R - T - ANDRESSA CHEQUIN.pdf - Acervo Digital – UFPR

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

ANDRESSA CHEQUIN

CURITIBA

2018

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ANDRESSA CHEQUIN

CURITIBA

2018

Tese apresentada como requisito parcial à obtenção do grau de Doutor em Microbiologia, Parasitologia e Patologia, no Curso de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia, Setor de Ciências Biológicas, da Universidade Federal do Paraná.

Orientadora: Profa. Dra. Giseli KlassenCo-orientadora : Profa. Dra Edneia A. S. R. Cavalieri

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13

14

Dedico este trabalho especialmente à minha mãe, pois não tenho dúvida

nenhuma que só cheguei até aqui por causa do seu apoio incondicional.

Admiro muito a forma como ela se dedicou a suas filhas, especialmente a

educação. Esse trabalho e título que conquistei também são dela. Espero que

ela esteja orgulhosa, pois eu serei eternamente grata. Te amo, mãe.

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AGRADECIMENTOS

À minha orientadora Profa. Dra. Giseli Klassen e co-orientadora Profa.

Dra. Edneia A. R. S. Cavalieri, pela oportunidade que me deram por tanto

tempo no laboratório de Epigenética da UFPR. Agradeço a confiança que

sempre depositaram em meu trabalho, os ensinamentos, orientações e

amizade. Vocês fazem parte da minha formação profissional.

À CAPES e CNPq pela bolsa de Doutorado e pelo suporte financeiro.

Ao Curso de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia

da Universidade Federal do Paraná, pela oportunidade. Em especial ao técnico

Fábio Chimentão, por toda ajuda e por todas as conversas.

Aos professores Emanuel Souza, Miriam Jasuliones, Alexandra Acco,

Glaucio Valdameri, Erico Costa, Marcos Brown Gonçalves, Lucia de Noronha,

Mariana e Graciele Manica, pelo grande auxílio em experimentos complexos e

que tanto enriqueceram este trabalho.

Ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Paraná,

pelo apoio à utilização de seus laboratórios e equipamentos, em especial ao

Valter pela paciência e sugestões.

Aos colegas de laboratório: Lucas, Angie, Claudia, Felipe, Amani,

Graciele, Yara e Eliana por tornarem meus dias mais leves e divertidos. A

parceria e a amizade de vocês facilitaram meu trabalho e meus dias.

À minha família e ao meu namorado Adriano, que foram fundamentais

para que chegasse até aqui. O apoio incondicional de vocês me manteve forte

e confiante em meu trabalho.

16

RESUMO O câncer de mama e o diabetes são doenças com incidências crescentes em todo o mundo e compartilham entre si não só os fatores de risco mas também as vias de ativação molecular. Sabe-se que os análogos do GLP-1, fármacos utilizados no tratamento da diabetes mellitus tipo 2 (DM2) demonstraram inibição na proliferação celular em diferentes linhagens tumorais. A proposta deste trabalho foi avaliar os mecanismos moleculares da droga análoga de GLP-1, denominada liraglutida, e seus efeitos sobre o crescimento celular, migração, expressão gênica e metilação do DNA, utilizando linhagens tumorais de mama e um modelo tumoral de mama em camundongos. Os resultados mostraram que a liraglutida foi capaz de reduzir o crescimento, migração celular e formação de colônias em linhagens tumorais de mama, incluindo as linhagens mais agressivas, do tipo triplo negativas (TNG). Ao mesmo tempo, se observou o restabelecimento da expressão gênica por desmetilação da região promotora de genes como CDH1, ADAM33, ESR1 e PGR e o aumento na expressão proteica de E-caderina e ADAM33. O aumento na desmetilação, e consequente aumento na expressão genica, se deu a partir da inibição direta das enzimas DNMTs, reduzindo suas atividades e gerando uma desmetilação global do genoma nas linhagens tumorais. Os testes in vivo mostraram um papel terapêutico da liraglutida uma vez que foi capaz de diminuir significativamente o tamanho dos tumores de Ehrlich em camundongos, permitindo inclusive a redução do uso de quimioterapia sem a perda da eficácia do tratamento. A redução do volume tumoral ocorreu provavelmente pelo aumento na expressão do gene VEGF, que contribuiu para estimular necrose tumoral, e pela desmetilação dos genes CDH1 e ADAM33. Além disso, foi possível evidenciar a expressão da proteína ADAM33 nos tecidos tumorais. Esses resultados demonstraram pela primeira vez que a liraglutida é um potencial fármaco adjuvante na terapia do câncer de mama, incluindo o do tipo TNG, implicado em alterações epigenéticas em células de câncer de mama. Palavras-chave: Câncer de mama, diabetes, análogos de GLP-1, liraglutida, epigenética, DNMT.

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ABSTRACT

Breast cancer and diabetes are diseases with increasing incidence worldwide and shared risk factors and molecular pathways. In view of this, the GLP-1 analogs are very attractive drugs in the treatment of type 2 diabetes mellitus (DM2) that demonstrate cellular proliferation inhibition in different tumor lines. The aim of this work was study the analog GLP-1 liraglutide molecular mechanisms, through the cell growth, migration, gene expression and DNA methylation, in breast tumors cell lines and a breast tumor in mice. The results showed that liraglutide was able to reduce growth, colony formation and cell migration in breast cancer cell lines, including the most aggressive, the triple-negative type (TNBC). In parallel, was observed of re-establishment of gene expression by demethylation of the promoter region of genes such as CDH1, ADAM33, ESR1 and PGR and increase in protein E-cadherin and ADAM33. The increase in demethylation, and consequent increase in the genetic expression, was originated from the direct DNMTs inhibition, generating global DNA demethylation in breast cell lines. In vivo analysis was showed a therapeutic role for liraglutide that has been able to decrease the Ehrlich tumors size in mice, even allowing the chemotherapy reduction, without loss of treatment efficacy. Tumor volume reduction occurred probably by increasing VEGF gene expression, which contributed to tumor necrosis, and by the demethylation of CDH1 and ADAM33 genes. In addition, it was possible to evidence an expression of the ADAM33 protein. The results demonstrated that liraglutide is a potential adjuvant drug in breast cancer therapy, including TNBC, implicated in epigenetic changes in breast cancer cells. Key-words: breast cancer, diabetes, GLP-1 analogs, liraglutide, epigenetic, DNMT.

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LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1- ASPECTOS MOLECULARES CARACTERÍSTICOS DOS

CÂNCERES.........................................................................................

16

FIGURA 2- DISTRIBUIÇÃO PROPORCIONAL DOS DEZ TIPOS DE CÂNCER

MAIS INCIDENTES ESTIMADOS EM MULHERES PARA 2018,

EXCETO PELE NÃO MELANOMA......................................................

17

FIGURA 3- ESTRUTUTRA QUÍMICA DO LIRAGLUTIDA COMPARADA AO

GLP-1...................................................................................................

24

FIGURA 4- PROCESSO DE METILAÇÃO DO DNA.............................................. 30

FIGURA 5- ESTRUTURA DAS DIFERENTES PROTEÍNAS DNA

METILTRANSFERASES DE HUMANOS............................................

34

FIGURA 6- PROCESSOS DE DESMETILAÇÃO ATIVA DO DNA......................... 37

FIGURA 7- EFEITOS DA LIRAGLUTIDA SOBRE O CRESCIMENTO DE

LINHAGENS TUMORAIS DE MAMA..................................................

53

FIGURA 8- EFEITOS DA LIRAGLUTIDA SOBRE A MIGRAÇÃO DE

LINHAGENS TUMORAIS DE MAMA..................................................

55

FIGURA 9- ENSAIOS DE LIRAGLUTIDA EM COMBINAÇÃO COM

QUIMIOTERÁPICOS...........................................................................

59

FIGURA 10- EXPRESSÃO GÊNICA QUANTITATIVA DAS LINHAGENS

TUMORAIS DE MAMA EXPOSTAS AOS TRATAMENTOS COM

LIRAGLUTIDA.....................................................................................

61

FIGURA 11- EFEITOS DA LIRAGLUTIDA SOBRE A METILAÇÃO E A

EXPRESSÃO DE E-CADERINA..........................................................

63

FIGURA 12- EFEITOS DA LIRAGLUTIDA SOBRE A METILAÇÃO E A

EXPRESSÃO DE ADAM33.................................................................

64

FIGURA 13- EFEITOS DA LIRAGLUTIDA SOBRE A METILAÇÃO GLOBAL DO

GENOMA DAS LINHAGENS TUMORAIS DE MAMA.........................

66

FIGURA 14- EFEITOS DA LIRAGLUTIDA SOBRE A EXPRESSÃO GÊNICA E

PROTEICA DAS ENZIMAS DNMTs....................................................

67

FIGURA 15- EFEITOS DA LIRAGLUTIDA SOBRE A ATIVIDADE E INIBIÇÃO

DAS ENZIMAS DNMTs.......................................................................

69

FIGURA 16- EFEITO DA LIRAGLUTIDA NO TAMANHO DE TUMORES DE

19

EHRLICH............................................................................................. 70

FIGURA 17- EFEITOS SISTÊMICOS DA LIRAGLUTIDA EM

CAMUNDONGOS................................................................................

72

FIGURA 18- ANÁLISES HISTOLÓGICAS DOS TUMORES DE EHRLICH

CONTROLES OU TRATADOS COM LIRAGLUTIDA..........................

73

FIGURA 19- EFEITO DA LIRAGLUTIDA SOBRE A EXPRESSÃO DE GENES

ASSOCIADOS À MORTE CELULAR NOS TUMORES DE

EHRLICH.............................................................................................

74

FIGURA 20- EFEITO DA LIRAGLUTIDA SOBRE A METILAÇÃO DA REGIÃO

PROMOTORA DO GENE CDH1 NOS TUMORES DE EHRLICH......

75

FIGURA 21- EFEITO DA LIRAGLUTIDA SOBRE A METILAÇÃO E EXPRESSÃO

DE ADAM33 NOS TUMORES DE EHRLICH......................................

76

FIGURA 22- EFEITOS DA LIRAGLUTIDA SOBRE A METILAÇÃO GLOBAL DO

GENOMA DOS TUMORES DE EHRLICH..........................................

77

20

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 – AGONISTAS DO RECEPTOR GLP-1 DISPONÍVEIS NO

MERCADO................................................................................

23

TABELA 2 – LISTA DE INICIADORES UTILIZADOS NAS REAÇÕES DE

PCR EM TEMPO REAL............................................................

44

TABELA 3 – LISTA DE INICIADORES UTILIZADOS NAS REAÇÕES DE

MSP-PCR DAS LINHAGENS CELULARES TUMORAIS DE

MAMA........................................................................................

46

TABELA 4 – LISTA DE INICIADORES UTILIZADOS NAS REAÇÕES DE

MSP-qPCR DO GENE CDH1 E AMPLIFICAÇÃO DO

PROMOTOR DE ADAM33 EM TUMORES DE

EHRLICH...................................................................................

46

21

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 12

2 REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................................ 15

2.1 CÂNCER ................................................................................................. 15

2.1.1 Câncer de mama .............................................................................. 16

2.1.2 Câncer de mama e Diabetes ............................................................ 20

2.2 METÁSTASES ........................................................................................ 25

2.2.1 Transição Epitélio-Mesênquima (TEM) ............................................. 26

2.2.1.1 E-caderina ..................................................................................... 27

2.2.1.2 ADAM33 ........................................................................................ 28

2.3 EPIGENÉTICA ........................................................................................ 29

2.3.1 Metilação do DNA ............................................................................. 30

2.3.1.1 A família das proteínas DNA metil transferases (DNMTs) e a família

das proteínas de translocação 10-11 (TETs) ............................................. 32

2.3.2 Modificações pós traducionais de histonas .......................................... 37

2.3.3 RNAs não codificantes (ncRNA) ....................................................... 38

3 OBJETIVOS .................................................................................................. 40

3.1 OBJETIVOS GERAIS ............................................................................. 40

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................... 40

4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 41

4.1 CULTIVO CELULAR E TRATAMENTOS ................................................ 41

4.2 EXTRAÇÕES DE DNA E RNA................................................................ 41

4.3 TRATAMENTO DO DNA COM BISSULFITO DE SÓDIO ....................... 42

4.4 ENSAIOS DE COLÔNIA E CURVA DE CRESCIMENTO CELULAR ..... 42

4.5 ENSAIOS DE MIGRAÇÃO CELULAR – WOUND HEALING .................. 43

4.6 ENSAIOS EM COMBINAÇÃO A QUIMIOTERAPIA ................................ 43

4.7 QUANTIFICAÇÃO GÊNICA .................................................................... 44

22

4.8 ANÁLISES DE METILAÇÃO DO DNA .................................................... 45

4.9 AVALIAÇÃO DE EXPRESSÃO PROTEICA ........................................... 47

4.10 ANÁLISES DE ATIVIDADE/INIBIÇÃO DE DNMTs E DE METILAÇÃO

GLOBAL DO GENOMA ................................................................................ 48

4.11 ESTUDOS EM ANIMAIS ....................................................................... 49

4.12 HISTOLOGIA E IMUNOHISTOQUIMICA DOS TUMORES .................. 51

4.13 ANÁLISES ESTATÍSTICAS .................................................................. 51

5 RESULTADOS.............................................................................................. 52

5.1 O LIRAGLUTIDA É CAPAZ DE REDUZIR O CRESCIMENTO E A

MIGRAÇÃO EM LINHAGENS TUMORAIS DE MAMA. ................................ 52

5.2 LIRAGLUTIDA DIMINUI O CRESCIMENTO CELULAR DE LINHAGENS

CELULARES DE MAMA SUBMETIDAS À QUIMIOTERAPIA. ..................... 57

5.3 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA ANTES E APÓS TRATAMENTO

COM LIRAGLUTIDA ..................................................................................... 60

5.4 ALTERAÇÕES GERADAS POR LIRAGLUTIDA NA METILAÇÃO DO

DNA E NA EXPRESSÃO PROTEICA. .......................................................... 62

5.5 EFEITOS DE LIRAGLUTIDA SOB AS ENZIMAS DNMTs. ..................... 66

5.6 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE LIRAGLUTIDA EM MODELOS DE

TUMOR DE EHRLICH EM CAMUNDONGOS. ............................................. 69

5.7 ATIVIDADE DE LIRAGLUTIDA COMO UM POTENCIAL AGENTE

DESMETILANTE IN VIVO. ........................................................................... 74

6 DISCUSSÃO ................................................................................................. 78

7 CONCLUSÕES ............................................................................................. 92

8 REFERENCIAL ............................................................... 93

12

1 INTRODUÇÃO O câncer de mama é o tipo de câncer mais comum entre as mulheres

e encontra-se entre as principais causas de morte no mundo (SIEGEL;

MILLER; JEMAL, 2018; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2018). Embora

seja frequentemente referido como uma doença única, o câncer de mama pode

ser dividido em vários subtipos, um fator importante que pode afetar o

prognóstico e as opções de tratamento das pacientes. Cerca de 15% dos

cânceres de mama são do tipo triplo negativo (TNG), um subtipo específico

definido pela falta de expressão de receptor de estrógeno (RE), do receptor de

progesterona (PR) e pela falta na superexpressão do receptor do fator do

crescimento epidérmico do tipo 2 (HER2) (SORLIE et al., 2003; BLOWS et al.,

2010; BIANCHINI et al., 2016). Este subtipo do câncer de mama revela uma

falta de alvos terapêuticos e uma maior frequência de metástases (KASSAM et

al., 2009; TSENG et al., 2013), o que o torna um desafio do ponto de vista

clínico (DERYUGINA; QUIGLEY, 2006; ALFAROUK et al., 2015). Por

apresentarem um pior prognóstico, este subtipo apresenta o maior desafio com

intensa busca pela identificação de novos tratamentos (BIANCHINI et al., 2016)

e nesse contexto, as abordagens epigenéticas se tornaram uma importante

ferramenta a ser estudada (COSTA, 2010; HAMM; COSTA, 2011, 2015;

LUSTBERG; RAMASWAMY, 2011; CONNOLLY; STEARNS, 2012;

CONNOLLY et al., 2017).

Embora não haja causas específicas para o câncer de mama

esporádico, muitos fatores de risco já foram descritos na literatura (GALVÃO et

al., 2011) e, alguns deles, especialmente idade e obesidade, também estão

associados com o surgimento do diabetes mellitus tipo 2 (DM2) (BRONSVELD

et al., 2015). Isso demonstra que existe uma grande relação entre estas duas

doenças, inclusive porque as mulheres com diabetes apresentam um risco

estimado de 15% a 20% maiores de desenvolver câncer de mama (STARUP-

LINDE et al., 2013; BRONSVELD et al., 2017), com tendência ao subtipo TNG

(WOLF et al., 2006; GILLESPIE et al., 2010; BRONSVELD et al., 2017). A

razão da associação entre essas duas doenças ainda é controversa, mas se

acredita que possa ser devido à glicemia elevada em pacientes com diabetes,

13

hiperinsulinemia e até pelos fatores de risco compartilhados (BRONSVELD et

al., 2015, 2017).

Os análogos do GLP-1 (GLP-1A) são fármacos muito atrativos no

tratamento do DM2 (VERSPOHL, 2009; TASYUREK et al., 2014; MADSBAD,

2016) e possuem diferentes classes disponíveis no mercado (TRUJILLO;

NUFFER; ELLIS, 2015). Estudos recentes mostraram que tratamentos com o

GLP-1A exenatida (Byetta®, AstraZeneca) levaram à inibição da proliferação

celular e diminuição do risco de câncer de próstata, mama e pâncreas

(LIGUMSKY et al., 2012; ZHAO et al., 2014; LI et al., 2017b). O uso de

fármacos já estabelecidos no mercado e no tratamento de outras patologias,

diferentes das quais foram inicialmente propostos, é uma abordagem

conhecida como substituição ou reaproveitamento de droga (OPREA;

BAUMAN; BOLOGA, 2011). Esta abordagem vem sendo cada vez mais

testada em neoplasias malignas, em virtude dos mecanismos moleculares de

algumas patologias apresentarem semelhanças entre as vias utilizadas pelas

células tumorais no desenvolvimento do câncer (GUPTA et al., 2013; WURTH

et al., 2016). Assim, a hipótese de uso de GLP-1A como drogas anti-tumorais,

ou na prevenção do câncer de mama é uma ideia nova e atraente.

Recentemente, drogas epigenéticas, tais como os inibidores das

enzimas que catalisam a metilação do DNA (iDNMTs), mostraram resultados

antineoplásicos bastantes promissores para vários tipos de tumores (BROWN;

PLUMB, 2004; SABA, 2007; PAN et al., 2017; PRZYBILLA et al., 2017),

incluindo tumores de mama (LI et al., 2017a). O exenatida, o GLP-1A descrito

como inibidor de crescimento de câncer de mama, também foi descrito como

um composto capaz de inativar a atividade das DNMTs (YASUDA et al., 2016).

Esta inativação torna-se atrativa, uma vez que os níveis de DNMTs são

frequentemente aumentados em várias linhagens tumorais e em diferentes

tipos de câncer (SUBRAMANIAM et al., 2014). No entanto, a necessidade de

aplicar o exenatida duas vezes ao dia pela via subcutânea pode ser uma

ressalva para esse tipo de tratamento. Nesse sentido, a exenatida já foi

substituída por outros análogos com maior estabilidade, tais como a liraglutida

(Victoza®, Novo Nordisk) (GUPTA, 2013).

Diante disso, neste estudo, foi avaliado o potencial epigenético do

GLP-1A liraglutida, buscando seus efeitos sobre: o crescimento celular,

14

expressão gênica e proteica, perfil de metilação e sobre as enzimas DNMTs,

tanto linhagens tumorais de mama como em modelo de câncer de mama em

camundongos. Estudos sobre os efeitos epigenéticos da liraglutida podem se

tornar uma ferramenta importante para o tratamento do câncer de mama,

incluindo os do tipo triplos negativos e outras malignidades.

15

2 REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 CÂNCER

Câncer é o nome geral dado a um grupo de mais de 100 doenças, que

têm em comum o crescimento anormal de células, com potencial para invadir

localmente e espalhar-se para outras partes do corpo. Este crescimento celular

desordenado pode ser bastante agressivo quando detectado em estágio

avançado, levando, comumente, o paciente a óbito. O câncer pode surgir em

qualquer parte corpo e afetar diferentes órgãos com diferentes intensidades

(INCA, 2018).

Diferentes fatores podem contribuir para o desenvolvimento de um

câncer, entre eles fatores internos, como hormônios e o mau funcionamento no

metabolismo de nutrientes intracelulares, ou fatores externos, tais como o

tabaco, produtos químicos tóxicos e a excessiva exposição à luz solar. Esta

exposição aos fatores internos e externos geram danos cumulativos no

genoma e no epigenoma dos indivíduos, que acabam por conduzir a

transformação de uma célula normal a tumoral (AMERICAN CANCER

SOCIETY, 2016). Alterações moleculares muito dinâmicas governam a

transformação das células normais em tumorais, sendo que dez características

são comuns: autossuficiência em sinais de proliferação celular, insensibilidade

aos sinais antiproliferativos, evasão a apoptose, potencial replicativo ilimitado,

angiogênese sustentada, invasão tecidual e metástase, instabilidade genômica,

promoção de inflamação, desregulação energética metabólica e evasão a

destruição imunológica (FIGURA 1) (HANAHAN; WEINBERG, 2011).

Segundo a Organização Mundial de Saúde, a estimativa é de que

aproximadamente 18 milhões de novos casos de câncer e mais de 9 milhões

de óbitos devem ocorrer em 2018 no mundo, e que até o ano de 2040 estes

números cheguem a quase 30 milhões de novos casos anuais (WORLD

HEALTH ORGANIZATION, 2018). Nos Estados Unidos, para o ano de 2018,

são estimados 1.735.350 casos de câncer entre homens e mulheres, o que

representa mais de 4.700 novos casos por dia (SIEGEL; MILLER; JEMAL,

2018). Já no Brasil, as estimativas do biênio de 2018/2019, apontam a

16

ocorrência de aproximadamente 600 mil novos casos de câncer para cada ano,

reforçando a magnitude do problema no país (INCA, 2018).

