Rakennusten mikrobikasvuston toteaminen

14.04.2023 1Uusien menetelmien kehittäminen mikrobikasvun tunnistamiseksi/ Valkonen

Uusien menetelmien validointi mikrobikasvun tunnistamiseksi

Kaisa Jalkanen,

Maria Valkonen, Martin Täubel, Asko Vepsäläinen, Matti Peltonen, Marjo Niittynen, Anne Hyvärinen

14.04.2023 Uusien menetelmien kehittäminen mikrobikasvun tunnistamiseksi/ Valkonen 2

Tausta ja tavoite

• Rakenteissa olevan mikrobikasvun ja epätavanomaisen mikrobilähteen tunnistamiseen käytetty perinteisesti viljelyä– Tulkintaohjeet Asumisterveysoppaassa

• Uusille, nopeille menetelmille on kasvava tarve terveysvalvonnan piirissä

• Tavoitteena testata uusia menetelmiä suhteessa viljelyyn– Mycometer– Kvantitatiivinen PCR (polymeraasiketjureaktio,

qPCR)


Menetelmät: Viljely

• Perinteinen, eniten kokemusta

• Raja-arvot/tulkintaohjeet olemassa eri näytetyypeille– Rakennusmateriaali, pintanäyte, ilmanäyte

• Havaitsee vain elinkykyiset, käytetyissä olosuhteissa kasvavat mikrobit– lämpö, ravinteet/kasvatusalusta, valo jne


Menetelmät: Viljely

• Hidas – Materiaalit ja pinnat: Sonikointi, ravistelu, maljoille viljely– Inkubointi päiviä – viikkoja (sädesienet 2 vkoa)

• Vaatii näytteen lukijalta ammattitaitoa– tunnistus visuaalinen

• Edulliset reagenssikustannuksetBotrysporium

Aspergillus versicolor / sydowii

Aspergillus penicilloides / restrictus


Menetelmät: Mycometer

• Mittaa sienissä olevaa NAHA-entsyymiä (β-N-acetylhexosaminidase)– Kaikki sienet sisältävät NAHAa

• Kertoo sienten kokonaispitoisuudesta (ei erottele lajistoa)

• Nopea, helppo, kenttäkäyttöinen

• Inkubointi ~ 1/2h + valmistelut


Menetelmät: Mycometer

• Ei pidempiaikaista kokemusta tai raja-arvoja– Menetelmän kehittäjän luoma asteikko A-C

• Eri sienissä eri määriä NAHA-entsyymiä

• Menetelmä on herkkä havaitsemaan homeen entsyymiaktiivisuutta– Ei havaitse hiivoja, bakteereja, aktinomykeettejä

• Virhelähteitä: mm. kasveissa ja niistä jalostetuissa elintarvikkeissa (esim. jauhot), eläimissä (mm. hyönteisten osat), veressä, ihossa, siitepölyssä NAHAa

Mycometer: Pintanäyte

• Otetaan 3x3 cm alalta

• Pumpulipuikolla sapluunan avulla

• Inkubointi (n. ½ h)

• Mittaus fluorometrillä

14.04.2023 Mycometer/Neuvottelupäivät 7

Mycometer: Materiaalinäyte

• Pieni pala rakennusmateriaalia (100-300 mg)– Punnittava

• Analyysi (inkubointi) kuten pintanäytteelle– Mittaus fluorometrillä

• Tuloksen tulkinta eroaa - eri asteikko!– Huom! Materiaalinäytteille kaksi eri tulkintataulukkoa, riippuen

siitä sisältääkö sementtiä vai ei


Mycometer

Luokka A

• ”puhdas”, ei homekasvua (tai likaa)

Luokka B

• Sienten biomassan määrä kohonnut

• Pinta likainen? Pölyä (jossa sieni-itiöitä)?

• Vanha vaurio?

Luokka C

• Voimakas biomassapitoisuus

14.04.2023 Esityksen nimi / Tekijä 9


Menetelmät: qPCR

• Voidaan mitata halutun DNA:n määrää näytteessä fluoresoivien merkkiaineiden avulla reaaliaikaisesti

• Mitä enemmän näytteessä tarkasteltavaa DNA:ta, sitä nopeammin se alkaa monistua

• Mittaa sitä, mitä etsitään – pitää tietää, mitä etsii– Ryhmä- tai lajispesifisiä sovelluksia


Menetelmät: qPCR

• Nopeahko (1-2 vrk, qPCR ajo vain 1-2h)– DNA-eristys

• Vaatii erilliset laboratoriotilat

• Työnä kevyehkö (automatisoitavissa), vaatii kuitenkin paljon validointityötä laboratoriolta

