tratament, numai până la 60 de zile de aplicare a câmpului electric după care s-au stabilizat.
Totuşi, plantele regenerate din butaşii care au fost supuşi curentului electric au rămas pozitive
pentru GFLV (Burger, 1989).
În experimentele privind eliminarea GVA prin electroterapie, cele mai bune rezultate
(40% plante de viță-de-vie libere de virusuri), s-au obținut la 30 mA – 15 min (Bayati și colab.,
2011).
La noi în ţară a fost iniţiat un număr restrâns de cercetări privind utilizarea curentului
electric în obţinerea de plante libere de virusuri sau studii privind comportamentul plantelor în
câmp electric.
Câmpul electric aplicat plantelor de viță-de-vie infectate cu GLRaV-3 a condus la
obținerea unor rate mari de devirozare (57,1%-100%), fără corelații directe între perioada de
expunere și eficiența tratamentului (Guță și colab, 2008) .
Utilizarea electroterapiei cu curent electric alternativ, urmată de cultura in vitro a fost
investigată ca tehnică alternativă pentru eliminarea virusurilor la vița-de-vie cu infecții simple
sau mixte. Studiul a avut în vedere cele mai păgubitoare virusuri la vița-de-vie: GFLV, ArMV,
GLRaV-1, GLRaV-3, GFkV. Curent electric de 1000 și 10 000 kHz a fost aplicat la capetele
butașilor erbacei de viță-de-vie; mugurii axilari tratați au fost inoculați pe mediul de bază M&S
conținând regulatori de creștere. Analiza ELISA a plantelor regenerate și aclimatizate a prezentat
rezultate încurajatoare privind eliminarea virusurilor filamentoase GLRaV-1 și GLRaV-3 (12,5
% eliminare la 100 kHz și respectiv 4,5% la 10 000 kHz, după 10 min de tratament). Rezultatele
nu au fost reproductibile în cazul GLRaV-1 pentru eliminarea din plante cu infecțiile mixte. Nu
s-au obținut rezultate satisfăcătoare privind eliminarea virusurilor izodiametrice (GFLV, GFkV)
în infecții simple sau mixte (Guță și colab., 2011; Guță și Buciumeanu, 2012).
În literatura de specialitate din ultimele trei decenii există numeroase referiri la metode
inedite de devirozare a materialului biologic provenit din plante infectate prin utilizarea culturilor
in vitro a plantelor supuse unor tratamente electroterapice şi apoi multiplicate pe medii cu
diferite concentraţii de viricide. Astfel, în 1983, Klein şi Livingstone specificau că virusurile
cartofului PVX şi PVY au fost eliminate din microplante prin chimioterapie utilizând Ribavirin
sau Virazole (1-β-D-ribofurasonyl-1,2,4 triazone-3-carboxamide), dar timpul necesar pentru
regenerarea plantelor a fost mult mai lung decât la controalele netratate. Alţi cercetători
(Griffiths şi al. 1990) au remarcat o scădere a concentraţiei virusurilor X şi Y ale cartofului prin
aplicarea combinată a electroterapiei şi chimioterapiei la cartof. Ei au folosit doar ribavirina ca
viricid (concentraţii de 20mg/L, 40mg/L şi 60mg/L), iar pentru electroterapie au utilizat variante
în care intensitatea curentului era de maxim 80mA, iar durata maxima 15 minute. Danci şi colab.
(2012) au efectuat de asemenea cercetări prin care urmăreau creşterea gradului de devirozare la
microplantele de cartof prin chimioterapie şi electroterapie, rezultatele prezentate fiind
deocamdată preliminare. Lozoya-Saldana şi colab., în 1996 au remarcat o mărire substanţială a
gradului de devirozare a materialului inoculat cu virusul X al cartofului, efectul fiind benefic în
special în variantele care vizau intensităţi mari ale curentului (40 mA, respectiv 60 mA) şi la
durate mari ale tratamentelor (30 minute). Din păcate, procentul plantelor care au supravieţuit
acestor electroterapii a fost scăzut, ceea ce a condus la o scădere drastică a eficienţei
electroterapiei. Mahmoud şi colab. (2009) au efectuat cercetări pentru eliminarea virusului Y din
plantele de cartof aplicând chimioterapia, electroterapia şi termoterapia. Ca variante pentru
electroterapie, ei au folosit 5mA, 10mA şi 15 mA, iar duratele de tratament au fost 5, 10
respectiv 15 minute. Aplicând doar electroterapia, gradul de regenerare a fost de 53.8, 72.7 şi
87.5% pentru durata cea mai mare de tratament. Aplicate simultan, chimioterapia si
electroterapia eficienţa devirozării a fost mai mare, procentul plantelor identificate ca libere de
virus fiind 66.7% cu 5 mA, 90.0% cu 10 mA şi 100.0% la 15 mA.
Bibliografie
Bayati Sh., Shams-Bakhsh M., Moieni A., 2011 - Elimination of Grapevine Virus A (GVA) by
Cryotherapy and Electrotherapy. J. Agr. Sci. Tech. 13, 443-450.
Danci M., Danci O., Mike L., Baciu A., Olaru D., Petolescu C., Berbentea F., David I., 2012.-
Production of virus free potato plantlets, Journal of Horticulture, forestry and
Biotechnology 16(1), 232-238.
Griffiths H.M., Slack S.A, Dodds J.H., 1990 - Effect of chemical and heat therapy on virus
concentrations in in vitro potato plantlets. Canadian Journal Botanic, 68, 1515-1521.
Guţă I.C. și Buciumeanu E.C., 2012 - Chemotherapy and electrotherapy: environmental friendly
methods for virus elimination in grapevine. Paper and abstract proceedings - 14th
Serbian congress of fruit and grapevine producers with international participation,