FIGURA 1 – ASPECTOS MOLECULARES CARACTERÍSTICOS DOS CÂNCERES

FONTE: Adaptado de HANAHAN e WEINBERG (2011).

2.1.1 Câncer de mama

O câncer de mama é o tipo de câncer que mais acomete as mulheres em

todo o mundo, tanto nos países em desenvolvimento quanto nos

desenvolvidos. Segundo a Organização Mundial da Saúde, globalmente no ano

de 2018, são esperados aproximadamente 2 milhões de novos casos de

câncer de mama e 626.679 óbitos (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2018).

Nos Estados Unidos foram estimados 266.120 novos casos de câncer de

mama entre as mulheres americanas para 2018, sendo que destas, 40.920

(15,4%) poderão ir a óbito em consequência desta neoplasia (SIEGEL;

MILLER; JEMAL, 2018). As estatísticas brasileiras estimam que no ano de

2018, aproximadamente 59.700 mulheres sejam acometidas por câncer de

mama e destas, aproximadamente 24% venham a morrer da doença em até

cinco anos após o diagnóstico (FIGURA 2) (INCA, 2018).

17

FIGURA 2 – DISTRIBUIÇÃO PROPORCIONAL DOS DEZ TIPOS DE CÂNCER MAIS INCIDENTES ESTIMADOS EM MULHERES PARA 2018, EXCETO PELE NÃO MELANOMA.

Estimativa feminina dos dez tipos de câncer mais incidentes na população brasileira, desconsiderando os tipos de câncer de pele não melanoma, prevista para os anos de 2018 e 2019. FONTE: adaptado de INCA (2018).

O câncer de mama é um tumor maligno que se desenvolve na mama

como consequência das alterações genéticas e epigenéticas em algum

conjunto de células dos ductos ou lóbulos mamários (POLYAK, 2007).

Aproximadamente 80% dos cânceres de mama acometem o epitélio ductal,

enquanto a minoria se origina do epitélio lobular (INCA, 2018). Este tipo de

câncer possui alta capacidade de invasão local e de gerar metástases

(AMERICAN CANCER SOCIETY, 2016). Existem alguns fatores de risco que

podem conferir maior susceptibilidade ao desenvolvimento desta neoplasia,

como fatores genéticos, ambientais, comportamentais e reprodutivos (GALVÃO

et al., 2011). A idade pode ser considerada também um dos mais importantes

fatores de risco, pois as taxas de incidência de câncer de mama aumentam

drasticamente em mulheres acima de 50 anos (INCA, 2018). Outro importante

fator de risco é a exposição da mulher ao longo de sua vida aos hormônios, tais

como o estrógeno e a progesterona, que acabam por aumentar o risco de

desenvolvimento de câncer de mama.

O estrógeno e a progesterona exercem suas ações no tecido mamário ao

se ligarem aos seus receptores situados no núcleo das células, conhecidos

como receptor de estrógeno (RE) e receptor de progesterona (RP),

respectivamente. Esta ligação controla a multiplicação celular nas glândulas

18

mamárias para atender às exigências da vida sexual e reprodutiva

(ZARDAVAS et al., 2015; MAKKI et al., 2016; YEUNG et al., 2016).

O receptor de estrógeno é predominantemente nuclear, mas também

pode ser encontrado em menores proporções na membrana plasmática e no

citoplasma (PRESS et al., 1987; RAZANDI et al., 1999). Já foram descritos até

o momento dois tipos de receptores de estrógeno: o receptor de estrógeno α

(REα), e o receptor de estrógeno β (REβ), codificados pelos genes ESR1 e

ESR2 respectivamente. Os receptores RE-α e β possuem estruturas

conservadas e mecanismos de ativação semelhantes (THOMAS;

GUSTAFSSON, 2011). O receptor de progesterona, também encontrado

predominantemente no núcleo celular, é codificado pelo gene PGR e possui

duas isoformas principais: a isoforma A, capaz de inibir o gene de ativação dos

receptores estrogênicos, e a isoforma B, capaz de ativa-lo (LESLIE et al.,

2005). Sabe-se que tanto o gene ESR1 como o PGR são regulados por

metilação do DNA (OTTAVIANO et al., 1994; LAPIDUS et al., 1996;

CHAMPAGNE; CURLEY, 2009) e, portanto, quando hipermetilados, estão

associados a uma falta de expressão proteica (OTTAVIANO et al., 1994;

LAPIDUS et al., 1996; REN et al., 2007).

Outro gene também importante é o receptor de crescimento epidérmico

humano do tipo 2, também conhecido como HER2. Esta proteína tem um papel

importante no crescimento e no desenvolvimento de uma vasta categoria de

células (GUTIERREZ; SCHIFF, 2011; DRAKAKI; HURVITZ, 2015). Apesar de o

RE, RP e HER2 apresentarem um papel fisiológico essencial no

desenvolvimento feminino, podem acarretar na proliferação celular exacerbada,

contribuindo no desenvolvimento de tumores mamários (ONITILO et al., 2009;

LEE; MULLER, 2010; JAVED; LTEIF, 2013).

No início do século passado, todos os pacientes diagnosticados com

câncer de mama recebiam um mesmo tipo de tratamento e apresentavam

respostas variáveis. Diante destas observações, foi possível compreender que

há um grupo de neoplasias com propriedades clínicas, histopatológicas e

moleculares variáveis, o que levava as diferentes respostas ao tratamento

(ELIYATKIN et al., 2015). Logo, se evidenciou a necessidade de uma

classificação dos diferentes tipos de câncer de mama (ELIYATKIN et al., 2015),

19

o que permitiria determinar diferentes estratégias terapêuticas (BLOWS et al.,

2010).

Atualmente, a classificação do câncer de mama é feita a partir de dados

clínico patológicos dos tumores, tais como tamanho, grau de diferenciação e

número de linfonodos comprometidos; assim como a identificação de

marcadores imunohistoquímicos clássicos, tais como o RE, RP e HER2

(KINSELLA et al., 2012; KOS; DABBS, 2016). Importantes pesquisadores da

área analisaram mais de 8 mil genes e identificaram inicialmente quatro

subtipos moleculares de câncer de mama: sendo o luminal A, o luminal B, o

subtipo com superexpressão de HER2 e o basalóide, que se diferenciam entre

si de acordo com os padrões de genes expressos (PEROU et al., 2000;

SORLIE et al., 2001; DAI et al., 2015, 2016).

Classificam-se como luminais A os tumores positivos para os receptores

de estrógeno (RE) e progesterona (RP), e negativos para amplificação e/ou a

superexpressão de HER2 (PEROU et al., 2000; SORLIE et al., 2001). Em

comparação aos demais subtipos, apresentam o melhor prognóstico, onde

tratamentos com antiestrogênicos, tais como o tamoxifeno e os inibidores de

aromatases constituem terapias alvo-específicas utilizadas com bastante

sucesso em seu tratamento sistêmico (WEIGEL; DOWSETT, 2010).

Já os tumores do subtipo luminal B, apresentam uma expressão positiva

de receptores hormonais (RE e RP) e de HER2. Também apresentam uma

maior expressão de genes relacionados à proliferação celular, como MIKI67,

CCNB1, MYBL2 e, portanto, estão associados a um pior prognóstico em

relação aos tumores luminais A (SORLIE et al., 2001, 2003). Diante disso, o

subtipo luminal B apresenta uma maior possibilidade de resistência ao

medicamento tamoxifeno, se beneficiando mais dos tratamentos

quimioterápicos associados aos antiestrogênicos (KENNECKE et al., 2010).

O subtipo superexpressão de HER2, como o próprio nome diz, apresenta

uma alta expressão da proteína HER2, e ausência na expressão dos

receptores hormonais RE e RP (SORLIE et al., 2001, 2003). Em relação aos

demais subgrupos, esse apresenta o segundo pior prognóstico para as

pacientes, porém, possui uma boa resposta às terapias alvo-específicas contra

HER2 utilizando o trastuzumabe e também às terapias de associação com o

quimioterápico paclitaxel (RAKHA; REIS-FILHO; ELLIS, 2010).

20

Os tumores mamários conhecidos como triplo negativos (TNG) são

caracterizados pela negatividade tanto na expressão de receptores hormonais

RE e RP, quanto para a superexpressão de HER2, sendo que os tumores do

tipo basalóides representam de 60% a 90% dos casos de câncer de mama

triplo negativo (FAN et al., 2006). Os tumores basalóides são classificados pela

não expressão das proteínas acima citadas e, também, pela expressão de

vários genes associados a células basais/mioepiteliais, como as citoqueratinas

5 e/ou 6 e o EGFR (BHARGAVA et al., 2008; CHEANG et al., 2008; IRVIN;

CAREY, 2008). Diante deste perfil de expressão gênica, os pacientes com este

subtipo de câncer de mama não se beneficiam do uso de terapias hormonais,

ou dos inibidores de aromatases, e nem do uso de trastuzumabe. Logo,

possuem o pior prognóstico dentre todos os subtipos apresentados, associados

a menor sobrevida livre da doença e global (CHEANG et al., 2008; BIANCHINI

et al., 2016).

2.1.2 Câncer de mama e Diabetes

Mesmo ainda não conhecendo as causas precisas do câncer de mama,

muitos fatores de risco já são descritos na literatura, como fatores genéticos,

ambientais, comportamentais e reprodutivos (GALVÃO et al., 2011). Outro fator

de risco muito importante é a obesidade, sendo uma das principais razões do

aumento na incidência de câncer de mama na população mundial nas últimas

décadas (WOLF et al., 2005). Alguns destes fatores de risco associados ao

câncer de mama, principalmente a idade e a obesidade, também estão

associados ao aparecimento de outras doenças graves, como o diabetes

mellitus (BRONSVELD et al., 2015).

O diabetes mellitus consiste em um grupo de doenças metabólicas

caracterizadas pela hiperglicemia, ou seja, elevados níveis de glicose no

sangue durante um longo intervalo de tempo. O diabetes pode ser classificado

em dois tipos principais de doença: diabetes do tipo 1, que acomete de 5 a

10% dos pacientes, e é um estado de absoluta deficiência na produção de

insulina, causada por um destruição autoimune de células pancreáticas; e o

diabetes do tipo 2, que acomete cerca de 90% dos casos de diabetes, e é

causada por uma resistência à insulina, onde as células do corpo não

21

respondem mais à este hormônio de forma apropriada (AMERICAN DIABETES

ASSOCIATION (ADA), 2017).

Muitos estudos têm demonstrado que o diabetes e/ou o tratamento com

a insulina realizado por estes pacientes aumentam o risco no desenvolvimento

do câncer de mama (LARSSON; MANTZOROS; WOLK, 2007; KARLSTAD et

al., 2013; BRONSVELD et al., 2015, 2017) ou afetam o prognóstico do paciente

(ERICKSON et al., 2011; LUO et al., 2014). Mulheres com diabetes têm um

risco de 15% a 20% mais elevado de desenvolverem câncer de mama do que

mulheres que não possuem diabetes (STARUP-LINDE et al., 2013;

BRONSVELD et al., 2017). Além disso, a mortalidade geral após o diagnóstico

de câncer de mama em mulheres diabéticas mostrou ser 30-60% maior em

comparação com mulheres sem esta doença (CLEVELAND; NORTH;

GAMMON, 2013; LUO et al., 2014; BRONSVELD et al., 2017). O motivo pelo

qual ocorre a associação entre essas duas doenças ainda é bastante

controverso, mas se acredita que possam existir relação graças aos elevados

níveis de glicose no sangue de pacientes com diabetes, hiperinsulinemia e

fatores de risco compartilhados como a obesidade e idade (BRONSVELD et al.,

2015, 2017). Porém, pouco se sabe sobre as bases moleculares desta relação,

e como esses possíveis fatores de risco para o desenvolvimento da diabetes

podem interferir nas alterações genéticas e epigenéticas que acarretam no

desenvolvimento de um câncer (WU et al., 2018). Entre os poucos caminhos

moleculares já desvendados na relação entre estas duas doenças, se mostrou

que a progressão tumoral em pacientes diabéticos pode ocorrer através da via

do receptor de crescimento celular semelhante à insulina (BRONSVELD et al.,

2017). Outro estudo mais recente mostrou que altos níveis de glicose podem

afetar o perfil de metilação de diferentes células e acarretar no

desenvolvimento tumoral (WU et al., 2018). Este estudo demonstrou que os

altos níveis de glicose no sangue, ocasionados pelo diabetes, impedem a

fosforilação da enzima TET2 pela proteína AMP-atividade kinase (AMPK). A

enzima TET2 é uma das responsáveis pelo processo de desmetilação do DNA

(mais detalhes no tópico 2.3.1.1) e, quando não fosforilada, contribui para a

desregulação do perfil de metilação celular, bem como para o

desencadeamento de tumores. Este mesmo estudo também mostrou que

tratamentos com o antidiabético metformina contribuem para fosforilação de

22

TET2, permitindo a manutenção da desmetilação em determinados locais (WU

et al., 2018).

O tratamento realizado em pessoas com diabetes segue, primeiramente,

a linha de modificação no estilo de vida e perda de peso, porém, algumas

classes de medicamentos estão disponíveis no mercado e podem ser utilizadas

juntamente como a terapia. Os agonistas do receptor GLP-1 (RGLP-1) são

medicamentos bastante atrativos no tratamento da diabetes mellitus do tipo 2 e

seu uso tem crescido muito nas últimas décadas (MADSBAD, 2016).

O hormônio peptídeo semelhante ao glucagon 1 (GLP-1), é uma

incretina produzida a partir do gene pro-glucagon das células do intestino

delgado em resposta a ingestão de nutrientes. O GLP-1 liga-se a um receptor

específico, o receptor de GLP-1 (RGLP-1), localizado em vários tecidos

humanos, incluindo células pancreáticas, células do trato gastrointestinal,

diversas regiões do cérebro, coração, nas artérias e arteríolas dos rins e

pulmões, e pele (GOKE et al., 1995; HANSEN; VILSBOLL; KNOP, 2010; PYKE

et al., 2014). Algumas evidências têm sugerido que, em diferentes tecidos do

corpo, além do pâncreas, o GLP-1 pode exercer suas funções não somente

pela sua interação com seu clássico receptor RGLP-1, mas a partir do uso de

vias alternativas (CANTINI; MANNUCCI; LUCONI, 2016). Quando ligado ao

seu receptor o GLP-1 exerce sua principal função, que é o aumento na

secreção de insulina e a diminuição na secreção de glucagon pelas células

pancreáticas (DRUCKER et al., 1987; HOLST, 2007). Outras funções deste

hormônio incluem a sensação de saciedade, inibição da motilidade

gastrointestinal, proteção do miocárdio, redução da pressão arterial, diminuição

da ansiedade e depressão entre outros (NIKOLAIDIS et al., 2004; SONNE;

ENGSTRØM; TREIMAN, 2008; HANSEN; VILSBOLL; KNOP, 2010;

ANDERBERG et al., 2016). A ligação de GLP-1 ao seu receptor causa a

ativação da proteína adenilato ciclase, o que resulta na formação de cAMP.

Assim, com altos níveis intracelulares de cAMP, ativam-se proteínas quinases

A (PKA) e fatores de troca de nucleotídeo de guanina regulados por cAMP

(cAMP-GEFII, também conhecido como Epac2). A partir da produção destas

duas proteínas, PKA e cAMP-GEFII, inicia-se a ativação de múltiplas vias

moleculares dentro da célula, que acabam por levar aos diferentes resultados

funcionais causados por GLP-1(HOLST, 2007).

23

Diante disto, os agonistas de RGLP-1 tornaram-se importantes

ferramentas no tratamento do diabetes, existindo diferentes classes disponíveis

no mercado que diferem entre si na forma molecular, farmacocinética, dose,

forma de administração, forma de armazenamento e eficácia (TABELA 1). Esta

classe de agonistas é bastante heterogênea e complexa, não podendo assumir

que possuem um único efeito de classe, mas sim que cada agente pode ter

uma ação diferenciada (TRUJILLO; NUFFER; ELLIS, 2015).

TABELA 1 – AGONISTAS DO RECEPTOR GLP-1 DISPONÍVEIS NO MERCADO.

Droga Nome comercial Frequência da dose

Exenatide Byetta® Duas vezes ao dia

Liraglutida Victoza® Diariamente

Exenatide Bydureon® Semanalmente

Lixisenatide Lyxumia® Diariamente

Albiglutide Tanzeum® ou Eperzam® Semanalmente

Dulaglutide Trulicity® Semanalmente

Fonte: Adaptado de Trujillo et al (2015)

A primeira medicação da classe dos agonistas de RGLP-1 para uso

humano foi a exenatide (Byetta®), sintetizada a partir da molécula exendina-4,

extraída da saliva do monstro de Gila (Heloderma suspectum) (ENG et al.,

1992). Essa droga possui 53% de analogia com o GLP-1 humano, sendo

rapidamente absorvida após a administração subcutânea. Atinge a

concentração máxima em cerca de duas horas e possui meia-vida de

aproximadamente meia hora na circulação, o que exige pelo menos duas

aplicações diárias em pacientes com diabetes mellitus do tipo 2 (HANSEN;

VILSBOLL; KNOP, 2010; TASYUREK et al., 2014). A partir da necessidade de

muitas aplicações diárias, novos agonistas começaram a aparecer no mercado,

como a liraglutida (Victoza®). A liraglutida foi obtida a partir de duas alterações

moleculares: a adição de um espaçador ácido alfa-glutâmico acoplado a um

grupo de ácido graxo C16; e a substituição do aminoácido lisina na posição 34

por uma arginina (FIGURA 3) (NAUCK, 2016). Estas alterações permitem uma

24

aproximação da proteína albumina, o que dificulta a degradação pela enzima

DPP4 (RUSSELL-JONES, 2009). Consequentemente, a liraglutida tem lenta

excreção renal (TASYUREK et al., 2014), possuindo tempo de meia-vida de 11

a 13 horas, sendo assim recomendado apenas uma aplicação diária nos

pacientes com diabetes mellitus do tipo 2 (NOVO NORDISK

PHARMACEUTICALS PTY LIMITED, ; RUSSELL-JONES, 2009; DRUCKER;

DRITSELIS; KIRKPATRICK, 2010a; TASYUREK et al., 2014).

FIGURA 3 – ESTRUTUTRA QUÍMICA DO LIRAGLUTIDA COMPARADA AO GLP-1

Estrutura química do hormônio GLP-1 comparada a liraglutida. Estas duas moléculas

apresentam 97% de homologia, e as diferenças encontram-se na adição de um ácido graxo de

16 carbonos (representado com uma linha preta) e a troca do aminoácido lisina por uma

arginina na posição 34 (representados pelo azul escuro). Estas alterações permitem a

aproximação da proteína albumina (representada em laranja), o que dificulta degradação pela

enzima DPP-4 (representado por uma seta vermelha). FONTE: Adaptado de Nauck (2016).

Assim como o GLP-1, a exenatide e a liraglutida também se ligam ao

RGLP-1 e levam a produção de cAMP, ativando por fim as mesmas vias

ativadas pelo hormônio (RUSSELL-JONES, 2009; DRUCKER; DRITSELIS;

KIRKPATRICK, 2010b; HANSEN; VILSBOLL; KNOP, 2010). Um dos efeitos

causados pela ativação de cAMP é a proliferação celular, característica tal que

começou a chamar atenção de pesquisadores sobre quais seriam as reais

consequências do uso de agonistas de RGLP-1 para o organismo, e se

poderiam ter alguma atividade carcinogênica. Ao contrário do que se temia,

diversos trabalhos não conseguiram comprovar os indícios de que os agonistas

de RGLP-1 pudessem gerar uma atividade inflamatória ou carcinogênica

25

(DRUCKER; NAUCK, 2006; DRUCKER et al., 2011; NAUCK; FRIEDRICH,

2013; LAMONT; ANDRIKOPOULOS, 2014). Entre os estudos realizados, se

mostrou mais especificamente que o uso de análogos de GLP-1 não estão

associados com um aumento no risco de gerar câncer de mama (HICKS et al.,

2016). Além de nenhum estudo ter conseguido comprovar a relação entre

análogos de GLP-1 e a carcinogênese, outros têm demonstrado justamente

uma ação oposta destas moléculas, como atividades pró-apoptóticas

seletivamente para células tumorais de mama (LIGUMSKY et al., 2012; FIDAN-

YAYLAL et al., 2016). Esta nova visão que os análogos de GLP-1 estão

trazendo podem dar um novo rumo aos estudos do diabetes mellitus associado

ao câncer de mama.

2.2 METÁSTASES

Metástase é a formação de uma nova lesão tumoral a partir de uma já

existente, porém, sem a continuidade entre as duas. Isto implica na capacidade

das células neoplásicas se desprenderem do tumor primário, invadirem tecidos

adjacentes, trafegarem pela corrente sanguínea ou linfática e, caso obtenham

sucesso, a capacidade de fundar novas massas tumorais, conhecidas como

metástases (HA; FARAJI; HUNTER, 2013). Para que o processo metastático

ocorra, as células neoplásicas precisam acumular certas características

(DERYUGINA; QUIGLEY, 2006), dentre as quais se encontram a perda ou a

diminuição da expressão de genes que promovem a adesão entre células

adjacentes ou entre células e a matriz extracelular (HANAHAN; WEINBERG,

2011).