• Työntekijän altistumisen väheneminen


Aineisto

• Mycometerin ja viljelymenetemän vertailu– 227 rakennusmateriaalinäytettä– 115 pintanäytettä

• Joista 59 vaurio-vertailuparia

• qPCR:n ja viljelymenetelmän vertailu– 945 rakennusmateriaalinäytettä– 184 ilmanäytettä


Mycometer vs. viljely

• Menetelmät mittaavat eri asiaa – Elinkyky vs. NAHA-entsyymin aktiivisuus

• Verrattiin menetelmiä käyttämällä viljelyn vaurioluokituksen raja-arvoja – Rakennusmateriaalit 10 000 pmy/g – Pintanäytteet 1 000 pmy/cm2

• Viljely Asumisterveysoppaan (2009) mukaan


Mycometer vs. Viljely: Rakennusmateriaalit

N Mycometer katogoria A(sis. myös alle määritysrajojen

olevat näytteet)

Mycometer katogoria B

Mycometer katogoria C

Viljelytulos < 10 000 PMY/g

147 107 24 16

Viljelytulos > 10 000 PMY/g 80 22 30 28

Näytteiden sijoittuminen eri luokkiin, kun viljelytulos jaoteltu 10 000 pmy/g sienten maksimikokonaispitoisuuden mukaan:N=227


Mycometer vs. Viljely: Pintanäytteet

N Mycometer katogoria A (sis. myös alle määritysrajojen

olevat näytteet)

Mycometer katogoria B Mycometer katogoria C

Viljelytulos < 1 000 pmy/cm2

112 71 30 12

Viljelytulos > 1 000 pmy/cm2

3 0 0 3

Näytteiden sijoittuminen eri luokkiin, kun viljelytulos jaoteltu 1 000 pmy/cm2 sienten maksimikokonaispitoisuuden mukaan:N=115


Kokpit M2

Kokpit DG-18

THG Sädesienet Muut THG

Sienten max.

kokpit¤

Myco-meter

Kokpit M2 1

Kokpit DG-18 0.931*** 1

THG 0.649*** 0.626*** 1

Sädesienet 0.519*** 0.502*** 0.566*** 1

Muut THG 0.594*** 0.574*** 0.946*** 0.431*** 1

Max. Kokpit ¤ 0.969*** 0.984*** 0.638*** 0.501*** 0.586*** 1

Mycometer 0.455*** 0.397*** 0.361** 0.260* 0.310** 0.492*** 1

Korrelaatiot (Spearmanin korrelaatiokerroin)

PintanäytteetKok pit M2 Kokpit

DG-18THG Säde-

sienetMuut THG Sienten max.

Kokpit ¤Myco-meter

Kokpit M2 1 Kokpit DG-18 0.909*** 1

THG 0.689*** 0.659*** 1

Sädesienet 0.640*** 0.632*** 0.573*** 1

Muut THG 0.675*** 0.642*** 0.996*** 0.541*** 1

Max. Kokpit ¤ 0.960*** 0.966*** 0.711*** 0.648*** 0.694*** 1

Mycometer 0.590*** 0.625*** 0.599*** 0.470*** 0.590*** 0.652*** 1

***merkitsevä p-arvon tasolla <0.0001, **merkitsevä p-arvon tasolla <0.001, *merkitsevä p-arvon tasolla <0.01

¤ = se sienimalja (DG-18 tai M2), jolla kasvanut suurempi pitoisuus

Materiaalinäytteet


Mycometer vs. Viljely: PintanäytteetVaurio – vertailu -asetelma

Viljely Mycometer

N(yht. 59)

Vertailu(pmy/cm2)

Vaurioepäily(pmy/cm2)

N(yht. 59)

VertailuMycometer-

kategoria

VaurioepäilyMycometer-

kategoria

56 alle 1 000 alle 1 000 26 A A

3 alle 1 000 yli 1 000 21 A B

0 yli 1 000 yli 1 000 12 A C

0 B tai C A, B tai C

• 59 vaurio-vertailuparia– Samasta huoneesta samanlaiselta pinnalta vertailunäyte

• Viljelyllä lähes kaikki alle 1 000 pmy/cm2

• Mycometer: kaikissa näytteissä vaurio vertailu


Yhteenveto Mycometer-menetelmästä

• Mycometerillä analysoidut rakennusmateriaalit suhteessa viljelyyn: ”vääriä positiivisia” ja ”vääriä negatiivisia” – Näytteen epähomogeenisuus?