A distribuição de células tumorais pelo organismo não é um processo

aleatório, onde a quimioatração entre moléculas expressas pelo tumor e por

moléculas expressas em diferentes locais do corpo, se torna um evento

importante no desencadeamento das metástases. No câncer de mama os

órgãos mais atingidos por células tumorais metastáticas são os linfonodos,

ossos, pulmões, fígado e cérebro (SUN et al., 2010). As células metastáticas normalmente se apresentam resistentes à

quimioterapia. A resistência se dá ao fato de que estas células podem ser

26

quiescentes, onde a proliferação e a apoptose estão em equilíbrio, ficando, por

tanto, fora do alvo da quimioterapia convencional (HOLMGREN; O’REILLY;

FOLKMAN, 1995; LIU, 2009; ALFAROUK et al., 2015). Um mecanismo que

poderia regular o estado de dormência tumoral seria a interação entre a célula

tumoral e o microambiente (BARKAN; GREEN; CHAMBERS, 2010;

TALUKDAR et al., 2016). O microambiente tumoral tem um papel crítico como

regulador na progressão do tumor. O seu contato direto com as células

tumorais atua como uma fonte crítica de fatores de crescimento, motilidade,

fatores angiogênicos entre outros que afetam significantemente a sua biologia

(BISSELL et al., 2002).

2.2.1 Transição Epitélio-Mesênquima (TEM)

Em tecidos epiteliais normais, as células formam camadas celulares

polarizadas e justapostas que estão intimamente ligadas por estruturas

especializadas de membrana. Esta adesão celular é fundamental para

formação de uma barreira permeável, com função de auxiliar na homeostasia

do organismo e delimitar os tecidos e órgãos. As células epiteliais, além de

aderidas umas as outras, também estão presas à membrana basal, uma

estrutura que as separa de células mesenquimais (tecido conjuntivo)

(RADISKY, 2005; THIERY et al., 2009; HUANG et al., 2012).

A conversão de células epiteliais em mesenquimais é um processo

conhecido como transição epitélio-mesênquima (TEM), na qual mudanças

moleculares e fenotípicas ocorrem nas células epiteliais, tornando-as

mesenquimais. Este processo se caracteriza pela perda de adesão célula-

célula e da polaridade celular, resistência a apoptose e aquisição de

propriedades migratórias e invasivas (YANG; WEINBERG, 2008; KALLURI;

WEINBERG, 2009; THIERY et al., 2009; SERRANO-GOMEZ; MAZIVEYI;

ALAHARI, 2016).

A ideia de que células epiteliais podem suprimir suas características

epiteliais e adquirir características mesenquimais foi descrita primeiramente

nos anos 80, por Elizabeth Hay, que descreveu este processo em estágios

iniciais de embriões de galinha (LAMOUILLE; XU; DERYNCK, 2014).

Fisiologicamente, o processo de TEM desempenha papel fundamental na

27

formação do plano corporal e na diferenciação de tecidos de múltiplos

organismos (KALLURI; WEINBERG, 2009; THIERY et al., 2009). No câncer,

este fenômeno tem sido descrito como crucial na formação de metástases em

cânceres epiteliais, incluindo o câncer de mama (WU; SARKISSYAN;

VADGAMA, 2016). Para que ocorram as metástases, as células tumorais

precisam inicialmente invadir tecidos vizinhos, processo possível graças à

aquisição de características mesenquimais geradas pela TEM. Posteriormente,

estas células alcançam um capilar e transitam até um local secundário, onde

voltam ao seu estado epitelial, denominando então o processo inverso à TEM,

conhecido como transição mesênquima-epitélio (TME). O termo “transição”

presente tanto na TEM quanto na TME, enfatizam a natureza reversível e

transitória destes processos (REYMOND; D’ÁGUA; RIDLEY, 2013).

Durante os processos de TEM e TME, as mudanças celulares são

mediadas por proteínas marcadoras, que caracterizam classicamente as fases

epitelial, intermediárias e mesenquimal. Porém, estudos mostram que, durante

estes processos, é possível encontrar também uma heterogeneidade celular,

com proteínas e características classicamente epiteliais e classicamente

mesenquimais coexistindo em um grupo celular (CARDENAS et al., 2014). A

TEM é tipicamente caracterizada pela perda de proteínas de adesão celular,

como E-caderina e citoqueratinas, e pelo ganho da expressão de moléculas

mesenquimais, como a vimentina e a fibronectina (WU; SARKISSYAN;

VADGAMA, 2016).

2.2.1.1 E-caderina

A proteína E-caderina, também chamada de CDH1, pertence à família

das caderinas, importantes moléculas de adesão celular dependentes de

cálcio. As caderinas desempenham papel essencial nos processos biológicos,

como a ordenação de tecidos, migração e diferenciação celular (VAN ROY;

BERX, 2008). A diminuição na expressão ou na função de E-caderina têm sido

detectadas em vários tipos de câncer e relacionadas com características

patológicas, tais como anaplasia, crescimento infiltrativo, metástase linfonodal

e diminuição da sobrevida do paciente. Outro ponto bastante importante

relacionado a perda na expressão de E-caderina é o aumento na resistência de

28

células tumorais a agentes quimioterápicos (HISCOX et al., 2006; YANG et al.,

2006). As perdas na expressão de E-caderina em tumores humanos, incluindo

os tumores mamários, podem ser causadas por diversos mecanismos

genéticos e epigenéticos (CAVALLARO; CHRISTOFORI, 2004; DONG et al.,

2012; TAM; WEINBERG, 2013), como a hipermetilação gênica (LOMBAERTS

et al., 2006); a inibição direta de E-caderina ocasionada por fatores de

transcrição, como o Snail, Twist e ZEB2 (KANG; MASSAGUÉ, 2004;

VANDEWALLE et al., 2005); e, inclusive, por regulação a partir de miRNA,

como a família dos miR-200 (PARK et al., 2008).

Diante disto, a E-caderina é conhecida por suprimir a tumorigenicidade e

a disseminação de tumores através de seu papel na organização dos tecidos

(VAN ROY; BERX, 2008; VAN ROY, 2014) sendo sua baixa expressão

considerada como um passo chave no processo da TEM (LEE et al., 2008).

2.2.1.2 ADAM33

A proteína com domínio desintegrina e metaloproteinase 33, também

conhecida como ADAM33, é membro da grande família ADAM de proteínas

transmembranas do tipo I (SEALS; COURTNEIDGE, 2003). Possui uma

complexa organização envolvendo oito domínios diferentes, o que facilita sua

participação em muitos processos celulares (PRIMAKOFF; MYLES, 2000). A

proteína ADAM33 desempenha um papel crítico nas interações intercelulares e

célula-matriz, diferenciação da proliferação, sinalização e apoptose, bem como

nas respostas inflamatórias (WOLFSBERG et al., 1995a, 1995b).

Recentemente, a proteína ADAM33 foi sugerida com um novo gene

supressor de tumor (SENISKI et al., 2009), podendo inclusive ser utilizada

como um importante marcador molecular de carcinomas mamários (MANICA et

al., 2013). Baixos níveis de ADAM33 foram associados com uma diminuição na

sobrevida global e na sobrevida livre de metástase, o que mostra o importante

papel desta proteína na biologia do câncer de mama (MANICA et al., 2017).

Assim como diversos supressores de tumor, a ADAM33 mostrou ser regulada

por mecanismos epigenéticos, como a metilação do DNA (SENISKI et al.,

2009).

29

2.3 EPIGENÉTICA

Por muitos anos considerou-se que os genes eram os únicos

responsáveis pela transmissão de características de uma geração à outra.

Porém, esse conceito passou a ser encarado de uma nova forma em 1942,

quando Conrad Waddington, procurando explicar a herdabilidade de variações

não-genéticas, introduziu o termo epigenética. O termo epigenética originou-se

do prefixo grego epi, que significa “por cima”, representando uma forma de

herança que se sobrepõe à herança genética com base no DNA. O termo foi

aperfeiçoado e pode ser empregado para descrever todas as mudanças

reversíveis (FEINBERG; TYCKO, 2004) e herdáveis no genoma que não

alteram a sequência nucleotídica do DNA (NOWSHEEN et al., 2014). O

epigenoma, portanto, é dinâmico e varia de célula a célula dentro de um

mesmo organismo multicelular (SZYF, 2007).

São conhecidos atualmente três mecanismos epigenéticos, entre eles

estão a metilação do DNA, as modificações pós-traducionais das histonas e

RNAs não codificadores (ncRNAs) (JONES, 2012). Esses mecanismos podem

influenciar a atividade gênica nos níveis transcricional e pós-transcricional e/ou

no nível de tradução e modificações pós-traducionais, ou seja, estão

relacionados com a regulação da expressão gênica em eucariontes

(NOWSHEEN et al., 2012). Diante disso, os eventos epigenéticos estão

envolvidos na regulação de todos os processos biológicos do corpo, desde a

reorganização do genoma, embriogênese e gametogênese, diferenciação

celular, até a variabilidade e adaptabilidade de organismos (HALUSKOVA,

2010).

Eventos epigenéticos são cruciais para estabelecer a programação

correta da expressão gênica, desta maneira, uma perturbação em um destes

mecanismos pode levar a uma expressão ou silenciamento gênico

inapropriado, resultando no aparecimento de graves doenças, incluindo o

câncer (EGGER et al., 2004; FÜLLGRABE; KAVANAGH; JOSEPH, 2011).

Porém, a plasticidade destes mecanismos permite elucidar uma nova categoria

de tratamentos, onde a busca pela normalidade no perfil epigenético se torna

possível (BRAIT; SIDRANSKY, 2011).

30

2.3.1 Metilação do DNA

A metilação do DNA é a modificação epigenética mais bem

caracterizada entre as citadas, ocorrendo em quase todos os organismos vivos,

desde as leveduras até aos vertebrados (KLOSE; BIRD, 2006). A metilação do

DNA é um mecanismo epigenético relacionado com o silenciamento de genes,

sendo responsável por manter os padrões diferenciais de expressão gênica de

maneira específica para cada tecido e para cada estágio de desenvolvimento

(YOO; JONES, 2006). Entre os eucariontes, a metilação consiste em uma

modificação covalente do DNA, na qual um grupamento metil (CH3) é

transferido principalmente para o carbono 5 de uma citosina (BIRD, 1986),

dando origem a quinta base nitrogenada do genoma, conhecida como 5-metil-

citosina (5mC) (FIGURA 4) (WIDSCHWENDTER, 2007). Este processo ocorre

principalmente nas bases citosinas das sequências de dinucleotídeos

conhecidas como 5’ CpG 3’. O CpG é uma abreviação para citosina seguida de

uma guanina, separadas por uma ligação fosfodiester (p), a qual liga dois

nucleotídeos no DNA (BIRD, 1986). A metilação do DNA é catalisada pela ação

de uma família de enzimas que recebe o nome de DNA metiltransferase

(DNMT), as quais são capazes de transferir um grupamento metil da molécula

S-adenosil-metionina (SAM) molécula doadora universal de metil para a

citosina (mais detalhes no tópico 2.3.1.1) (NAKAO, 2001; BIRD, 2002).

FIGURA 4 – PROCESSO DE METILAÇÃO DO DNA.

O processo de metilação é caracterizado pela inserção do grupamento metil (CH3), oriundo da

molécula SAM, no carbono 5 da citosina. Este processo é catalisado pela enzima DNMT.

Fonte: adaptado de <http://www.hgu.mrc.ac.uk/people/r.meehan_researchb.html>, (acessado

em 08/10/2018).

31

Os dinucleotídeos CpG de genomas eucarióticos, podem aparecer

esparsos ou agrupados em regiões definidas como ilhas de CpG (CGIs) (BIRD,

2002). Logo, ilhas de CpG são definidas como regiões do genoma maiores do

que 200 pares de bases que contém pelo menos 50% de dinucleotídeos CpG

(GARDINER-GARDEN; FROMMER, 1987). A literatura mostra que a maioria

dos CpG distribuídos pelo genoma está metilada, auxiliando na formação da

heterocromatina, enquanto os CpG agrupados em ilhas apresentam-se

desmetilados (SUZUKI; BIRD, 2008).

Análises computacionais mostraram no genoma humano 27.537 ilhas de

CpG (CGI) (HORSTHEMKE, 2014) distribuídas de maneira não randômica, se

localizando preferencialmente na região promotora dos genes (NAKAO, 2001).

Aproximadamente 70% dos promotores de genes estão associados a uma CGI,

tornando este o tipo mais comum de promotor em vertebrados (SAXONOV;

BERG; BRUTLAG, 2006). Este fato indica um importante papel destas regiões

na regulação da expressão gênica e, de modo geral, a metilação nas CGIs está

associada ao silenciamento gênico, a partir da inibição da ligação dos fatores

de transcrição ao DNA ou por mudança na estrutura da cromatina (BIRD, 2002;

DEATON; BIRD, 2011).

Um perfil de metilação adequado é essencial para o desenvolvimento e

para o bom funcionamento celular e qualquer anormalidade neste processo

pode levar ao desencadeamento de várias doenças, incluindo o câncer (NIE et

al., 2014). Curiosamente, tanto os eventos de hipo quanto de hipermetilação

podem ser observados no câncer. Geralmente, uma diminuição global no

conteúdo de CpG metilado contribui para a instabilidade genômica e ativação

de oncogenes silenciados. Por outro lado, a hipermetilação de CGIs em

promotores de genes específicos têm se mostrado como um evento crítico em

muitas células cancerígenas (PAZ et al., 2003). Os exatos mecanismos

responsáveis por esta alteração no perfil epigenético de células tumorais ainda

não é bem compreendido, mas há sugestões de que pequenas mudanças na

metilação do DNA já sejam suficientes para desencadear carcinogênese

(LOPEZ et al., 2009). Estas mudanças nos padrões de metilação em tumores

também podem ser detectadas na circulação sanguínea de mulheres com

câncer de mama, tornando-as importantes candidatas na detecção precoce de

neoplasias mamárias (BROOKS; CAIRNS; ZELENIUCH-JACQUOTTE, 2009).

32

A busca pela reversão do perfil de metilação anormal a partir do uso de

inibidores de metilação do DNA têm se mostrado como uma importante terapia

contra o câncer (CHUANG et al., 2011). Um dos objetivos das terapias

epigenéticas é restaurar os padrões normais de metilação do DNA e impedir

que as células se tornem mais hipermetiladas, o que poderia levar a repressão

de genes cruciais para o funcionamento celular (YOO; JONES, 2006). Vários

inibidores da metilação do DNA são bem estudados, entre eles encontra-se o

composto análogo de citosinas 5-Aza-2’deoxicitidina (5azadC, comercialmente

conhecido por Dacogen®) (MOMPARLER, 2005).

O 5azadC é um agente desmetilante aprovado por muitas agências

reguladoras internacionais, incluindo a agência federal de controle de alimentos

e medicamentos dos Estados Unidos (FDA) e a Comissão Europeia (CE), para

o tratamento de malignidades hematológicas, e tornou-se padrão de

atendimento para pacientes com síndrome mielodisplásica (MDS)

(SILVERMAN, 2004; LEE et al., 2013). Mais recentemente, o uso do 5azadC

no tratamento de tumores sólidos também têm recebido um destaque (NIE et

al., 2014). Este composto é um análogo de citosina, capaz de se incorporar ao

DNA ao longo de sucessivos ciclos de replicação celular. Uma vez incorporado,

é capaz de se ligar covalentemente e de maneira irreversível a enzima DNMT1,

inativando-a. Essa ligação permanente, por sua vez, leva a uma rápida perda

passiva de metilação, tanto por inativação quanto por destruição de DNMT1

(CHRISTMAN, 2002; MOMPARLER, 2005). Seu efeito sobre a tumorigênese

está relacionado ao seu potencial de inibição da metilação, que acaba

acarretando na ativação da expressão de genes silenciados por hipermetilação

aberrante, tais como os supressores de tumor (NIE et al., 2014).

2.3.1.1 A família das proteínas DNA metil transferases (DNMTs) e a família das

proteínas de translocação 10-11 (TETs)

As proteínas da família DNA metiltransferases (DNMTs) são

consideradas escritoras do epigenoma por serem as enzimas responsáveis

pela realização da metilação do DNA (NAKAO, 2001; BIRD, 2002). São

altamente conservadas, possuindo uma sequência de aminoácidos bastante

similares entre si, e estão presentes em quase todos os seres vivos (LYKO,

33

2018). O genoma humano codifica informações para cinco membros diferentes

de DNMTs: DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3b e DNMT3L (JIN; LI;

ROBERTSON, 2011; REN et al., 2011; LYKO, 2018). Os membros DNMT1, 3A

e 3B representam as enzimas canônicas na adição do grupamento metil ao

DNA, enquanto os membros não canônicos DNMT2 e 3L não apresentam

atividade catalítica. Mesmo que estes dois últimos membros não apresentem

atividade catalítica, continuam possuindo uma sequência de aminoácidos

conservados em comparação aos demais, mostrando a importância evolutiva

deste grupo de proteínas (LYKO, 2018).

As enzimas DNMTs apresentam domínios regulatórios em suas

extremidades N-terminais e um domínio catalítico em suas extremidades C-

terminais, com exceção da DNMT2 que consiste exclusivamente em um

domínio catalítico (FIGURA 5) (CHEN; LI, 2004). A partir deste conjunto de

domínios estruturais que se organizam tridimensionalmente, é possível

encontrar uma bolsa catalítica nas enzimas DNMTs, espaço onde ocorrem os

processos enzimáticos. Nesta bolsa catalítica a enzima é capaz de extrair a

citosina não metilada da sua forma helicoidal e aproximá-la da molécula

doadora do grupamento metil, a SAM. Após a transferência do metil, tanto a

citosina metilada (5mC) como a molécula SAH, residual liberado da SAM sem o

grupamento metil, são liberadas do local catalítico. A enzima

subsequentemente se liga a outra molécula SAM para regenerar o local

catalítico (DHE-PAGANON; SYEDA; PARK, 2011). A partir disso, são capazes

de conferir o padrão de metilação do DNA durante a gametogênese,

embriogênese e no desenvolvimento de células somáticas (ROBERTSON,

2001).

34

FIGURA 5 – ESTRUTURA DAS DIFERENTES PROTEÍNAS DNA

METILTRANSFERASES DE HUMANOS

Estrutura das diferentes DNMTs expressas em humanos. A figura demonstra a quantidade de

aminoácidos formadores de cada subtipo, bem como os diferentes domínios (representados

em diferentes cores). Fonte: Adaptado de Lyko et al (2018) Em células de mamíferos, a DNMT1 é a mais abundante da família e

está envolvida na manutenção da metilação do DNA (MIREMADI et al., 2007).

Esta manutenção está relacionada à sua capacidade de reconhecer locais com

CpGs hemimetilados durante a replicação do DNA e, por comparação, passar o

padrão de metilação para nova fita sintetizada (HERMANN; GOYAL; JELTSCH,

2004). Portanto, a DNMT1 é bastante expressa durante a fase S da divisão

celular, momento em que ocorre a duplicação do DNA, sendo responsável por

manter as marcas de metilação necessárias após cada ciclo de replicação

(DETICH; RAMCHANDANI; SZYF, 2001). Esta proteína é composta por 1.616

resíduos de aminoácidos, destes, os primeiros três quartos são representados

pelos domínios regulatórios: domínio DNA metiltransferase associado à

proteína 1 (DMAP1), domínio sequência de segmentação por foco de

replicação (RFTS), domínio CXXC, e dois domínios de homologia bromo-

adjacente. O último e quarto domínio desta proteína corresponde à região C-

terminal, onde se encontra o domínio catalítico metiltransferase (FIGURA 5)

(DHE-PAGANON; SYEDA; PARK, 2011). As funções específicas de cada

domínio podem ser entendidas como: DMAP1, sendo importante para interação

de DNMT1 com outras proteínas repressoras transcricionais, como a histona

desacetilase (HDAC2) (ROUNTREE; BACHMAN; BAYLIN, 2000); o RFTS,

sendo necessário para encaminhar a DNMT1 à forquilha de replicação

(LEONHARDT et al., 1992); o CXXC, sendo responsável por identificar e se

35

ligar ao substrato de DNA desmetilado (SONG et al., 2011a); o domínio

metiltransferase, sendo responsável por transferir o grupamento metil para a

citosina; e, por fim, a função dos domínios conservados BAH que ainda

precisam ser melhor elucidadas (LYKO, 2018).

A DNMT2 representa o membro mais enigmático da família, a qual ainda

mostra-se com funções pouco descritas (LYKO, 2018). Apesar de não

apresentar uma atividade catalítica robusta, esta enzima foi classificada como

membro da família DNMT por apresentar uma sequência de aminoácidos

semelhante ao restante dos membros (OKANO; XIE; LI, 1998). Sua função

parece estar relacionada com a metilação de RNAs transportadores, o que

poderia conferir proteção contra clivagens em condições de estresse (KIANI et

al., 2013; JELTSCH et al., 2017).

As DNMT3, diferentemente das DNMT1, são proteínas capazes de

realizar a adição do grupamento metil no DNA previamente desmetilado, sendo

responsáveis assim, pelo processo conhecido como metilação de novo

(OKANO et al., 1999; HERMANN; GOWHER; JELTSCH, 2004). A subfamília

das DNMT3 é composta por três membros distintos: DNMT3A, DNMT3B e

DNMT3L (CHÉDIN, 2011). Os membros 3A e 3B apresentam atividade

catalítica in vivo (OKANO et al., 1999), enquanto o membro 3L se mostra um

importante cofator para a atividade catalítica de DNMT3A e 3B (BOURC’HIS et

al., 2001). Esta subfamília de proteínas apresenta dois domínios distintos das

DNMTs restantes, o domínio Pro-Trp-Trp-Pro (PWWP) e o domínio ATRX-

DNMT3-DNMT3L (ADD), que são importantes para interações com a

cromatina, como por exemplo, a ligação com histonas (FIGURA 5) (DU et al.,

2015).

Evidências têm demonstrado que DNMTs defeituosas estão envolvidas

na transformação e progressão tumoral, através de falhas epigenéticas

causadas por anormalidades nestas enzimas (ZHANG; XU, 2017). Os níveis de

DNMTs, especialmente DNMT3A, 3B e 3L, estão frequentemente aumentados

em vários tipos de câncer, incluindo o de mama (GIRAULT; LIDEREAU; BIE,

2003; ROLL et al., 2008), e em linhagens celulares tumorais (ROBERTSON et

al., 1999), o que poderia parcialmente explicar a hipermetilação e consequente

silenciamento de genes supressores de tumor (SUBRAMANIAM et al., 2014).

Da mesma maneira, baixos níveis de DNMTs já foram relacionados com a

36

redução da tumorigenicidade, por ocasionarem um aumento na expressão de

genes supressores de tumor (WEINMANN; OTTOW, 2005). Diante disto,

drogas conhecidas como inibidores de DNMTs (iDNMTs), têm mostrado uma

importante atividade anti-neoplásica e resultados bastante promissores em

diferentes tipos de tumores (BROWN; PLUMB, 2004; SABA, 2007; PAN et al.,

2017; PRZYBILLA et al., 2017), incluindo o câncer de mama (LI et al., 2017a).

É possível observar também em diferentes contextos biológicos, a perda

passiva da metilação do DNA ou até a desmetilação ativa. A desmetilação

passiva do DNA refere-se à perda de 5mC durante sucessivos ciclos de

replicação celular, ocorrendo na ausência ou no mau funcionamento da

maquinaria de metilação do DNA. Já a desmetilação ativa refere-se a um

processo enzimático mediado por diferentes enzimas, dentre as quais se

encontram, principalmente, a família translocações 10-11, também conhecidas

como TET, capazes de remover ou modificar o grupamento metil da 5mC (OOI;

BESTOR, 2008; ITO et al., 2010; WU; ZHANG, 2013). De uma maneira geral,

este processo ativo de desmetilação pode ocorrer a partir de uma modificação

química em dois locais distintos de 5mC: em seu grupamento amina ou metil

(FIGURA 6). O grupamento amina de 5mC pode ser desaminado por

AID/APOBEC (AID: desaminase induzida por ativação, APOBEC: complexo

enzimático de edição de mRNA de apolipoproteína B), resultando em uma

conversão de 5mC em timina (FIGURA 6 - VERDE). Já o grupamento metil de

5mC, pode ser modificado a partir da adição de um novo grupamento hidroxil,

processo mediado pelas enzimas da família TET, gerando como resultado um

5-hidroximetil-citosina (5hmC) (FIGURA 6 - VERMELHO) (MOORE; LE; FAN,

2013). A 5hmC também pode ser quimicamente modificada em dois locais

distintos: em seu grupamento amina ou em seu grupamento hidroximetil. O

complexo AID/APOBEC pode desaminar 5hmC e produzir 5-hidroximetil-uracila

(5hmU) (GUO et al., 2011), ou 5hmC pode continuar a ser oxidado pela ação

da TET, sendo convertido a 5-formil-citosina (5fC) e seguidamente em 5-

carboxi-citosina (5caC) (ITO et al., 2011). Eventualmente, os produtos gerados

por cada caminho, como a timina, 5hmU, 5fC e 5caC são reconhecidos,

clivados e substituídos por uma citosina, processo mediado por TDG e/ou

SMUG1, ambos componentes dos mecanismos de reparo de bases

nitrogenadas (FIGURA 6 - AZUL) (MOORE; LE; FAN, 2013).

37

FIGURA 6 – PROCESSOS DE DESMETILAÇÃO ATIVA DO DNA

Descrição do processo ativo de desmetilação do DNA. Em verde estão representados os

passos realizados pelas enzimas AID/APOBEC, responsáveis por desaminar 5mC ou 5hmC.

Em vermelho estão representados os passos realizados pela família das enzimas TET,

responsáveis por oxidar 5mC, 5hmC, 5fC e 5caC. Em azul estão representados os passos

realizados pelas enzimas TDG e/ou SMUG1, capazes de reconhecer os produtos gerados

pelas outras etapas e substituí-los por citosinas. Fonte: Moore et al (2013)

2.3.2 Modificações pós traducionais de histonas

O DNA eucariótico é organizado e estruturado na forma de cromatina,

um complexo que envolve diferentes proteínas e algumas moléculas de RNA. A

unidade estrutural deste complexo é o nucleossomo, que se constitui de

aproximadamente 147 nucleotídeos arranjados em volta de um octâmero de

proteínas histonas (MCGHEE; FELSENFELD, 1980). Existem quatro grupos de

histonas, a H2A, H2B, H3 e a H4, que possuem caudas N terminais que se

estendem para fora dos nucleossomos. Estas caudas são passíveis de sofrer

diversos tipos de modificações pós-traducionais, que incluem a acetilação,

metilação, fosforilação, biotinilação, ubiquitinização entre outras (FEINBERG;

OHLSSON; HENIKOFF, 2006). Estas modificações são coordenadas e

38

catalisadas por diferentes enzimas, como as HMTs (histonas metila

transferases), desmetilases (HDMs), acetiltransferases (HATs) e histonas

desacetilases (HDACs) (CASTILLO; LÓPEZ-RODAS; FRANCO, 2017).

Basicamente, estas modificações pós-traducionais de histonas afetam a

estrutura da cromatina, facilitando ou dificultando o acesso dos fatores

transcricionais ao DNA e a consequente ação da RNA polimerase

(BANNISTER; KOUZARIDES, 2011). Dependendo do tipo, função ou

localização (em qual aminoácido específico da calda da histona) da

modificação química nas caudas das histonas, são gerados diferentes

resultados (MICELI et al., 2014). As alterações mais bem estudadas até o

momento envolvem a acetilação e a metilação de resíduos específicos de lisina

nas histonas H3 e H4 (BERGER, 2007).

2.3.3 RNAs não codificantes (ncRNA)

O termo RNAs não codificantes (ncRNAs) é comumente empregado

para RNAs que não codificam proteínas, mas isso não significa que estes

RNAs não contenham informações ou desempenhem diferentes funções

(MATTICK; MAKUNIN, 2006). Estas moléculas se mostram cada vez mais

importantes na regulação da transcrição em mamíferos e outros organismos

complexos (BARTEL, 2004). Os ncRNAs são ativamente transcritos no

genoma, regulando diversos processos celulares e, inclusive, participando no

desenvolvimento de doenças, como o câncer (LIN; HE, 2017).

Os ncRNAs podem ser divididos em pequenos ncRNAs ou longos

ncRNAs (lncRNAs) (BARTEL, 2004). Os pequenos ncRNAs podem ser

subdivididos em: RNAs ribossomais (rRNA), RNAs transportadores (tRNA),

RNAs interação-piwi (piRNA), pequenos RNAs nucleolares (snoRNA), micro-

RNAs (miRNA) e outros ainda não bem caracterizados, dependendo

basicamente do número de pares de bases que os compõem (MATTICK;

MAKUNIN, 2006; CECH; STEITZ, 2014). Já os longos ncRNAs formam uma

classe heterogênica de transcritos de mRNAs que não codificam nenhuma

proteína e podem interagir com a cromatina (LI; CHEN, 2013).

Na última década, uma lista crescente de miRNAs foi identificada em

vários tecidos e, diante disso, estima-se que mais de um terço do genoma seja

39

alvo dos miRNAs (LEWIS; BURGE; BARTEL, 2005). Muitos estudos têm

demonstrado que os miRNAs podem apresentar função de oncogênicos ou de

supressores de tumor (CALIN; CROCE, 2006), estando relacionados inclusive

com os processos da TEM e, consequentemente, com o desenvolvimento das

metástases (HURST; EDMONDS; WELCH, 2009). Para tanto, alguns miRNAs

têm sido descritos como importantes marcadores da TEM, como os membros

da família miR-200, capazes de estimular a expressão de E-caderina. A baixa

expressão destes miRNAs associa-se a um pior prognóstico no câncer de

mama (GREGORY et al., 2008). Outros diversos membros têm mostrado

importante papel na invasão e metástase tumoral da mama, como o miR-10b

(MA; TERUYA-FELDSTEIN; WEINBERG, 2007), miR-22 (XU et al., 2011), miR-

181b (KRONSKI et al., 2014), entre outros.

Já entre os mais importantes lncRNA de regulação genômica

conhecidos nas células humanas, encontra-se o HOTAIR. Este lncRNA surge a

partir da transcrição reversa do gene HoxC, que está especificamente situado

entre os genes HoxC11 e HoxC12, no cromossomo 12q13.13 (GUPTA et al.,

2010b). O HOTAIR desempenha papel chave na iniciação, progressão e no

aumento da malignidade de diferentes tipos de cânceres e, por isso, é um fator

oncogênico usado como um biomarcador de prognóstico de câncer (GUPTA et

al., 2010b; CAI et al., 2014). Sabe-se que os níveis de expressão de HOTAIR

são maiores em pacientes com câncer de mama que em pacientes sadios, e

sua superexpressão promove a invasão e a metástase de tumores (ZHANG et

al., 2014). Entre os possíveis motivos de ação deste lncRNA, está o fato de que

altos níveis de expressão de HOTAIR inibem a expressão da molécula de

junção celular E-caderina, explicando a íntima relação desta molécula com a

TEM (WU et al., 2015).

40

3 OBJETIVOS 3.1 OBJETIVOS GERAIS

Estudar o mecanismo molecular da droga análoga de GLP-1, liraglutida,

através de seus efeitos sobre o crescimento celular, migração, expressão

gênica e metilação do DNA, utilizando linhagens tumorais de mama e modelo

tumoral de Ehrlich.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

3.2.1 Avaliar a interferência da liraglutida sobre o crescimento celular e

migração de linhagens tumorais de mama.

3.2.2 Identificar o potencial de liraglutida como terapia adjuvante utilizando

linhagens tumorais de mama e tumor de Ehrlich.

3.2.3 Quantificar a expressão gênica de ESR1, PGR, CDH1, ADAM33 antes e

após o tratamento com liraglutida em linhagens tumorais de mama.

3.2.4 Avaliar o potencial desmetilante de liraglutida em linhagens tumorais de

mama e em tumores de Ehrlich.

3.2.5 Avaliar os efeitos de liraglutida sobre a expressão proteica de E-caderina

e ADAM33 em linhagens tumorais de mama.

3.2.6 Quantificar a expressão gênica e proteica de DNMTs em linhagens

tumorais de mama controles e expostas ao tratamento com liraglutida.

3.2.7 Identificar a ação de liraglutida sobre a atividade e inibição das enzimas

DNMTs de linhagens tumorais de mama.

3.2.8 Avaliar os efeitos de liraglutida em modelos de tumor de Ehrlich em

camundongos, identificando o volume do tumor, peso de órgãos e taxa

glicêmica dos animais.

3.2.9 Avaliar histologicamente os efeitos de liraglutida sobre os tumores de

Ehrlich.

3.2.10 Quantificar genes relacionados a apoptose, necrose e necroptose nos

tumores de Ehrlich controles e tratados com liraglutida.

41

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 CULTIVO CELULAR E TRATAMENTOS

Foram utilizadas neste estudo diferentes linhagens celulares de câncer

de mama, todas cedidas pelo Instituto Ludwig – LMBG, entre elas: MCF7, uma

linhagem do tipo luminal B (RE positivo, PR positivo e HER2 positivo); as

linhagens triplo negativas do tipo basal MDA-MB-231 e MDA-MB-436 (NEVE et

al., 2009); e HB4a, uma linhagem celular luminal de mama normal imortalizada

com SV-40 (STAMPS et al., 1994), utilizada como controle de alguns ensaios.

Todas as células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco) suplementado

com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de antibiótico

penicilina/estreptomicina, e mantidas em uma incubadora úmida com 5% de

CO2 a 37°C.

Durante os cultivos, as linhagens celulares foram expostas aos

diferentes tratamentos. Aproximadamente 3 x 105 células de MCF7, MDA-MB-

231 e MDA-MB-436 foram cultivadas em placas de 6 poços, e submetidas a 24

horas de tratamento com 1 μM de 5-Aza-2’-deoxicitidina (5Azadc) (Sigma), ou 1

μM de exenatida (Exe) (Byetta®, AstraZeneca) (LIGUMSKY et al., 2012), ou 30

nM de liraglutida (Lira) (Victoza®, Novo Nordisk) (JACOBSEN et al., 2016). A

linhagem MCF7 também foi exposta ao tratamento por quatro dias com 50

ng/ml de fator de crescimento epidermal (EGF) (LifeTechnologies) para indução

de um fenótipo mesenquimal (KIM et al., 2016). Após este tratamento foram

testadas as capacidades de reverter os efeitos de EGF com a adição de 1 μM

of 5Azadc ou 30 nM de liraglutida por mais 24 horas.

4.2 EXTRAÇÕES DE DNA E RNA

Os DNAs e RNAs das linhagens celulares utilizadas no estudo, controles

e tratadas, foram extraídos com o kit All prep DNA/RNA (Qiagen), conforme

especificações do fabricante. Também foram realizadas extrações nos

materiais biológicos obtidos dos experimentos in vivo (tumores e pulmão)

42

sendo que nesses casos, cerca de 100 mg de cada amostra foi utilizada para

extração de DNA, utilizando-se o método de extração fenol/clorofórmio

(GREEN; SAMBROOK, 2017). Uma porção semelhante de cada amostra foi

adicionada a um tubo contendo Trizol Reagent (Invitrogen) para extração de

RNA, e estes tubos foram acoplados ao equipamento Tissue Lyser II (Qiagen)

programado em uma frequência de 25 Hz por 2 minutos sendo que após essa

etapa prosseguiu seguindo as instruções do fabricante.

4.3 TRATAMENTO DO DNA COM BISSULFITO DE SÓDIO

Os DNAs extraídos das linhagens celulares e dos materiais biológicos

obtidos pelos experimentos em animais, foram quantificados no

espectrofotômetro Nanodrop2000 e submetidos ao tratamento com bissulfito de

sódio do kit Epitec (Qiagen), de acordo com as especificações do fabricante.

Este tratamento permite analisar o perfil de metilação das amostras de

DNA a partir da deaminação de citosinas desmetiladas que são convertidas a

uracilas, enquanto as citosinas metiladas não são afetadas por esse

tratamento. Após uma amplificação por PCR do DNA tratado, as uracilas são

substituídas por timinas e as citosinas originalmente metiladas, são mantidas

como citosinas. Desta forma, com o sequenciamento do DNA tratado com

bissulfito, é possível identificar o padrão de metilação da região estudada.

4.4 ENSAIOS DE COLÔNIA E CURVA DE CRESCIMENTO CELULAR

Para avaliar os efeitos do liraglutida sobre os padrões de crescimento

tumoral, foram realizados ensaios de colônia e de curva de crescimento. O

ensaio de colônia foi realizado a partir do cultivo de aproximadamente 100

células de MCF7, MDA-MB-231 ou MDA-MB-436 em placas de 6 poços. Estas

células foram submetidas a tratamentos com 5Azadc (1 μM), utilizado como

controle por ser um conhecido inibidor na formação de colônias (JUNG et al.,

2007), ou ao tratamento com liraglutida (30 nM) por 14 dias. O meio de cultivo

foi trocado a cada dois dias e, após os 14 dias, as células foram fixadas e

coradas com 0,5% de cristal violeta (Sigma). O número de colônias formadas

43

em cada tratamento e linhagem foi quantificado e exposto na forma de gráficos

(FRANKEN et al., 2006).

A taxa de crescimento celular em linhagens controles ou tratadas com

liraglutida (30 nM) foi avaliada pelo ensaio de curva de crescimento.

Aproximadamente 5x103 células foram distribuídas em placas de 96 poços e

submetidas a tratamentos por 0, 6, 12, 24 e 48 horas. Após os diferentes

tempos de tratamento as células viáveis tratadas e, junto aos controles, foram

quantificadas pelo ensaio de MTT (RISS et al., 2013).

4.5 ENSAIOS DE MIGRAÇÃO CELULAR – WOUND HEALING

A linhagem MCF7 (3x104) foi cultivada em placas de 6 poços e tratada

por 24 horas com 5Azadc (1 μM) ou liraglutida (30 nM). Em outro ensaio a

linhagem foi previamente tratada por 4 dias com EGF (50 ng/ml), EGF

combinado com 5Azadc e EGF combinado com liraglutida. As linhagens MDA-

MB-231 e MDA-MB-436 foram tratadas por 24 horas com 5Azadc (1 μM) ou

liraglutida (30 nM). Após os tratamentos, o soro fetal bovino (SFB) foi depletado

do meio de cultivo por 4 horas e uma abertura, em linha reta, através da

monocamada celular foi feita com uma ponteira de 200 μl. As culturas foram

então lavadas três vezes com PBS 1X, para retirada das células descoladas, e

incubadas a 37°C e 5% de CO2, com meio RPMI sem soro fetal bovino. A área

da abertura foi fotografada e mensurada utilizando o software ImageJ® nos

tempos 0 e 24 horas, para análise da migração celular (LIANG; PARK; GUAN,

2007).

4.6 ENSAIOS EM COMBINAÇÃO COM A QUIMIOTERAPIA

Para avaliar o potencial de a liraglutida aumentar a morte celular tumoral

quando adjuvante ao tratamento com a quimioterapia, as linhagens MCF7,

MDA-MB-231 e MDA-MB-436 foram tratadas com os quimioterápicos paclitaxel

(PAC), em diferentes concentrações (0,005 μM, 0,01 μM, 0,1 μM, 0,5 μM e 1

μM) (LIGUMSKY et al., 2012), e com o quimioterápico metotrexato (MTX) em

diferentes concentrações (0,1 M, 0,2 M, 0,4 M e 0,6 M) (DOSUNMU; OWUSU-

APENTEN, 2017), com ou sem liraglutida (30 nM). O crescimento celular após

44

os cultivos foi mensurado a partir do ensaio MTT (RISS et al., 2013), conduzido

após 48 horas.

4.7 QUANTIFICAÇÃO GÊNICA

O RNA total foi purificado e submetido à síntese de cDNA utilizando o kit

High Capacity (Applied Biosystem), conforme especificações do fabricante.

Para tal, foram utilizados aproximadamente 1000 ng de RNA total, 1 μl de 20X

RT enzima mix e 10 μl de tampão 2X em um volume total de 20 μl de reação.

Para analisar o perfil de expressão dos diferentes genes, tanto das linhagens

celulares como dos materiais biológicos obtidos pelos experimentos em

animais, foram realizadas reações de PCR em tempo real (qPCR) com os

cDNAs sintetizados. Para tanto, se utilizou SYBR Green Power Master Mix

(Applied Biosystems), seguindo as recomendações do fabricante no

equipamento StepOne Plus (Applied Biosystems). Os iniciadores utilizados

nestas reações estão descritos na tabela abaixo (TABELA 2).

TABELA 2 – LISTA DE INICIADORES UTILIZADOS NAS REAÇÕES DE PCR EM

TEMPO REAL.

Gene Espécie Sequência dos iniciadores universais e reversos (3’ – 5’)

Referência

HPRT Homo sapiens U: GAACGTCTTGCTCGAGATGTGA

R: TCCAG CAGGTCAGCAAAGAAT

(FIGUEIRA et al., 2009)

CDH1 Homo sapiens U: CCCGGGACAACGTTTATT

R: GTCTTACGAGTCACTTCAG

(BISWAS et al., 2014)

VIM Homo sapiens U: CTCGTCACCTTCGTGAATAC

R: GATTAGTTTCCCTCA GGTTCAG

(BISWAS et al., 2014)

ADAM33 Homo sapiens U: CAGGACCCGGAAGTACCTG

R: GCCACCTGAATGTCCAGAG

Este trabalho

ESR1 Homo sapiens U: TGGGCTTACTGACCA ACCTG

R: CCTGATCATGGAGGG TCAAA

(WALTON et al., 2009)

PGR Homo sapiens U: CGCGCTCTACCCTGC ACTC

R: TGAATCCGGCCTCAG GTAGTT

(WALTON et al., 2009)

DNMT1 Homo sapiens U: CCCCTGAGCCCTACCGAAT

R: CTCGCTGGAGTGGACTTGTG

(SAITO et al., 2001)

DNMT3A Homo sapiens U: CGAGTCCAACCCTGTGATGATTG R: (ATTWOOD; RICHARDSON,

45

Na tabela estão descritas as sequências dos iniciadores utilizados, onde U representa

os iniciadores universais e R representa os iniciadores reversos. Fonte: A autora (2018)

4.8 ANÁLISES DE METILAÇÃO DO DNA

Para avaliar as possíveis interferências do tratamento com liraglutida no

perfil de metilação do DNA nos promotores dos genes CDH1 e ADAM33,

realizou-se a técnica de PCR sensível a metilação (MSP-PCR) (HERMAN et

al., 1996). Esta técnica se baseia no planejamento de iniciadores específicos

que se anelam em dinucleotídeos CpG importantes no processo de regulação

dos genes. Os iniciadores são construídos para condições metiladas e não

metiladas, permitindo a determinação do padrão de metilação de determinada

amostra a partir de uma única reação de PCR. Para os DNAs obtidos das

linhagens celulares controles ou tratadas, foram realizadas reações de MSP-

PCR para os genes: CDH1, um importante marcador de agressividade tumoral

(LIU et al., 2016a); e ADAM33, um importante marcador de tumores triplos

GCTGGTCTTTGCC CTGCTTTATG 2004)

DNMT3B Homo sapiens U: TTGGAATAGGGGACCTCGTGTG

R: AGAGACCTCGGAGAACTTGCCATC

(ATTWOOD; RICHARDSON,

2004);

ADAM33 Mus musculus U: TATTGCTGCCGCTGTTGCTG

R: CCAGGATCCAGTGGGGAGTG

Este trabalho

Bax Mus musculus U: GCCTCCTCTCCTACTTC

R:CCTCAGCCCATCTTCTT

(ADAMI et al., 2018)

Bcl2 Mus musculus U:CACTTGCCACTGTAGAGA

R:GCTTCACTGCCTCCTT

(ADAMI et al., 2018)

VEGF Mus musculus U: ACTGGACCCTGGCTTTACTGCT

R:TGATCCGACTGATCTGCATGGTG

(ADAMI et al., 2018)

PIK3 Mus musculus U:CCTGCTCCGTAGTGGTA

R:TTCATCGCCTCTGTTGTG

(ADAMI et al., 2018)

Casp8 Mus musculus U:CCAGGAAAAGATTTGTGTCTA

R:GGCCTTCCTGAGTACTGTCAC

(ADAMI et al., 2018)

RIPK3 Mus musculus U:CCAGAGGCCACTTGTGTAGCG

R:CGCTTTAGAAGCCTTCAGGTTGAC

(ADAMI et al., 2018)

GAPDH Mus musculus U:GGTGAAGCAGGCATCTT

R:TGTTGAAGTCGCAGGAG

(ADAMI et al., 2018)

46

negativos e de pior prognóstico (MANICA et al., 2017). Os iniciadores utilizados

nestas reações estão descritos na tabela abaixo (TABELA 3).