• Pintanäytteiden viljelyssä vaurioluokitusraja 1 000 pmy/cm2 korkea

• Pintanäytteiden vertailu-vaurio-asetelmassa Mycometer-menetelmä vaikuttaa erittäin lupaavalta– Erottelee paremmin vaurio- ja vertailupinnat kuin viljely


qPCR vs. viljely

• Mittaa eri asiaa; elinkyky vs. DNA (mahd. myös kuolleissa soluissa)– qPCR voi havaita myös kuolleet mikrobit

Aineisto

Tähän mennessä:

• 945 rakennusmateriaalinäytettä

• 184 ilmanäytettä• 72 kosteusvaurioituneista kohteista• 70 ei-vaurioituneista kohteista• 56 ulkoilmanäytettä


qPCR vs. viljely

• Viljeltiin Asumisterveysoppaan (2009) mukaan

• DNA eristetty tunnetusta määrästä viljelysuspensiota

• Analysoitu yhteensä 18 eri qPCR –sovellusta → keskitytty lupaaviin sovelluksiin

• Tavoitteena antaa raja-arvo(t)


Tulokset: qPCR vs. ViljelyIlmanäytteet

• Verrattiin vaurioituneita ja ei-vaurioituneita koteja:– Havaittiin kokonaissienipitoisuuksien

eroavan selkeämmin qPCR:n avulla mitattuna kuin viljelyllä

Sienipitoisuus - viljely

p=0.026*

Sienipitoisuus - qPCR

p=0.006 **

Sisäilma vaurio Sisäilma vertailu Ulkoilma Sisäilma vaurio Sisäilma vertailu Ulkoilma

Pen/Asp - qPCR

p<0.0001**

Sisäilma vaurio Sisäilma vertailu Ulkoilma


qPCR vs. viljelyRakennusmateriaalinäytteet

• Verrattiin menetelmiä käyttämällä viljelyn vaurioluokituksen raja-arvoja – Rakennusmateriaalit 10 000 pmy/g ja viljelytuloksen perusteella

määritettyä kolmiluokkaista aineistoa (pitoisuus ja lajisto)

• qPCR-analyysien optimaalisia raja-arvoja etsittiin suhteessa viljelyyn:– Sensitiivisyys ja spesifisyys molemmat mahdollisimman korkeita

tai ROC-käyrän AUC-arvo on mahdollisimman suuri

Sensitiivisyys: qPCR-menetelmällä positiiviseksi osoitettujen näytteiden osuus kaikista viljelyssä positiivisiksi osoittautuneista näytteistä

Spesifisyys: qPCR-menetelmällä negatiiviseksi osoitettujen näytteiden osuus kaikista viljelyssä negatiivisiksi osoittautuneista näytteistä



Kriteerejä:• Mahdollisimman suuret, yhtäaikaiset sensitiivisyyden ja

spesifisyyden arvot

• Receiver operating characteristic (ROC)-käyrät kaksiluokkaista viljelytulosta vastaan → käyrän AUC- (area under curve) arvon suurinta arvoa käytettiin yhtenä raja-arvojen valintakriteerinä

• Raja-arvot, jotka tuottivat korkean spesifisyyden yksittäiselle määritykselle (≥90%)

• Kumulatiivisten jakaumien tarkastelu



Tuloksia

• Yksittäisten qPCR-määritysten sensitiivisyys sai maksimissaan arvon 78 %, kun tarkastellaan 7 jatkotutkimuksiin valittua qPCR-määritystä

• Sensitiivisyyden tulee olla vähintään n. 90 % useamman määrityksen yhdistäminen välttämätöntä– Yhdistämällä 2 tai 3 qPCR-määritystä sensitiivisyys- ja

spesifisyysarvot paranivat verrattuna vain yhteen määritykseen

– Neljän määrityksen kombinaatio muutti tulosta enää hyvin vähän


qPCR rakennusmateriaalit - yhteenveto

• Yhdistämällä 2 tai 3 qPCR-määritystä sensitiivisyys- ja spesifisyysarvot paranivat

• Parhaaksi yhdistelmäksi havaittiin:Sienten yleisaluke (nk. ”unifungi”) + Penicillium/Aspergillus/Paecilomyces varioti-ryhmän aluke

• Streptomyces spp. –määritys tarpeen myös– Ei lisää spesifisyyttä/sensitiivisyyttä– Joskus tilanteita, joissa ei homekasvua mutta runsas

sädesienipitoisuus


Kiitos

MetropoliLab: Seija Kalso, Anu Bäckroos

Rovaniemen kaupungin terveysvalvonta: Sini-Sisko Kilpeläinen, Jaakko Leinonen

Kuopion kaupungin terveysvalvonta: Heikki Kallunki

Hengitysliitto: Tapio Rokkonen

Kuvat © Maria Valkonen, Katja Saarnio, Kaisa Jalkanen ja www.mycometer.com

Rakennusten mikrobikasvuston toteaminen

Technology