TABELA 3 – LISTA DE INICIADORES UTILIZADOS NAS REAÇÕES DE MSP-PCR

DAS LINHAGENS CELULARES TUMORAIS DE MAMA.

Na tabela estão descritas as sequencias dos iniciadores utilizados, onde U representa

os iniciadores universais e R representa os iniciadores reversos. Fonte: A autora (2018)

Também foram realizadas análises das possíveis interferências do

tratamento com liraglutida na metilação dos genes CDH1 e ADAM33 dos

tumores gerados nos camundongos. A avaliação da metilação do promotor de

CDH1 foi realizada pela técnica de PCR quantitativa sensível a metilação

(MSP-qPCR) (VLASSENBROECK et al., 2008). Os iniciadores utilizados estão

descritos na tabela abaixo (TABELA 4).

TABELA 4 – LISTA DE INICIADORES UTILIZADOS NA REAÇÕES DE MSP-qPCR DO

GENE CDH1 E AMPLIFICAÇÃO DO PROMOTOR DE ADAM33 EM TUMORES DE EHRLICH.

Na tabela estão descritas as sequencias dos iniciadores utilizados, onde U representa

os iniciadores universais e R representa os iniciadores reversos. Fonte: A autora (2018)

Gene Espécie Sequencia dos iniciadores universais e reversos (3’ – 5’) Referencia

CDH1 Homo sapiens U metilado: TTAGGTTAGAGGGTTATCGCG

R metilado: TAACTAAAAATTCACCTACCGAC

U desmetilado: TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATTG

R desmetilado: CACAACCAATCAACAACACA

(HERMAN et al.,

1996)

ADAM33 Homo sapiens U metilado: GTTTGAGGTTGTATCGGG

R metilado: ACTCGCAACTCCGACTCCG

U desmetilado: GTTTGAGGTTGTATTGGGTA

R desmetilado: ACTCACAACTCCAACTCCA

(SENISKI et al.,

2009)

Gene Espécie Sequencia dos iniciadores universais e reversos (3’ – 5’)

Referencia

CDH1 Mus musculus U metilado: ATTGGTGTGGGAGTCGCGGC

R metilado: AACTCCCATAACGAACCCGACA

(MATABUENA DE

YZAGUIRRE et al., 2006)

ADAM33 Mus musculus U: TTTTGTTGTGTTGTTGGTTTTATTT

R: AAAAAAATTCTCTAAAAACCTTCCC

Este trabalho

47

Para avaliação da metilação do gene ADAM33 nos tumores dos animais,

o DNA extraído dos controles e tratados foram submetidos aos passos de

clonagem e sequenciamento (estes experimentos foram conduzidos pelo aluno

de iniciação científica Felipe Franco de Campos como monografia de

conclusão de curso). A ilha de CpG do gene ADAM33 murino foi amplificada

com iniciadores específicos (Tabela 4) nas seguintes condições: 1 ciclo de

95°C por 5 minutos; 35 ciclos de 94°C por 1 minuto, 58°C por 1 minuto, e 72°C

por 1 minuto. Os produtos amplificados foram purificados usando o kit Qiaquick

Gel Extraction (Qiagen) e clonados em vetores pGEMT (Promega). Oito

clones de cada amostra foram sequenciados usando a tecnologia Big Dye

Terminator (Applied Biosystems), no sequenciador ABI 2500 XL (Applied

Biosystems), de acordo com instruções do fabricante. A porcentagem de

metilação de cada amostra foi calculada a partir dos resultados de

sequenciamento, onde o número de dinucleotídeos CpG metilados foi dividido

pelo total de CpG analisados.

4.9 AVALIAÇÃO DE EXPRESSÃO PROTEICA

Além da análise da expressão gênica e da metilação do DNA, foi avaliada

a expressão proteica por Western blotting da ADAM33 e DNMT1 e por

citometria de fluxo a proteína E-caderina. Os experimentos de Western blotting

foram realizados com os extratos proteicos das linhagens MCF7, MDA-MB-231

e MDA-MB-436 controles, tratadas com 5azadC (1 μM) e liraglutida (30 nM), a

partir de cultivos celulares realizados em placas de cultivo de 100 mm2. Após

alcançarem a confluência de aproximadamente 80%, as células foram

raspadas e lisadas com o tampão RIPA (50 mM Tris-HCl, pH; 0,5%

Deoxicolato; 150 mM NaCl, 0,1% SDS) acrescido do coquetel de protease PIC

(Sigma). Os lisados proteicos foram sonicados em três ciclos de 10 segundos a

uma frequência de 45 Hz, centrifugados a 10.000 x g por 10 minutos a 4°C, e

os sobrenadantes recolhidos. A quantificação proteica foi determinada por meio

do método de Bradford (BRADFORD, 1976) utilizando albumina sérica bovina

(BSA) como padrão. Após a quantificação, 50 μg de proteínas foram aplicadas

em géis SDS-PAGE 10% e depois transferidas para uma membrana de

nitrocelulose (HYBOND-P - Amersham Pharmacia Biotech). As marcações com

48

os anticorpos primários contra ADAM33 (1:1000 monoclonal obtido a partir do

hibridoma GMGK06, Manica et al., 2017), DNMT1 (1:1000, camundongo

monoclonal, Abcam, ab13537) e secundário (1:5000, camundongo monoclonal,

Invitrogen, 31430), foram reveladas através do método de quimioluminescência

(ECL-Amersham Pharmacia Biotech) de acordo com as especificações do

fornecedor. Posteriormente, a membrana foi exposta ao filme de raio X

(Kodak), o qual foi revelado com soluções reveladora e fixadora conforme as

especificações do fabricante (Kodak).

O experimento de citometria de fluxo foi utilizado para detecção da

proteína E-caderina. Para tanto, cerca de 1x106 células, tratadas e controles

foram cultivadas em placas de 6 poços, desprendidas com um scraper e EDTA

2 mM e fixadas com PFA 2% por 20 minutos. Após a fixação, foram realizadas

imunomarcações com o anticorpo contra E-caderina (1:1000, camundongo

monoclonal 4A2C7, Invitrogen, 33-4000) durante toda a noite, e com o

anticorpo secundário por 45 minutos (1:300, camundongo monoclonal, Abcam,

ab97024). As amostras foram lidas no citômetro de fluxo BD FACSCalibur (BD

Biosciences, Califórnia, EUA), utilizando-se o software CellQuest (BD

Biosciences, Califórnia, EUA), e os lasers e canais de detecção apropriados

para cada fluoróforo. Para cada amostra foram adquiridos 10.000 eventos e os

dados foram analisados e transformados em porcentagens, considerando-se as

amostras tratadas em relação aos controles.

4.10 ANÁLISES DE ATIVIDADE/INIBIÇÃO DE DNMTs E DE METILAÇÃO

GLOBAL DO GENOMA

Foi avaliado o potencial da liraglutida sobre a atividade das DNMTs e

sobre sua capacidade de competir pelo seu sítio ativo. Foi analisado a

potencial ação da liraglutida sobre o perfil de metilação global do genoma. Para

isso, as proteínas nucleares de cada linhagem celular, controles e tratadas com

5azadc ou liraglutida, foram isoladas com o kit EpiQuik™ Nuclear Extraction Kit

I (Epigentek, Brooklyn, NY, USA). Depois da quantificação proteica

(BRADFORD, 1976), cerca de 20 μg de proteínas nucleares foram utilizadas

para mensurar a atividade ou inibição das DNMTs totais, utilizando o kit

EpiQuik™ DNA Methyltransferase Activity/Inhibition Assay (Epigentek), de

49

acordo com as recomendações do fabricante. Este protocolo se baseia na

adsorção de DNA rico em citosinas em uma placa de 96, e que as enzimas

DNMTs presentes nos extratos proteicos nucleares, uma vez adicionadas aos

poços, transferem um grupamento metil a estas citosinas. O DNA metilado é

reconhecido com a utilização de um anticorpo anti-5-metilcitosina contida no

ensaio. A relação ou a quantidade de DNA metilado, proporcional à atividade

enzimática da DNMT, é quantificada fluorometricamente através da medição

em 450 nm. Além disso os extratos proteicos contendo as DNMTs foram

incubados com a liraglutida afim de mensurar um possível efeito como inibidor

da metilação, o resultado obtido foi demonstrado na forma de inibição

enzimática.

Os DNAs genômicos extraídos de cada linhagem celular exposta às

mesmas condições acima, foram utilizados para avaliação do perfil de

metilação global do genoma, com o protocolo MethylFlash Methylated DNA 5-

mC Quantification (Epigentek) de acordo com instruções do fabricante. Os

DNAs extraídos dos tumores gerados nos experimentos nos animais, controles

e tratados, também foram submetidos à avaliação do perfil de metilação global,

usando-se o mesmo protocolo sob as mesmas condições já descritas. Esse

ensaio permite a ligação do DNA aos poços tratados por ter uma alta afinidade

por essa molécula. A fração metilada do DNA que se ligou a placa é detectada

por anticorpos 5meC e depois quantificada colorimetricamente por leitura da

absorbância, em 450 nm em espectrofotômetro. A quantidade de DNA metilado

é determinada a partir de uma curva de calibração, construída a partir da

diluição seriada de um DNA controle do próprio kit, e a intensidade da D.O. é

proporcional a porcentagem de DNA metilado.

4.11 ESTUDOS EM ANIMAIS

Os efeitos da liraglutida foram avaliados in vivo após aprovação do comitê

de ética animal do setor de ciências biológicas da Universidade Federal do

Paraná (CEUA/BIO – UFPR - 1082). Para isto, foram utilizados 42

camundongos fêmeas do tipo Swiss com seis semanas de idade, nas quais

foram inoculadas células de tumor de Ehrlich, uma linhagem celular tumoral de

origem mamária murina (OZASLAN et al., 2011).

50

Para este experimento, as células tumorais de Ehrlich foram cultivadas na

forma de ascite (EAC) e a viabilidade celular foi de aproximadamente 99%,

avaliada por ensaio de exclusão por azul de tripan. Depois disso, o modelo de

xenoenxerto de carcinoma de Ehrlich (SEC) foi induzido nos camundongos a

partir da inoculação subcutânea de 2,5 x 106 células viáveis de EAC, diluídas

em 0,2 ml de solução salina, no lado direito da pelve de cada animal.

Os animais inoculados foram divididos em seis grupos distintos contendo

sete animais em cada: 1) os controles positivos, que receberam apenas as

inoculações com células tumorais de Ehrlich; 2) o primeiro grupo de controles

negativos, que receberam injeções a cada três dias de 2,5 mg/kg de

metotrexato (MTX), um conhecido quimioterápico redutor do tamanho tumoral

(SRIKANTH et al., 2002; ABDEL-RAHMAN; KABEL, 2012); 3) o segundo grupo

de controles negativos, que receberam injeções semanais de 0,6 mg/ml de

paclitaxel (PAC), um conhecido quimioterápico amplamente utilizado no

tratamento do câncer de mama (SYMMANS, 2001; WEAVER, 2014); 4) o

grupo dos tratamentos com injeções diárias de 1,2 mg/ml de liraglutida (mesma

dose utilizada no tratamento do diabetes); 5) o grupo dos tratamentos, que

recebeu injeções com metade da dose de MTX e 1,2 mg/ml de liraglutida; e 6)

o grupo dos tratamentos, injeções com metade da dose de PAC e 1,2 mg/ml

de liraglutida. Todos os tratamentos tiveram segmento de 21 dias. Durante o

experimento, cada animal teve acompanhamento do peso corpóreo e da taxa

glicêmica. A partir de sétimo dia, os tumores foram medidos diariamente com o

uso de um paquímetro para os cálculos do volume tumoral. O cálculo é

baseado na fórmula descrita: V(cm3) = 4π/3.A2. (B/2), onde A é o menor

diâmetro do tumor e B é o maior diâmetro do tumor (em centímetros). Ao final

dos 21 dias experimentais, os animais foram mantidos em jejum por 12 horas,

com livre acesso a água, anestesiados com injeção intraperitonial de cloridrato

de quetamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) para coleta dos tumores, fígado,

rins, baço e pulmões para determinação dos pesos relativos. Os tumores de 3

animais controles e tratados com liraglutida foram também submetidos a

extração de DNA e tratamento com bissulfito de sódio para clonagem do

promotor do gene ADAM33 padronizado neste estudo e MSP de CDH1 (Tabela

4) (MATABUENA DE YZAGUIRRE et al., 2006).

51

4.12 HISTOLOGIA E IMUNOHISTOQUIMICA DOS TUMORES

Fragmentos dos tumores de Ehrlich, tratados ou não com liraglutida,

foram fixados em 10% de formalina tamponada, à temperatura ambiente,

desidratados em etanol e clarificados com xilol. As amostras foram embebidas

em parafina, seccionadas em seções de 5 μm e coradas com hematoxilina e

eosina para observação microscópica de luz de forma cega (realizado pela

médica veterinária e patologista Dra. Claudia Martins Galindo). Os seguintes

parâmetros foram avaliados no tecido tumoral: celularidade, mitoses, necrose,

apoptose, fibrose e infiltrados inflamatórios. A classificação dos tumores de

Ehrlich seguiram a seguinte preconização (BARAKAT; ELSHAZLY;

MAHMOUD, 2015): 0 (lesões em <5% do tecido), 1 (lesões em 5–25% do

tecido), 2 (lesões em 26–50% do tecido), 3 (lesões em 51– 75% do tecido) e 4

(lesões > 75% do tecido).

Os tumores (3 controles e 3 tratados com liraglutida) também foram

submetidos aos ensaios imunohistoquímicos, utilizando-se o anticorpo contra

ADAM33 (1:200, monoclonal obtido a partir do hibridoma GMGK06) (MANICA

et al., 2017). Para que essa técnica fosse eficiente, foi adaptado a um protocolo

que permite a utilização de anticorpos produzidos em camundongos para

detecção de proteínas em tecido do mesmo animal (GOODPASTER;

RANDOLPH-HABECKER, 2014).

4.13 ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Todos os experimentos realizados neste trabalho foram repetidos pelo

menos três vezes, calculando-se a média e desvio padrão, e os dados foram

avaliados usando ANOVA ou t test student, com auxílio do software Prisma

Valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significantes.

52

5 RESULTADOS

5.1 A LIRAGLUTIDA É CAPAZ DE REDUZIR O CRESCIMENTO E A

MIGRAÇÃO EM LINHAGENS TUMORAIS DE MAMA.

O efeito de liraglutida sobre o crescimento de linhagens tumorais de

mama foi avaliado com experimentos de ensaio de colônia e curvas de

crescimento. As linhagens MCF7, MDA-MB-231 e MDA-MB-436 foram

submetidas aos tratamentos com o composto 5Azadc, utilizado como controle

para inibição de crescimento celular (JUNG et al., 2007), e ao tratamento com

liraglutida. Nos ensaios de colônia, para todas as linhagens avaliadas, o

5Azadc mostrou alta atividade de inibição de crescimento celular (p<0,001)

(FIGURA 7A). A liraglutida também se mostrou capaz de reduzir

significativamente a capacidade de formação de colônias na MCF7, MDA-MB-

231 e MDA-MB-436 (p<0,001) (FIGURA 7A). Da mesma maneira, foi possível

perceber que a liraglutida reduziu o crescimento das três linhagens estudadas,

a partir do experimento de curva de crescimento (FIGURA 7 B, C e D). As

linhagens foram submetidas a uma curva de tempo de tratamento de 6, 12, 24

e 48 horas. Com apenas 6 horas foi possível identificar uma redução no

crescimento celular de MCF7 e MDA-MB-231 quando comparadas ao controle

(FIGURA 7B e C). Já na linhagem MDA-MB-436, o mesmo efeito foi observado

a partir de tratamentos de 24 horas (FIGURA 7D).

53

FIGURA 7 – EFEITOS DA LIRAGLUTIDA SOBRE O CRESCIMENTO DE LINHAGENS

TUMORAIS DE MAMA

A) Efeitos da liraglutida sobre a formação de colônias celulares e sobre a curva de crescimento

celular, avaliada por MTT, nas linhagens B) MCF7, C) MDA-MB-231 e D) MDA-MB-436,

controles, tratadas com 5Azadc ou com liraglutida. ** p<0,01 e *** p<0,001, quando

comparadas aos controles. Fonte: A autora (2018).

A liraglutida também demonstrou um efeito inibitório na migração de

linhagens tumorais de mama, conforme avaliado pelo experimento wound

healing (FIGURA 8). A linhagem MCF7 não apresentou alterações significativas

no seu perfil migratório após os tratamentos com 5Azadc ou liraglutida,

comportamento este esperado para uma linhagem celular com características

conhecidamente não migratórias (COMŞA; CÎMPEAN; RAICA, 2015) (FIGURA

8A). Por ser uma linhagem classificada como luminal B (RE positivo, PR

positivo e HER2 positivo), a MCF7 apresenta um conjunto de genes expressos

que lhe conferem características menos agressivas e, consequentemente,

54

menos migratórias (NEVE et al., 2009). Porém, quando submetidas ao

tratamento com o fator de crescimento epidermal (EGF), ocorrem significativas

alterações moleculares que lhe conferem capacidade migratória (LIAO et al.,

2017). Desta maneira, quando submetemos a linhagem MCF7 ao tratamento

com EGF, foi possível identificar um ganho significativo na capacidade de

migração sobre a superfície da placa (FIGURA 8A). A finalidade de conferir a

esta linhagem um perfil mais agressivo e migratório, foi de avaliar o potencial

de reversão destes efeitos a partir do tratamento com a liraglutida. Tanto o

composto controle 5Azadc como a liraglutida conseguiram reverter o processo

migratório adquirido pela MCF7 após tratamento com EGF (FIGURA 8A). Em

síntese, os resultados mostraram que a liraglutida é capaz de reverter os

efeitos migratórios de EGF na linhagem MCF7.

As linhagens MDA-MB-231 e MDA-MB-436 são células de câncer de

mama com características mesenquimais e, por tanto, possuem habilidade

migratória (CAILLEAU; OLIVÉ; CRUCIGER, 1978). Quando submetidas ao

tratamento com o agente desmetilante 5Azadc por 24 horas, observou-se uma

redução significativa na migração celular destas linhagens (FIGURA 8B e C).

Da mesma forma, a liraglutida também foi capaz de diminuir as suas

capacidades de migração. Estes resultados sugerem que a liraglutida é capaz

de inibir a migração de linhagens celulares de câncer da mama de uma

maneira semelhante ao observado com o composto 5Azadc, um importante

inibidor de crescimento e migração de linhagens tumorais bem descrito na

literatura (BENDER et al., 1998; LIU et al., 2016b).

55

FIGURA 8 – EFEITOS DA LIRAGLUTIDA SOBRE A MIGRAÇÃO DE LINHAGENS

TUMORAIS DE MAMA

56

Ensaio de Migração Celular de Wound Healing nas linhagens: A) MCF7 controle, tratada com

5Azadc (24 horas), ou Lira (24 horas), ou EGF (4 dias), ou EGF seguido de 5Azadc (4 dias

seguido de 24 horas) ou EGF seguido de liraglutida (4 dias seguido de 24 horas); B) MDA-MB-231

e C) MDA-MB-436, controles e tratadas com 5Azadc (24 horas) ou Lira (24 horas). À direita, estão

às fotos dos cultivos celulares durante o experimento de wound healing. Os contornos em preto

indicam as margens da “ferida” gerada no cultivo, nos tempos de 0h, 24h e 48h. À esquerda

contém o gráfico gerado a partir da área das feridas, com o auxílio do software ImageJ

(demonstrado em porcentagem). *** p<0,001, quando comparadas aos controles. ### p <0,001,

quando comparadas ao tratamento com EGF. Fonte: A autora (2018).

57

5.2 LIRAGLUTIDA DIMINUI O CRESCIMENTO CELULAR DE LINHAGENS

CELULARES DE MAMA SUBMETIDAS À QUIMIOTERAPIA.

O paclitaxel (PAC) é um importante quimioterápico que atua sobre as

mitoses levando a morte celular. Este fármaco foi aprovado pela Food and

Drug Administration para o tratamento de câncer de ovário, mama, pulmão e

sarcoma de Kaposi (WEAVER, 2014), e a American Cancer Society o

descreveu como um dos fármacos mais comuns utilizados para a quimioterapia

adjuvante e neoadjuvante no tratamento do câncer de mama (AMERICAN

CANCER SOCIETY, 2017). Quando adicionado às culturas biológicas, o PAC é

capaz de reduzir significativamente a taxa de sobrevivência celular (LIEBMANN

et al., 1993), efeito este também observado neste trabalho (FIGURA 9A, B e

C). Os resultados obtidos demonstram que o tratamento das linhagens com

ambos os compostos, PAC e liraglutida, é mais eficiente na inibição do

crescimento celular. Na linhagem MCF7, essa combinação de drogas mostrou

uma redução significativa no crescimento celular em baixas concentrações,

onde 0,005 μM de PAC com liraglutida reduziram o crescimento celular de

70,5% somente com PAC para 59,5% com PAC e lira (p <0,001) (FIGURA 9A).

Já em maiores concentrações, foi possível observar apenas uma tendência

desta redução (p <0,05) (FIGURA 9A). Nas linhagens celulares MDA-MB-231 e

MDA-MB-436 foi observada essa mesma redução no crescimento celular com

efeitos melhores nas maiores concentrações, onde 0,5 μM de PAC com

liraglutida reduziram o crescimento de 29% e 31,7%, para 13,95% e 3,5%,

respectivamente (p <0,001); e 1 μM reduziram de 21,4% e 32,5%, para 14,15%

e 4,9%, respectivamente (p <0,001) (FIGURA 9B e C).

Outro agente quimioterápico também utilizado foi o metotrexato (MTX),

um inibidor de síntese do ácido fólico amplamente utilizado na quimioterapia do

câncer desde 1948 (WU et al., 2010), nas leucemias, mama, ovário e trato

intestinal, além do tratamento para outros tipos de câncer (AMERICAN

CANCER SOCIETY, 2017). Da mesma forma que o PAC, os tratamentos com

o quimioterápico MTX foram capazes de reduzir significativamente o

crescimento celular e, em combinação com a liraglutida, capazes de aumentar

a morte das linhagens celulares nos tratamentos (FIGURA 9D, E e F). Na

58

linhagem MCF7, a combinação de MTX e liraglutida mostrou uma redução

significativa no crescimento celular em todas as concentrações (p <0,001)

(FIGURA 9D). Já nas linhagens MDA-MB-231 e MDA-MB-436, foi possível

observar que essa mesma redução no crescimento celular ocorreu nas maiores

concentrações, onde 0,6 mM de MTX com liraglutida reduziram o crescimento

de 47,7% e 36,7%, para 34% e 26,5%, respectivamente (p <0,01); e 0,8 M

reduziram de 41,5% e 35,6% para 22% e 25,7%, respectivamente (p <0,001)

(FIGURA 9E e F).

Estes resultados demonstram, pela primeira vez, que a liraglutida é capaz

de aumentar a morte de linhagens celulares tumorais de mama no tratamento

conjunto aos quimioterápicos PAC e MTX. Desta maneira, com a inclusão da

liraglutida ao tratamento, foi possível reduzir as concentrações utilizadas dos

quimioterápicos, mostrando um potencial efeito como adjuvante na terapia

celular.

59

FIGURA 9 – ENSAIOS DE LIRAGLUTIDA EM COMBINAÇÃO COM QUIMIOTERÁPICOS

Efeitos no crescimento celular da liraglutida em conjunto com quimioterápicos. A) MCF7, B)

MDA-MB-231 e C) MDA-MB-436 foram submetidas a tratamentos com o quimioterápico

paclitaxel, com (+ lira) ou sem (- lira) a liraglutida. A) MCF7, B) MDA-MB-231 e C) MDA-MB-

436 também foram submetidas aos tratamentos com o quimioterápico metotrexato, com (+ lira)

ou sem (- lira) a liraglutida. Este ensaio de MTT foi realizado por 48 horas. * p<0,05, ** p<0,01 e

*** p<0,001, ao comparar colunas brancas (apenas quimioterápicos) com colunas coloridas

60

(quimioterápicos + liraglutida). # p<0,05, ## p<0,01 e ### p<0,001, ao comparar as colunas

com o controle sem qualquer tratamento (primeira coluna branca). Fonte: A autora (2018).

5.3 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA ANTES E APÓS TRATAMENTO

COM LIRAGLUTIDA

Diante dos efeitos de liraglutida no crescimento, migração celular e seus

efeitos quando combinado aos quimioterápicos, foram avaliados seus efeitos

na expressão gênica. Para tanto, foram escolhidos alguns genes envolvidos

com o processo de TEM tais como: CDH1 e VIM; ou genes envolvidos com a

caracterização do perfil de tumores do tipo TNG regulados por mecanismos

epigenéticos tais como: ESR1, PGR, ADAM33 (FIGURA 10).

Para a linhagem MCF7, o tratamento realizado com 5Azadc, agente

desmetilante utilizado como controle, foi capaz de aumentar significativamente

a expressão dos genes VIM, ADAM33, ESR1 e PR (FIGURA 10 A). No

tratamento com liraglutida foi observado o mesmo resultado, porém, de

maneira mais significativa (p<0,001) e com um aumento na expressão de todos

os genes avaliados, incluindo o CDH1 (FIGURA 10A). Quando a linhagem

MCF7 foi tratada com EGF, composto capaz de induzir um fenótipo

mesenquimal (KIM et al., 2016), houve uma diminuição na expressão de CDH1

e aumento de VIM. Tratamentos com EGF seguidos por 5Azadc ou por

liraglutida foram capazes de atenuar as características mesenquimais

ocasionadas por EGF. Isto ficou evidente com o aumento de CDH1, ADAM33,

PR e diminuição de VIM em comparação com a MCF7 tratada apenas com o

composto EGF (FIGURA 10A). No tratamento com EGF seguido de liraglutida,

foi possível observar também um aumento na expressão de ESR1. De uma

maneira geral, o tratamento com EGF conferiu à linhagem MCF7 a expressão

gênica característica de células mesenquimais, e a combinação com o

liraglutida foi capaz de revertê-las, devolvendo a linhagem um perfil de

expressão mais semelhante ao encontrado pelo tratamento apenas com o

liraglutida (FIGURA 10A).

Para as linhagens MDA-MB-231 e MDA-MB-436, os tratamentos com

5Azadc e liraglutida mostraram significativo aumento na expressão de CDH1,

ADAM33, ESR1 e PGR (FIGURA 10B e 10C). Este aumento na expressão

61

gênica após tratamento com 5Azadc é esperado, tendo em vista se tratar de

um agente desmetilante. A exposição destas mesmas linhagens ao liraglutida

mostrou um resultado semelhante ao encontrado com 5Azadc, onde também

houve um aumento significativo na expressão dos mesmos genes (FIGURA

10B e C).

FIGURA 10 – EXPRESSÃO GÊNICA QUANTITATIVA DAS LINHAGENS TUMORAIS DE

MAMA EXPOSTAS AOS TRATAMENTOS COM LIRAGLUTIDA

Expressão gênica quantitativa em linhagens tumorais de mama após tratamentos com 5Azadc

ou liraglutida. A) MCF7 controle, tradada com 5Azadc, liraglutida, EGF, EGF+5Azadc ou

EGF+liraglutida. B) MDA-MB-231 e C) MDA-MB-436 controles, tratadas com 5Azadc ou

liraglutida. * p <0,05, ** p <0,01 e *** p <0,001, quando comparado ao controle; # p <0,05, ## p

<0,01 e ### p <0,001, quando comparado com o tratamento com EGF. Fonte: A autora (2018).

62

5.4 ALTERAÇÕES GERADAS PELO LIRAGLUTIDA NA METILAÇÃO DO DNA

E NA EXPRESSÃO PROTEICA.

Com intuito de compreender o papel do liraglutida como um provável

agente desmetilante do DNA, foram realizadas análises dos perfis de metilação

de genes importantes para o câncer de mama, tais como o ESR1, PGR e

CDH1 e ADAM33, bem como uma avaliação global da metilação das linhagens

submetidas ou não ao tratamento com liraglutida. Como a metilação do DNA é

um mecanismo relacionado com a regulação da expressão gênica (YOO;

JONES, 2006), os perfis de metilação encontrados foram associados aos níveis

de expressão proteica, permitindo uma análise mais abrangente do papel de

liraglutida sobre as linhagens celulares tumorais de mama.

Os testes de MSP mostraram como resultados fragmentos

correspondentes à condição não metilada, onde CpGs específicos estão

desmetilados indicando que o gene alvo está sendo expresso, ou fragmentos

correspondentes à condição metilada, significando silenciamento do gene alvo.

A linhagem MCF7 utilizada como controle positivo para a expressão do gene

CDH1 (HIRAGURI et al., 1998), mostrou somente o fragmento da condição não

metilada, tal como esperado. O tratamento dessa linhagem com o agente

desmetilante 5Azadc parece ter intensificado o fragmento da condição

desmetilada, assim como o tratamento com liraglutida (FIGURA 11A). Em

ambas as linhagens MDA-MB-231 e 436, o gene CDH1 é silenciado por

metilação (LOMBAERTS et al., 2006), e o 5Azadc foi capaz de reverter

parcialmente este processo, como demonstrado pela presença de fragmentos

da condição não metiladas e metiladas (FIGURA 11B e C). Da mesma

maneira, os tratamentos com liraglutida proporcionaram uma desmetilação do

promotor do gene CDH1, tornando visíveis os fragmentos da condição

desmetilada e, muito sutís os fragmentos da condição metilada (FIGURA 11B e

C). Como a metilação do DNA está diretamente relacionada ao silenciamento

gênico (YOO; JONES, 2006), se avaliou se os perfis de metilação encontrados

correspondiam a expressão proteica, a partir do uso de ensaios de citometria

de fluxo (FIGURA 11D, E e F). As evidentes desmetilações no gene CDH1,

ocasionadas pelo liraglutida nas linhagens MDA-MB-231 e 436, foram então,

63

associadas ao aumento na expressão proteica de E-caderina (FIGURA 11D, E

e F), comprovando que, além de desmetilar o promotor do gene CDH1, foi

possível a tradução e o surgimento da proteína E-caderina na membrana das

células após o tratamento com o liraglutida.

FIGURA 11 – EFEITOS DA LIRAGLUTIDA SOBRE A METILAÇÃO E A EXPRESSÃO DE E-

CADERINA

Análise de metilação e expressão proteica de E-caderina. Os perfis de metilação do gene

CDH1 foram avaliados por MSP-PCR, nas linhagens: A) MCF7, B) MDA-MB-231 e C) MDA-

MB-436, controles, tratadas com 5Azadc ou liraglutida. As letras “U” representam as condições

desmetiladas, já as letras “M” representam as condições metiladas. Dependendo da condição

em que é possível visualizar a presença de um fragmento, indica o perfil de metilação do gene

avaliado. A expressão proteica foi avaliada por citometria de fluxo, nas linhagens: D) MCF7, E)

MDA-MB-231 e F) MDA-MB-436, controles ou tratadas com liraglutida. * p <0,05, quando

comparado ao controle. Fonte: A autora (2018).

A partir do ensaio de MSP também foi possível confirmar o perfil de

metilação das linhagens tumorais para o gene ADAM33, descrito pelo nosso

grupo de pesquisa (SENISKI et al., 2009). A linhagem MCF7 possui o promotor

do gene ADAM33 hipermetilado e, após o tratamento tanto com 5Azadc quanto

com a liraglutida foi possível observar o fragmento da condição desmetilada

64

(FIGURA 12A). Na linhagem MDA-MB-231 foi possível encontrar o mesmo

resultado, onde o tratamento com 5Azadc e com liraglutida também levaram à

desmetilação do gene ADAM33 (FIGURA 12B). Os tratamentos realizados na

linhagem MDA-MB-436, não permitiram identificar uma variação no perfil de

metilação no gene ADAM33 a partir do uso dessa técnica, considerando que o

controle já apresentava fragmentos de ambas as condições (SENISKI et al.,

2009) (FIGURA 12C). Em paralelo a este trabalho, o promotor do gene

ADAM33 em todas as condições acima citadas foram clonados e sequenciados

(dissertação de mestrado realizado em nosso grupo de pesquisa, pela aluna

Angie Dayana M. Becerra, 2018). Com esta técnica, foi possível confirmar a

desmetilação ocasionada pela liraglutida, com uma redução de 12% na

linhagem MCF7, de 40% na linhagem MDA-MB-231 e inclusive na linhagem

MDA-MB-436, com redução de 15% na taxa de metilação global. Estes dados

confirmam a desmetilação promovida pela liraglutida (e farão parte da

publicação que está em preparação a partir dessa tese). A expressão proteica

de ADAM33 nas linhagens celulares foi avaliada por western blotting, onde o

tratamento com liraglutida intensificou a expressão de ADAM33 na linhagem

MCF7 e induziu a expressão nas linhagens MDA-MB-231 e MDA-MB-436

(FIGURA 12D, E e F).

FIGURA 12 – EFEITOS DA LIRAGLUTIDA SOBRE A METILAÇÃO E A EXPRESSÃO DE

ADAM33

65

Análise de metilação e expressão proteica de ADAM33. O perfil de metilação do gene ADAM33

foi avaliado por MSP, nas linhagens: A) MCF7, B) MDA-MB-231 e C) MDA-MB-436, controles,

tratadas com 5Azadc ou liraglutida. As letras “U” representam as condições desmetiladas, já as

letras “M” representam as condições metiladas. Expressão proteica avaliada por western

blotting nas linhagens: D) MCF7, E) MDA-MB-231 e F) MDA-MB-436, controles ou tratadas

com liraglutida. Fonte: A autora (2018).

Os resultados obtidos nos ensaios com os genes ESR1 e PGR foram

inconclusivos, porque não há na literatura bons iniciadores que avaliem as

condições desmetiladas nestes genes. Mesmo não encontrando bons

resultados do perfil de metilação destes genes, foi avaliada a expressão

proteica nas linhagens tumorais de mama controles e tratadas, a partir de

ensaios preliminares de imunocitoquímica, realizados em laboratório de

análises clínicas. Este ensaio também não mostrou resultados conclusivos e,

portanto, ainda não foi demonstrado nesta tese, por estarem em etapa de

padronização (serão incluídos no manuscrito em preparação).

A identificação da desmetilação no promotor dos genes CDH1 e

ADAM33 a partir dos tratamentos com liraglutida levaram a busca do possível

potencial de desmetilação global desta molécula. O composto 5Azadc, utilizado

como controle desmetilante do DNA, foi capaz de desmetilar de forma global

significativamente as linhagens MCF7, MDA-MB-231 e MDA-MB-436 (FIGURA

13). Da mesma maneira, a liraglutida também mostrou o mesmo resultado

significativo como potencial agente desmetilante do genoma, inclusive, em

alguns casos, até mais pronunciado. Foi observado que a liraglutida foi capaz

de induzir na linhagem MCF7 um perfil de metilação global de 1,4% a 0,4% (p

<0,001), a MDA-MB-231 de 1,4% a 1% (p <0,01) e a MDA-MB-436 de 1,5% a

0,7% (p <0,01) (FIGURA 13).

Desta maneira, o composto liraglutida demonstrou a capacidade de não

só levar a desmetilção de genes específicos como CDH1 e ADAM33, mas

sobretudo, também induzir a desmetilação global do genoma de maneira

similar a encontrada pelo agente desmetilante 5Azadc.

66

FIGURA 13 – EFEITOS DA LIRAGLUTIDA SOBRE A METILAÇÃO GLOBAL DO GENOMA

DAS LINHAGENS TUMORAIS DE MAMA

Perfil de metilação global do DNA. As linhagens celulares MCF7, MDA-MB-231, MDA-MB-436,

controles, tratadas com 5Azadc ou com liraglutida foram utilizadas para calcular a porcentagem

de citosinas metiladas do genoma (% 5-mC). ** p<0,01, *** p<0,001, quando as linhagens

celulares tratadas são comparadas aos seus respectivos controles. Fonte: A autora (2018).

5.5 EFEITOS DE LIRAGLUTIDA SOBRE AS ENZIMAS DNMTs.

Diante dos resultados de desmetilação de genes específicos e global do

genoma, o próximo passo foi a identificação dos mecanismos de ação da

liraglutida. Para isso, inicialmente foi avaliado a expressão dos genes das

enzimas responsáveis pela metilação do DNA: DNMT1, DNMT3a e DNMT3b

nas linhagens MCF7, MDA-MB-231 e MDA-MB-436, controles e tratadas com

5Azadc ou liraglutida. Em nenhuma dessas condições avaliadas foi possível

identificar mudanças significativas na transcrição das DNMTs (FIGURA 14A, B

e C). O mesmo foi observado para a expressão proteica de DNMT1, onde os

tratamentos tanto com 5Azadc ou liraglutida não foram capazes de alterá-la

(FIGURA 14D). Portanto, pode-se observa que os tratamentos de 24 horas

com compostos 5Azadc ou liraglutida não foram capazes de alterar a

transcrição ou a tradução das DNMTs nas linhagens tumorais de mama.

67

FIGURA 14 – EFEITOS DA LIRAGLUTIDA SOBRE A EXPRESSÃO GENICA E PROTEICA

DAS ENZIMAS DNMTs

Efeito do tratamento com liraglutida sobre a expressão gênica e proteica das enzimas DNMTs.

A) expressão quantitativa de DNMT1, B) DNMT3A e C) DNMT3B em células tumorais de

mama. D) Da mesma forma, foi realizada uma análise da proteína DNMT1 por western blotting.

Neste ensaio é possível perceber a esquerda a membrana revelada e a direita um gráfico

gerado a partir da quantificação das bandas, com auxílio do software Image J. Fonte: A autora

(2018).

Em seguida, os efeitos da liraglutida na atividade e na inibição das

DNMTs totais foram avaliados. Os tratamentos com os compostos 5Azadc e

exenatida foram utilizados como controle, tendo em vista seus potenciais na

redução da atividade da DNMT já descritos na literatura (KIM et al., 2012;

YASUDA et al., 2016). Neste trabalho, o tratamento com 5Azadc foi capaz de

reduzir significativamente a atividade (D.O./h/mg) das enzimas DNMTs nas três

linhagens celulares, de 5,83 a 5,05 na MCF7 (p <0,001), de 1,07 a 0,18 na

MDA-MB-231 (p <0,001) e de 0,76 para 0,7 na MDA-MB-436 (p <0,05)

(FIGURA 15A). O tratamento com exenatide mostrou resultado similar,

reduzindo a atividade das DNMTs de 5,83 a 5,25 na MCF7 (p <0,01), de 1,07 a

68

0,22 na MDA-MB-231 (p <0,001) e de 0,76 para 0,61 na MDA-MB-436 (p

<0,01) (FIGURA 15A). A liraglutida, assim como os controles positivos, também

mostraram potencial na redução da atividade das DNMTs: de 5,83 para 4,95 na

MCF7 (p <0,01), de 1,07 para 0,2 no MDA-MB-231 (p <0,001) e de 0,76 para

0,3 na MDA-MB- 436 (p <0,001) (FIGURA 15A). Na linhagem MDA-MB-436, a

redução encontrada com a liraglutida foi ainda mais evidente que o encontrado

com os controles positivos.

Diante desses resultados, ficou evidente que a liraglutida é capaz de

interferir na atividade das enzimas DNMTs, porém, sem alterar os processos de

transcrição ou tradução. Em busca de maior entendimento de como este

composto poderia interferir na atividade enzimática, foram realizados ensaios

de inibição de DNMTs, os quais permitiriam visualizar se liraglutida seria capaz

de inibir a atividade de DNMTs pela interação direta com a mesma. Os

resultados mostraram que o liraglutida foi capaz de inibir diretamente as

DNMTs na linhagem MCF7 em 59,7%, na MDA-MB-231 em 55,1%, e na MDA-

MB-436 em 20,7% (FIGURA 15B). Diante destes resultados da inibição direta,

ensaios preliminares in sílico (em parceria com o Professor Dr. Marcos Brown

Gonçalves, UTFPR) para avaliar a região de interação da liraglutida à enzima

DNMT1. Os resultados preliminares demonstram que a ligação da liraglutida

parece estar ocorrendo no ligante auto-inibidor da DNMT1, localizado entre os

domínios CXXC e BAH1, importante para regulação da enzima (SONG et al.,

2011b). Esta ligação pode estar interferindo no funcionamento da DNMT1 e,

consequentemente, na manutenção da metilação do DNA (resultados ainda

não demonstrados nesta tese por estarem em análises preliminares).

69

FIGURA 15 – EFEITOS DA LIRAGLUTIDA SOBRE A ATIVIDADE E INIBIÇÃO DAS ENZIMAS

DNMTs

Avaliação dos efeitos da liraglutida sobre a atividade e inibição das DNMTs. Extratos proteicos

nucleares foram isolados das linhagens MCF7, MDA-MB-231 e MDA-MB-436, controles e

tratadas com 5Azadc, exenatina ou liraglutida. A) os extratos foram avaliados pela quantidade

de metilação do DNA, que é proporcional a atividade das enzimas DNMTs. B) Os mesmos

extratos proteicos também foram submetidos a ensaios de inibição, onde ocorre juntamente a

adição da liraglutida. O gráfico representa em porcentagem a capacidade da liraglutida se ligar

diretamente às enzimas e inibi-las. * p <0,05, ** p <0,01 e *** p <0,001, quando comparados

com aos controles. Fonte: A autora (2018).

5.6 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE LIRAGLUTIDA EM MODELOS DE

TUMOR DE EHRLICH EM CAMUNDONGOS.

Para avaliar o efeito da liraglutida in vivo, foram utilizados o modelo de

tumor de Ehrlich em camundongos. Os animais foram divididos em 6 grupos

diferentes: 1) controles positivos, com tumor de Ehrlich sem nenhum tipo de

tratamento; 2) o primeiro grupo de controles negativos, tratados com

metotrexato (MTX); 3) o segundo grupo de controle negativos, tratados com

paclitaxel (PAC); 4) grupo tratado com liraglutida; 5) grupo tratado com

liraglutida e metade da dose de MTX; e 6) grupo tratado com liraglutida e

metade da dose de PAC. Após inoculação subcutânea no membro pélvico dos

animais dos diferentes grupos, foi acompanhado o desenvolvimento tumoral e

70

a partir do sétimo dia foi possível dar início aos processos de medição dos

tamanhos tumorais, dos controles e tratados.

Os tumores controles mostraram ao longo do experimento uma curva de

crescimento bastante evidente (FIGURA 16A) e, ao final, foi possível perceber

que os animais controles positivos apresentaram um crescimento tumoral

significativamente maior que os encontrados nos tratamentos (FIGURA 16B).

Os animais dos grupos controles negativos foram submetidos aos tratamentos

com importantes quimioterápicos utilizados no tratamento do câncer de mama,

como o MTX (SRIKANTH et al., 2002; WU et al., 2010; ABDEL-RAHMAN;

KABEL, 2012) e o PAC (SYMMANS, 2001; WEAVER, 2014). Estes tratamentos

foram capazes de reduzir significativamente o crescimento tumoral a partir do

13º dia de tratamento (FIGURA 16A), semelhante ao observado em estudos

encontrados na literatura (WOSIKOWSKI et al., 2003; HUYSENTRUYT;

SHELTON; SEYFRIED, 2010). Os tratamentos realizados com as combinações

de liraglutida e com metade da dose de MTX ou PAC levaram,

surpreendentemente, a uma redução no tamanho do tumor igualmente

significativa às encontradas nos tratamentos com dose completa dos

quimioterápicos (FIGURA 16A e B). Esses resultados mostraram que a adição

de liraglutida ao tratamento permite reduzir o uso de quimioterápicos MTX e

PAC sem reduzir a eficiência ou mesmo a eficácia do tratamento.

FIGURA 16 – EFEITO DA LIRAGLUTIDA NO TAMANHO DE TUMORES DE EHRLICH

71

Efeito da liraglutida sobre o tamanho dos tumores de Ehrlich. A) Gráficos que representam o

acompanhamento diário dos tamanhos dos tumores ao longo do experimento. Estão

representados os tumores controles, tratados com liraglutida, com os quimioterápicos paclitaxel

e metotrexato e com as combinações dos quimioterápicos com liraglutida. B) O gráfico do

tamanho dos tumores ao longo dos dias do tratamento pode ser representado de outra

maneira, onde a área abaixo da curva obtida no primeiro gráfico gera as barras encontradas no

segundo gráfico. Acima de cada barra, encontra-se uma foto de um exemplar de tumor de cada

categoria. * p <0,05, ** p <0,01 e *** p <0,001, quando comparados com aos controles. Fonte:

A autora (2018).

Não foi possível observar uma redução significativa no peso corpóreo

(FIGURA 17A), do fígado (FIGURA 17B), dos rins (FIGURA 17C), baço

(FIGURA 17D), pulmões (FIGURA 17E) ou na taxa glicêmica dos animais

tratados (FIGURA 17F), o que indica que os tratamentos não estão interferindo

em outros processos vitais.

72

FIGURA 17 – EFEITOS SISTÊMICOS DA LIRAGLUTIDA EM CAMUNDONGOS

Efeito da liraglutida ao longo dos tratamentos sobre o peso: A) corpóreo dos animais, B) fígado,

C) rins, D) baço, E) pulmões e sobre F) a taxa glicêmica dos animais. Os tumores avaliados

foram tratados com liraglutida, com os quimioterápicos PAC ou MTX, com a combinação dos

quimioterápicos com liraglutida ou veículos (que não receberam nenhum tipo de droga). * p

<0,05. Fonte: A autora (2018).

Para uma interpretação do possível efeito de liraglutida sobre a redução

do volume tumoral, foram realizadas análises histológicas deste tratamento.

Diferentes parâmetros foram avaliados seguindo a classificação de tumor de

Ehrlich já estabelecida (BARAKAT; ELSHAZLY; MAHMOUD, 2015). Foi

possível observar que os tratamentos com liraglutida foram capazes de

73

aumentar significativamente os níveis de necrose tumoral da classificação 1

(lesões entre 5 e 25% do tecido), observado no tumor controle, para o 2 (lesões

entre 26 e 50% do tecido), observado no tumor tratado com o liraglutida

(FIGURA 18).

FIGURA 18 – ANÁLISES HISTOLÓGICAS DOS TUMORES DE EHRLICH CONTROLES E

TRATADOS COM LIRAGLUTIDA.

Análises histológicas dos tumores de Ehrlich, controles e tratados com liraglutida. As imagens

mostram um exemplar de cada categoria. As lâminas dos tumores foram coradas com

hematoxilina e eosina, e os asteriscos brancos representam as áreas de necrose tumoral,

visíveis pelo enriquecimento com eosinofilia. Fonte: A autora (2018).

Os perfis moleculares a partir dos efeitos inibitórios de liraglutida no

crescimento tumoral foram quantificados a partir dos diferentes genes

relacionados com a apoptose, necrose e necroptose (FIGURA 19). Foi possível

identificar que o tratamento dos tumores com liraglutida reduziu

significativamente (p<0,001) a expressão dos genes: Bcl2, uma importante

proteína anti-apoptótica (ADAMS; CORY, 2018); VEGF, gene capaz de

promover angiogênese (GOEL; MERCURIO, 2013); PIK3, gene capaz de

regular vias importantes no desenvolvimento do câncer, como a ativação do

receptor mTOR importante na proliferação celular (FRUMAN; ROMMEL, 2014);

e RIPK3, gene relacionado ao processo de necroptose (NEWTON, 2015)

(FIGURA 19). Estes resultados sugerem que a liraglutida pode estar

promovendo a redução no volume tumoral nos animais por diminuir

74

significativamente a expressão de genes importantes para o desenvolvimento

de tumores e, consequentemente, aumentar os níveis de necrose celular, tal

como observado nas histologias.

FIGURA 19 – EFEITO DA LIRAGLUTIDA SOBRE A EXPRESSÃO DE GENES ASSOCIADOS

À MORTE CELULAR NOS TUMORES DE EHRLICH

Média da expressão gênica quantitativa nos tumores de Ehrlich após os tratamentos com

liraglutida. Os genes avaliados foram: Bax, Bcl2, VEGF, PIK3, Caspase 8 e RIPK3. *** p

<0,001, quando comparado ao controle. Fonte: A autora (2018).

5.7 AÇÃO DE LIRAGLUTIDA COMO UM POTENCIAL AGENTE

DESMETILANTE IN VIVO.

Para avaliar se o potencial da liraglutida como agente desmetilante

obtidos nas linhagens tumorais, também se aplicava aos tumores de Ehrlich, foi

avaliado o perfil de metilação dos genes CDH1 e ADAM33 em três tumores

murinos controle e tratados. Para tanto, o perfil de metilação do gene CDH1

foram avaliados por reações de MSP quantitativas (MSP-qPCR) (FIGURA 20).

Os resultados mostraram que os tumores de Ehrlich dos animais tratados com

a liraglutida reduziram significativamente a metilação do gene CDH1 quando

comparado aos controles (FIGURA 20). Este resultado é semelhante ao

encontrado nos experimentos in vitro, demonstrando o efeito desmetilante da

75

liraglutida tanto nas linhagens celulares quanto nos tumores mamários de

Ehrlich.

FIGURA 20 – EFEITO DA LIRAGLUTIDA SOBRE A METILAÇÃO DA REGIÃO PROMOTORA

DO GENE CDH1 NOS TUMORES DE EHRLICH

Análise dos efeitos de liraglutida por MSP-qPCR, sobre o perfil de metilação da região

promotora do gene CDH1. O gráfico representa a média da quantidade de fragmentos

metilados dos tumores de Ehrlich controles e tratados com liraglutida, apresentados na forma

de porcentagem (o valor do controle foi considerado como 100%). ** p <0,05, quando

comparado ao controle. Fonte: A autora (2018).

Para o gene ADAM33, estes mesmos tumores obtiveram a expressão

gênica, proteica e a clonagem da ilha de CpG do gene avaliado (FIGURA 21A).

A média da metilação da CGI de ADAM33 obtidas nos animais controles

passou de 70% para menos de 55% no grupo tratado com liraglutida (FIGURA

21B). Nestes mesmos tumores, foi possível identificar uma relação

inversamente proporcional entre o perfil de metilação e a expressão gênica de

ADAM33, onde os tumores controles apresentaram elevadas taxas de

metilação e baixa expressão, enquanto os tumores tratados com liraglutida

mostraram efeito oposto (FIGURA 21B). Além disso, através da

imunohistoquímica, os tumores tratados com liraglutida apresentaram a

expressão proteica de ADAM33 (FIGURA 21C), anteriormente negativa nos

tumores controles. Este resultado indica que os tratamentos com liraglutida

76

realizados nos tumores de Ehrlich permitiram a desmetilação do gene ADAM33

e a sua consequente expressão gênica e proteica.

FIGURA 21 – EFEITO DA LIRAGLUTIDA SOBRE A METILAÇÃO E EXPRESSÃO DE ADAM33

NOS TUMORES DE EHRLICH

A)

Efeitos da liraglutida sobre a metilação da região promotora do gene ADAM33 (na média) nos

tumores de Ehrlich. Após a clonagem e sequenciamento do gene, os 16 dinucleotídeos CpG

contidos na região avaliada foram representados em forma de círculos. A taxa metilação está

representada em uma escala de cinza, em forma crescente dos mais claros aos mais escuros,

conforme identificado na legenda. B) Representação gráfica do mesmo resultado de metilação

onde a porcentagem foi incluída à esquerda do gráfico, estando os controles e tratados em

barra vertical, a expressão gênica relativa de ADAM33 (murino) à direita, mostrado pela linha

de tendência em vermelho. C) Expressão proteica de ADAM33 a partir dos ensaios de

imunohistoquímica. A figura mostra um exemplo de cada categoria, onde a coloração marrom é

o sinal positivo para a presença da proteína. ** p <0,05, quando comparado ao controle. Fonte:

A autora; CAMPOS, F., 2018; MANICA, G.M. 2018.

77

Também foram realizadas avaliações do perfil global de metilação nos

tumores de Ehrlich antes e após tratamentos com liraglutida. Neste

experimento, o DNA pulmonar de camundongo foi utilizado como um controle

do perfil de metilação de uma célula normal, enquanto a linhagem de Ehrlich

(EAC) foi usada como controle do perfil de metilação de uma célula tumoral

(FIGURA 22). Os resultados mostraram que a linhagem de Ehrlich e as células

tumorais controles e tratadas estão significativamente mais desmetiladas que

as células pulmonares normais. Comparando a metilação da linhagem de

Ehrlich com a metilação dos tumores de Ehrlich (controles e tratados), também

foi observado uma significativa redução. Contudo, essa diferença não foi

encontrada entre os tumores controles e tratados com liraglutida (FIGURA 22).

FIGURA 22 – EFEITOS DA LIRAGLUTIDA SOBRE A METILAÇÃO GLOBAL DO GENOMA

DOS TUMORES DE EHRLICH

Perfil de metilação global do DNA nos tumores de Ehrlich. A média das porcentagens das

citosinas metiladas do genoma (% 5-mC) das células pulmonares normais, das linhagens de

Ehrlich antes da inoculação nos camundongos, dos tumores controles e tratados com

liraglutida. Os tumores controle ou tratados com liraglutida foram utilizados para calcular a

porcentagem de citosinas metiladas do genoma (% 5-mC). ** p<0,01, *** p<0,001, quando as

células tumorais são comparadas as células pulmonares. # p<0,05, ## p<0,01, quando o tumor

controle e tratado com liraglutida são comparados com a linhagem de Ehrlich. Fonte: A autora

(2018).

78

6 DISCUSSÃO

O câncer de mama é o mais diagnosticado e é a segunda causa de

morte por câncer entre as mulheres de todo o mundo. São estimados, apenas

para o ano de 2018, 2 milhões de novos casos de câncer de mama, sendo que

destes, quase 31% irão a óbito em consequência desta neoplasia (WORLD

HEALTH ORGANIZATION, 2018).

Entre todos os tipos de câncer de mama, 10 a 20% são representados

pelos tumores do tipo triplos negativos (TNG), definidos pela negatividade tanto

na expressão de receptores hormonais (RE e RP), quanto para a expressão

aberrante de HER2 (PEROU et al., 2000; SORLIE et al., 2001). Os TNGs são

mais agressivos que as outras neoplasias da mama, com maior probabilidade

de metástases e morte dentro dos 5 anos desde o diagnóstico (CAREY et al.,

2007; DENT et al., 2007; LIEDTKE et al., 2008; TSENG et al., 2013). Um dos

pontos que contribuem para um pior prognóstico neste tipo de câncer é a falta

de alvos terapêuticos específicos como as terapias hormonais e o

trastuzumabe (CAREY et al., 2007; LIEDTKE et al., 2008; TSENG et al., 2013).

Atualmente, o tratamento padrão para este tipo de câncer é a quimioterapia, no

entanto, muitos tumores se mostram resistentes e recidivam rapidamente após

o tratamento, principalmente por apresentarem instabilidade genômica e

alterações na expressão de genes envolvidos com a resistência (WEIN; LOI,

2017). Desta forma, fica evidente a importância de mais estudos que ofereçam

melhores opções de tratamento ou de qualidade de vida das pacientes com

tumores do tipo triplos negativos (COLLIGNON et al., 2016).

A necessidade desta busca por novas estratégias terapêuticas do

câncer, incluindo aos TNG, leva a uma proposta interessante conhecida como

substituição ou reaproveitamento de drogas, a qual se trata da aplicação de um

tratamento existente a uma outra indicação de doença (OPREA; BAUMAN;

BOLOGA, 2011). Esta abordagem apresenta diversas vantagens, dentre elas,

o fato de o medicamento já possuir estudos farmacológicos, famacotécnicos e,

por vezes, clínicos já devidamente estabelecidos, levando a uma rápida

introdução no novo tratamento a um custo menor que ao desenvolvimento de

novos fármacos (CORSELLO et al., 2017).

79

A obesidade e o DM2 têm sido associados a um aumento no risco de

desenvolver câncer de mama ao longo dos últimos anos (LARSSON;

MANTZOROS; WOLK, 2007; ERICKSON et al., 2011; KARLSTAD et al., 2013;

LUO et al., 2014; BRONSVELD et al., 2015, 2017), bem como têm sido

associados a um aumento na tendência de desenvolver mais o subtipo TNG

(WOLF et al., 2006; GILLESPIE et al., 2010; BRONSVELD et al., 2017). Os

análogos de GLP-1, utilizados no tratamento do DM2, em um primeiro

momento, chamaram atenção de pesquisadores por suas supostas

capacidades proliferativas, sendo associados como possíveis promotores do

câncer. Contudo, ao contrário do que se temia, extensas revisões da literatura

não comprovaram indícios de atividade carcinogênica ou inflamatória dos

análogos de GLP-1 (GILBERT; PRATLEY, 2009; RUSSELL-JONES, 2009;

VANGOITSENHOVEN; MATHIEU; VAN DER SCHUEREN, 2012; NAUCK;

FRIEDRICH, 2013; LAMONT; ANDRIKOPOULOS, 2014), não sendo, portanto,

associados ao aumento de risco no desenvolvimento de câncer de pâncreas

(ZHAO et al., 2014, AZOULAY et al., 2016) sendo, inclusive, demonstrados

como pró-apoptóticos seletivamente para as células tumorais, como no caso

das linhagens de câncer de mama (LIGUMSKY et al., 2012; FIDAN-YAYLAL et

al., 2016). A exenatida, um dos análogos de GLP-1, em particular, foi descrita

como inibidora da proliferação de células tumorais de mama in vivo

(LIGUMSKY et al., 2012), bem como mais recentemente na inativação de

enzimas DNMTs em células pulmonares (YASUDA et al., 2016). Esta mesma

droga demonstrou uma atividade seletiva na redução da viabilidade de células

tumorais de próstata, ocasionando a apoptose pelo aumento dos níveis de

AMP cíclico (LI et al., 2017b).

A liraglutida faz parte de uma nova geração de análogos ao GLP-1, pois

sofreram alterações moleculares que dificultam sua degradação (RUSSELL-

JONES, 2009). Diante disso, seu tempo de meia vida foi aumentado,

melhorando a vida de pacientes com DM2, com a aplicação de apenas uma

aplicação diária do medicamento (NOVO NORDISK PHARMACEUTICALS PTY

LIMITED, ; RUSSELL-JONES, 2009; DRUCKER; DRITSELIS; KIRKPATRICK,

2010a; TASYUREK et al., 2014). O papel antiproliferativo da liraglutida foi

descrito nas células da próstata (LI et al., 2017b) e no câncer de pâncreas

(ZHAO et al., 2014), mas seu potencial como fármaco antineoplásico e seu

80

possível uso como adjuvante nas terapias tradicionais contra o câncer ainda

não são explorados. Desta maneira, neste estudo foram utilizadas três

linhagens celulares de mama: a MCF7, do tipo luminal B, MDA-MB-231 e MDA-

MB-436, células do tipo triplo negativas; assim como um modelo de câncer de

mama de camundongos para verificar as alterações epigenéticas e os

possíveis efeitos antitumorais de liraglutida, com o foco principal nos tumores

do tipo TNG.

A partir dos resultados obtidos pelos ensaios de colônia, curva de

crescimento e wound healing, foi demonstrado que a liraglutida inibiu a

proliferação (FIGURA 7) e a migração de células tumorais de mama (FIGURA

8). A linhagem celular luminal MCF7 não possui capacidade de migração

(NEVE et al., 2009), mas pode ser induzida com o uso de EGF, um conhecido

indutor de transição epitélio mesenquima (TEM) (LU et al., 2001; LIAO et al.,

2017). O mecanismo pelo qual EGF induz a TEM é a partir da fosforilação e

consequente ativação da via Smad2/3. Quando ativadas, as proteínas Smad2 e

3 formam um complexo com a Smad4, que então se desloca para o núcleo.

Este complexo ativa a transcrição de Snail, Slug, Zeb e o Twist, que auxiliam

na regulação de genes importantes no destino da célula (MASSAGUÉ, 2008;

TAM; WEINBERG, 2013). Estes fatores de transcrição são importantes na

ativação da TEM no câncer de mama por inibirem a expressão de E-caderina e

ativarem a expressão de vimentina e fibronectina (SMITH; ODERO-MARAH,

2012; TAM; WEINBERG, 2013; LAMOUILLE; XU; DERYNCK, 2014),

promovendo, assim, um aumento da invasão e migração celular em linhagens

tumorais de mama, como a MCF7 (KIM et al., 2016).

Curiosamente, os resultados mostraram que a migração ocasionada

pelo EGF foi revertida pelos tratamentos com 5Azadc e com liraglutida

(FIGURA 8A). Desta maneira, formulamos a hipótese de que a liraglutida pode

estar interferindo na via de ativação de Smad2/3. Sabe-se que a metilação do

DNA é um dos mecanismos mais utilizados para regular a expressão de genes

de miRNAs (MORALES; MONZO; NAVARRO, 2017), e o potencial

desmetilante de liraglutida pode estar contribuindo com aumento da expressão

destes genes de miRNAs que interferem na via de Smad2/3. Por exemplo, o

miRNA-181b é uma importante molécula regulada por metilação (ZHAO et al.,

2016) relacionada com o silenciamento de Smad2/3 (WANG et al., 2015; ZHOU

81

et al., 2016). Desta maneira, a liraglutida poderia estar revertendo os efeitos de

EGF devido a desmetilação do miRNA-181b, silenciamento de Smad2/3 e,

como consequência, levar a restauração na expressão de E-caderina.

Da mesma maneira, os tratamentos com liraglutida realizados nas

linhagens celulares mesenquimais MDA-MB-231 e MDA-MB-436, modelos bem

descritos como triplos negativos de câncer de mama, tiveram a diminuição na

migração celular (FIGURA 8B e C). Sendo assim, fica evidente o potencial

antiproliferativo e antimigratório da liraglutida em linhagens mesenquimais de

mama, tais como a MDA-MB-231 e a MDA-MB-436, ou em linhagens que

adquiriram características mesenquimais após tratamento com EGF, como a

MCF7. Além disso, foram feitos ensaios preliminares em modelos de invasão

3D (realizados pelo colaborador Erico Costa, no instituto Sírio Libanês em São

Paulo) que mostraram que a liraglutida foi capaz de reduzir a velocidade e a

invasão da linhagem MDA-MB-436 (estes resultados estão em preparação para

o artigo que resultará desta tese).

Para avaliar o efeito da liraglutida como potencial droga adjuvante na

terapia do câncer de mama, foram feitos ensaios com conhecidas drogas

quimioterápicas. O paclitaxel (PAC) recebeu atenção considerável devido à sua

atividade antitumoral contra uma variedade de tumores (KELLOKUMPU-

LEHTINEN et al., 2013), e é descrito atualmente pela American Cancer Society

como uma das drogas mais comuns utilizadas para quimioterapia adjuvante e

neoadjuvante no tratamento do câncer de mama (AMERICAN CANCER

SOCIETY, 2017). Este quimioterápico é capaz de promover agregação das

proteínas tubulinas, interferindo na formação dos microtúbulos e inibindo a

dinâmica normal da rede de microtúbulos essencial para as funções celulares,

em especial para a divisão celular (WEAVER, 2014). Porém, muitos efeitos

adversos estão associados à administração de paclitaxel, incluindo reações de

hipersensibilidade, mielossupressão, bradicardia, hipotensão, neuropatia

periférica, mialgias, artralgia, náusea, diarreia, mucosite e alopecia

(MARUPUDI et al., 2007). Outro importante quimioterápico utilizado no

tratamento do câncer é o metotrexato (MTX), um antimetabólito capaz de

interferir no metabolismo do ácido fólico, inibindo a di-hidrofolato redutase

(DHFR) de converter o ácido di-hidrofólico em ácido tetra-hidrofólico, processo

indispensável para a síntese de timinas (CHAN; CRONSTEIN, 2013). É

82

amplamente utilizado na quimioterapia do câncer desde 1948 (WU et al., 2010)

em tumores como leucemia, mama, ovário e trato intestinal, além de outros

tipos de câncer (AMERICAN CANCER SOCIETY, 2017). Assim como o PAC, o

MTX também causa significativa toxicidade ao organismo, o que não apenas

pode levar a interrupção do tratamento do câncer, por resultados

anticancerígenos inferiores, mas também pode levar à morbidade e

mortalidade ocasional (HOWARD et al., 2016). Em vista disso, uma redução na

toxicidade desses quimioterápicos, promovida pela combinação com diferentes

compostos, pode se revelar uma ótima estratégia no tratamento e bem-estar de

pacientes com câncer (BLUMENSCHEIN et al., 2011). Nos experimentos

realizados neste estudo, os quimioterápicos PAC e MTX levaram a uma

diminuição do crescimento de linhagens tumorais de mama.

Surpreendentemente, quando combinados com liraglutida, foi observado

também uma redução no crescimento celular mais efetivo e, incluindo, em

linhagens tumorais do tipo TNG (FIGURA 9). Isto significa que, em combinação

com o PAC ou MTX, a liraglutida apresenta um efeito adjuvante na terapia

celular, permitindo a redução das doses utilizados dos quimioterápicos sem

perda de eficácia in vitro, incluindo em células do tipo TNG.

Em termos de expressão gênica, os tratamentos realizados com a

liraglutida foram capazes de causar um aumento significativo na expressão de alguns genes envolvidos com o processo de TEM, tais como o CDH1; ou de

genes envolvidos com a caracterização do perfil de tumores do tipo TNG, como

o ESR1, PGR e ADAM33 (FIGURA 10).

O gene CDH1 codifica a proteína E-caderina, uma importante molécula

de adesão célula-célula encontrada classicamente nas células epiteliais. A

diminuição da expressão ou função da E-caderina foi detectada em vários tipos

de câncer e está relacionada com características patológicas, tais como a

diferenciação deficiente do tumor, crescimento infiltrativo, metástase linfonodal

e diminuição da sobrevida dos pacientes (TOMASKOVIC-CROOK;

THOMPSON; THIERY, 2009; MICALIZZI; HABER; MAHESWARAN, 2017).

Essas alterações ou a perda de função da E-caderina durante a progressão do

tumor, podem ser causadas por vários mecanismos genéticos e epigenéticos

(CAVALLARO; CHRISTOFORI, 2004; DONG et al., 2012; TAM; WEINBERG,

2013) e a sua presença suprime a tumorigenicidade e a disseminação do tumor

83

através do seu papel na organização de tecidos (VAN ROY; BERX, 2008; VAN

ROY, 2014), enquanto a sua baixa expressão é considerada como um passo

chave no processo da TEM (LEE et al., 2008). O tratamento com liraglutida

levou a um aumento significativo na expressão de CDH1 nas três linhagens

celulares de câncer da mama estudadas (FIGURA 10). Sabe-se há muito

tempo que a metilação do DNA está associada à regulação da expressão

gênica (BIRD, 1984), e, portanto, é possível perceber que este aumento na

expressão de CDH1 se deu graças a uma desmetilação causada pela

liraglutida (FIGURA 11A, B e C). Como consequência, também foi possível

encontrar um aumento da expressão proteica de E-caderina (FIGURA 11E e

F). Estes resultados de metilação ou expressão proteica não foram

encontrados na linhagem MCF7, e isso se explica pelo fato desta linhagem já

apresentar o gene CDH1 desmetilado e com alta expressão de E-caderina

(HIRAGURI et al., 1998; CHAO; SHEPARD; WELLS, 2010). Já nas linhagens

do tipo triplo negativo (MDA-MB-231 e MDA-MB-436) a desmetilação de CDH1

e a expressão de E-caderina ficou bastante evidente nas células tratadas. A

importância deste resultado se resume nas funções desta proteína, onde a

expressão ectópica de E-caderina nas células do tipo TNG resulta em uma

reversão, em algum grau, do fenótipo epitelial, particularmente no que diz

respeito à supressão funcional da migração (CHAO; SHEPARD; WELLS,

2010).

O tratamento com liraglutida também proporcionou o aumento, em todas

as linhagens, da expressão gênica, da desmetilação e da expressão proteica

de ADAM33 (FIGURA 10 e 12). Em nosso grupo de pesquisa, evidenciamos

que o gene ADAM33 é regulado por metilação do DNA e, portanto, entrou na

categoria gene supressor de tumor (SENISKI et al., 2009), sendo um

importante marcador molecular de carcinomas mamários (MANICA et al.,

2013). Baixos níveis de ADAM33 foram associados com tumores TNG, com

diminuição na sobrevida global e na sobrevida livre de metástase, o que mostra

o importante papel desta proteína na biologia do câncer de mama (MANICA et

al., 2017). Sabendo que membros da família de proteínas ADAM estão

envolvidos em processos como a adesão celular (ETO et al., 2002; HUANG,

2005), a presença da ADAM33, após o tratamento com liraglutida, pode estar

84

contribuindo para um comportamento menos agressivo das células, como

inclusive observado pela diminuição na migração celular (FIGURA 8).

Tratamentos de linhagens tumorais de mama com liraglutida estão

levando a uma desmetilação dos genes CDH1 e ADAM33, o que proporciona

um aumento na sua expressão gênica e proteica. Desta forma, células com

características mesenquimais transitam para características epiteliais,

resultando em uma redução da migração e malignidade celular. Sabe-se que a

metilação do DNA desempenha um papel fundamental no controle da TEM

(WANG; SHANG, 2013), promovendo a repressão de genes epiteliais chaves,

como o CDH1. A transição de uma célula epitelial a uma célula mesenquimal

ocorre aos poucos, em diferentes estágios, onde a presença de sinais

promotores da TEM devem ser constantes para que a conversão ocorra por

completo (TAM; WEINBERG, 2013). Desta maneira, durante o processo da

TEM, é possível encontrar uma heterogeneidade celular, com proteínas e

características classicamente epiteliais e classicamente mesenquimais,

coexistindo em um grupo celular até que a transição seja completa

(CARDENAS et al., 2014). Os mesmos mecanismos descritos ocorrem no

processo inverso, conhecido como TME (TAM; WEINBERG, 2013). Pode-se

dizer então, que a liraglutida estaria estimulando o início da transição

mesênquima-epitélio (TME) em linhagens de câncer de mama, incluindo as do

tipo triplo negativo, levando as células mesenquimais aos estágios

intermediários mais próximos das células epiteliais.

A liraglutida foi capaz de aumentar não só a expressão dos genes CDH1

e ADAM33, mas também dos ESR1 e PGR (FIGURA 10). Foi possível observar

que, após o tratamento com liraglutida, a linhagem MCF7 mostrou um aumento

significativo na expressão destes genes, e as linhagens MDA-MB-231 e MDA-

MB-436 passaram a expressá-los.

Os receptores estrogênicos (REs) são uma família de receptores

nucleares que controlam as respostas celulares ao estrógeno. Existem duas

diferentes formas de RE, geralmente referidas como REα e REβ, codificadas

pelos genes ESR1 e ESR2, respectivamente. A REα é a isoforma dominante

expressa nos tecidos da mama e ovário (ZHANG et al., 2013) e a avaliada

neste estudo. Os tumores mamários que apresentam alta expressão de REα

estão relacionados com melhor prognóstico do paciente, com menor

85

agressividade tumoral e melhor resposta às terapias anti-estrogênicas

(HERVOUET et al., 2013). O tratamento com liraglutida proporcionou um

aumento de ESR1 na linhagem tumoral MCF7 e, mais surpreendentemente,

estimulou a expressão deste receptor nas linhagens do tipo TNG MDA-MB-231

e MDA-MB-436 (FIGURA 10). Este aumento na expressão foi semelhante ao

encontrado pelo agente desmetilante 5Azadc, mais uma vez sugerindo o papel

desmetilante in vitro de liraglutida, uma vez que o gene ESR1 é regulado por

metilação do DNA (OTTAVIANO et al., 1994; CHAMPAGNE; CURLEY, 2009).

A ilha de CpG no promotor de ESR1 é altamente metilada em linhagens

celulares tumorais de mama negativas para REα (OTTAVIANO et al., 1994;

LAPIDUS et al., 1996), como a MDA-MB-231 e a MDA-MB-436, e a liraglutida

parece estar revertendo essa metilação.

Resultados similares foram encontrados para o RP, onde tratamentos

com liraglutida levaram a um aumento de expressão na linhagem MCF7, e as

linhagens MD-MB-231 e MDA-MB-436 passaram a expressá-lo (FIGURA 10).

O gene do RP, assim como o RE, também é regulado por metilação do DNA

(LAPIDUS et al., 1996) e, portanto, possivelmente foi desmetilado após

tratamento com o liraglutida.

A possibilidade de induzir a expressão de RE e PR em células

cancerosas negativas para estes marcadores têm sido um potencial atrativo

para o uso da terapia hormonal (WOODFIELD et al., 2009). A terapia hormonal

com o tamoxifeno oferece um tratamento bem tolerado para o câncer de mama

(TREMONT; LU; COLE, 2017), mas sua eficácia é restrita a um conjunto de

tumores que expressam o receptor de estrógeno α (REα) (WOODFIELD et al.,

2009). Baixas expressões de RP estão significativamente associadas aos

piores desfechos nos tratamento com tamoxifeno (PATHIRAJA et al., 2011).

Apesar do tamoxifeno ser um bloqueador hormonal de RE, seu efeito sobre

tumores negativos para RP pode estar relacionado ao fato de que o RP é

classicamente regulado pelo estrógeno (NARDULLI et al., 1988; READ et al.,

1988). Portanto, o tratamento com liraglutida, possivelmente por desmetilação,

se comprovado, levaria a uma expressão de RE e PR em linhagens do tipo

TNG, o que poderia implicar em bons resultados aos tratamentos hormonais.

Diante dos resultados de desmetilação encontrados nos genes CDH1,

ADAM33 e, possivelmente nos genes ESR1 e PGR, foi avaliado o potencial

86

deste fármaco diante da desmetilação global do genoma, e se verificou que a

liraglutida é capaz de gerar uma desmetilação global, tão ou mais eficiente que

a gerada pelo conhecido agente desmetilante do DNA 5Azadc (FIGURA 13)

(BOUCHARD, 1989). Essa redução na metilação, causada pela liraglutida, não

está associada a uma redução na transcrição ou na expressão proteica de

DNMTs (FIGURA 14), as enzimas responsáveis pela realização da metilação

do DNA (NAKAO, 2001; BIRD, 2002). Estes resultados são similares aos do

tratamento com 5Azadc, onde também não foram encontradas alterações na

transcrição ou expressão proteica de DNMTs (FIGURA 14). Já foi descrito na

literatura que linhagens tumorais de mama, como a MDA-MB-231, tratadas por

sete dias com 5Azadc, também não apresentam alterações na transcrição dos

genes de DNMTs. Porém, diferentemente do que encontramos, há uma

diminuição na expressão proteica, tendo em vista que 5Azadc é capaz de levar

a proteína DNMT a degradação (YU et al., 2018). Esta diferença na expressão

proteica pode estar relacionada aos tempos dos tratamentos com 5Azadc,

onde no estudo citado foram de dias e neste trabalho foram de apenas 24

horas.

Avaliou-se então a ação da liraglutida sobre a atividade das DNMTs e,

surpreendentemente, foi encontrado uma diminuição significativa em todas as

linhagens estudadas, em nível bastante semelhante ao encontrado nos

tratamentos com 5Azadc (FIGURA 15A). Diante disto, fica evidente perceber

que, em 24 horas de tratamento, a liraglutida foi capaz de desmetilar

globalmente o genoma das linhagens tumorais de mama, a partir de uma

diminuição na atividade das enzimas que metilam o DNA, as DNMTs (FIGURA

15A). Os ensaios de inibição também demonstraram resultados importantes,

onde a diminuição da atividade das enzimas DNMTs deve-se a uma interação

direta da molécula liraglutida com a enzima, bloqueando-a (FIGURA 15B).

Os níveis de DNMTs, especialmente das DNMT3b, DNMT3a e DNMT3L,

estão frequentemente aumentados em várias linhagens tumorais de diferentes

tipos de câncer, como o de cólon (EL-DEIRY et al., 1991), de próstata (PATRA

et al., 2002), de mama (GIRAULT et al., 2003; GIRAULT; LIDEREAU; BIE,

2003), fígado (OH et al., 2007) e nas leucemias (CHEN et al., 1999). Por outro

lado, a inibição destas enzimas demonstrou redução na formação de tumores,

o que pode ser explicado parcialmente pela consequente desmetilação de

87

genes supressores de tumor (SUBRAMANIAM et al., 2014). Desta forma, é

possível notar que a liraglutida foi capaz de bloquear diretamente as enzimas

DNMTs, reduzindo suas atividades, levando a uma desmetilação global

incluindo de genes supressores de tumor e consequente redução da

malignidade em linhagens tumorais.

As enzimas DNMTs localizam-se principalmente no núcleo celular, onde

podem atuar na metilação sobre a molécula de DNA (JIN et al., 2012). Logo,

para que a liraglutida seja capaz de inibir diretamente estas enzimas, é

necessário o seu deslocamento para o interior da célula e, posteriormente, para

o núcleo. O GLP-1 e seus análogos, como o liraglutida, são incorporados às

células a partir do uso do receptor específico RGLP1, ou a partir do uso de

receptores alternativos (CANTINI; MANNUCCI; LUCONI, 2016). Na literatura,

descreve-se que as linhagens tumorais de mama MCF7 e MDA-MB-231

apresentam expressão proteica de RGLP1 (IWAYA et al., 2017), indicando o

caminho de entrada do fármaco liraglutida. Uma vez no citoplasma, a liraglutida

poderia estimular a internalização do receptor RGLP-1, uma vez que as células

expostas a GLP-1, ou até a exenatida, apresentam esse comportamento

(GUPTA et al., 2010a). Já é bem descrito na literatura o tráfego celular de

RGLP-1 (SYME; ZHANG; BISELLO, 2006; JONES et al., 2018), inclusive, sua

possível localização na membrana nuclear da célula (GOBEIL et al., 2006;

BROIDE et al., 2013), indicando a viabilidade da hipótese de ação direta do

liraglutida sobre as enzimas DNMTs. Portanto, linhagens tumorais de mama

submetidas ao tratamento com liraglutida podem incorporá-lo a partir do RGLP-

1 e/ou outros receptores alternativos, induzir a internalização dos mesmos até

a membrana nuclear da célula, e desenvolver seu papel inibitório sobre as

enzimas DNMTs, gerando uma desmetilação global do genoma.

Finalmente, o estudo in vivo mostrou o potencial de liraglutida sobre a

redução da malignidade em tumores sólidos de origem mamária em

camundongos. O tumor de Ehrlich é um modelo de carcinoma mamário murino

bem estabelecido em estudos da biologia tumoral da mama. É primeiramente

cultivado na forma de ascite (EAC), para então ser inoculado no animal e

desenvolver a forma tumoral (MISHRA et al., 2018). Os resultados com os

tumores de Ehrlich mostraram que o tratamento de animais com PAC e MTX

foram capazes de reduzir significativamente os tamanhos dos tumores, de

88

maneira similar ao tratamento com liraglutida (FIGURA 16). Um importante

resultado encontrado foi o da combinação da liraglutida com metade da dose

das drogas quimioterápicas clássicas, o que resultou em uma redução no

volume do tumor tão significativa quanto a encontrada em doses completas do

tratamento (FIGURA 16). Este resultado foi similar ao encontrado nos

experimentos in vitro realizados nas linhagens tumorais de mama (FIGURA 9),

e reforça a ideia de que mesmo com o uso reduzido de quimioterapia, a

combinação do tratamento com liraglutida assegura um resultado igualmente

eficiente na redução do volume do tumor. Essa redução no uso de

quimioterápicos é muito benéfica tanto economicamente, clinicamente quanto

para a qualidade de vida dos pacientes, considerando todos os efeitos

colaterais causados por PAC e MTX já descritos (HOWARD et al., 2016; TAO;

VISVANATHAN; WOLFF, 2016). O tratamento com liraglutida não levou a uma

redução significativa no peso de órgãos como o fígado, rins, baço, pulmões e

no peso corporal dos animais (FIGURA 17), indicando que os tratamentos não

causaram mudanças macroscópicas no restante do organismo.

A partir de análises histológicas, foi observado que o tratamento com

liraglutida aumentou os focos necróticos nos tumores (FIGURA 18), indicando

uma possível causa para a redução nos tamanhos dos tumorais. As análises

moleculares destes tumores mostraram resultados compatíveis, onde, após o

tratamento com liraglutida, observou-se um aumento na expressão de genes

associados a redução da viabilidade celular, incluindo genes que induzem a

necrose, como o VEGF (FIGURA 19). A liraglutida foi capaz de reduzir a

expressão dos genes Bcl2, PIK3, RIPK3 e VEGF nos tumores de Ehrlich

analisados. O gene Bcl2 foi o primeiro descrito na literatura com a função de

inibir apoptose (SENTMAN et al., 1991), e sua superexpressão está associada

a um pior desenvolvimento tumoral (ADAMS; CORY, 2018). O gene PIK3, em

células normais, desempenha papeis reguladores na sobrevivência celular,

proliferação e diferenciação (VANHAESEBROECK; VOGT; ROMMEL, 2010),

porém, sua expressão aberrante tem sido amplamente associada ao

aparecimento de cânceres (FRUMAN; ROMMEL, 2014). O gene RIPK3 está

associado a programação da necroptose celular (MORIWAKI; CHAN, 2013).

Por fim, o gene VEGF foi identificado como capaz de gerar angiogênese tanto

fisiológica como patológica (LEUNG et al., 1989), e sua expressão tem sido

89

descrita como um processo chave no desenvolvimento de tumores (KIERAN;

KALLURI; CHO, 2012; GOEL; MERCURIO, 2013). Diante das diferentes

funções descritas, fica evidente perceber que a liraglutida leva a diminuição na

expressão destes genes e, consequentemente, a uma diminuição no tamanho

tumoral.

Dentre os genes destacados, chama atenção a diminuição na expressão

de VEGF, por ser descrito como essencial no desenvolvimento de tumores

(GOEL; MERCURIO, 2013). Com a função de estimular principalmente a

angiogênese, a expressão de VEGF acaba conferindo características de

autossuficiência ou autonomia às células tumorais, uma consideração

altamente relevante para a biologia de tumores agressivos (CAO et al., 2012) .

Portanto, a falta deste gene é um importante indutor de necrose tumoral

(BOUDREAU; MYERS, 2003), característica encontrada nas histologias dos

tumores tratados com liraglutida (FIGURA 18). Nas análises in vivo, foi

observado uma diminuição significativa na sua expressão gênica (FIGURA 19).

Nos tumores estudados, a liraglutida pode ter levado a desmetilação de

importantes miRNAs, que consequentemente, levaram ao bloqueio dos genes

avaliados, como o VEGF. Afinal, sabe-se que a metilação do DNA é um dos

mecanismos mais utilizados para regular a expressão de miRNAs (MORALES;

MONZO; NAVARRO, 2017). Na literatura diversos miRNAs são descritos como

regulados por metilação, capazes de inibir a expressão de VEGF (DANG;

LAWSON; FISH, 2013; SUN et al., 2015; LU et al., 2017). Entre eles, destaca-

se o miR-140-5p, molécula capaz de se ligar ao VEGF e inibir a invasão e

angiogênese em câncer de mama (LU et al., 2017).

Nas análises específicas sobre o potencial desmetilante da liraglutida in

vivo, houve uma diminuição significativa na condição metilada do gene CDH1

(FIGURA 20), e na região promotora do gene ADAM33 e, no seu respectivo

aumento de expressão gênica e proteica (FIGURA 21). Os genes ESR1 e PGR

deste modelo de tumor animal não são silenciados e, portanto, não estão

sendo citados. Estes resultados demonstram que tratamentos com liraglutida,

tanto em linhagens tumorais de mama quanto em tumores de Ehrlich, podem

estar contribuindo para a diminuição da agressividade celular pelo aumento na

expressão de genes como o CDH1 e ADAM33.

90

Numa análise global do perfil de metilação do ensaio in vivo, foi possível

ver que as células de um tecido normal, como o pulmão, têm uma taxa de

metilação significativamente maior do que células tumorais, sejam elas na

forma de linhagem ou na forma de tumor (FIGURA 22). A linhagem de Ehrlich

mostrou-se significativamente mais metilada do que os tumores, porém, não foi

possível encontrar nenhuma diferença entre os tumores tratados com liraglutida

e controles (FIGURA 22). Os padrões de metilação do DNA não são

distribuídos aleatoriamente pelo genoma, diferentes regiões, incluindo DNA

repetitivo, são hipermetiladas, enquanto outras regiões, como as ilhas de CpG,

são hipometiladas (YODER; WALSH; BESTOR, 1997). Em contraste, o padrão

de metilação em uma célula cancerosa é caracterizado por grandes mudanças

no perfil de metilação (JONES; LAIRD, 1999), onde a maior parte do genoma

torna-se hipometilada (CLARK; MELKI, 2002). Em vista disso, a diferença no

perfil global de metilação encontrada entre as células normais do pulmão e as

células tumorais era esperada. Inclusive, esta pode ser também a explicação

para a falta de diferença entre a metilação dos tumores tratados ou não com

liraglutida. A partir do momento em que a linhagem tumoral de Ehrlich foi

inoculada nos animais controles, os tumores começaram a se desenvolver e se

tornaram hipometilados, levando em conta que a malignidade tumoral está

associada à hipometilação do DNA (CLARK; MELKI, 2002). Por outro lado, os

tumores que receberam tratamento com liraglutida, mostraram um perfil de

desmetilação devido à inibição das DNMTs, como descrito nos experimentos in

vitro. Avaliações de atividade e inibição foram realizadas em DNMTs de

linhagens tumorais de mama humanas, porém, este mesmo raciocínio pode ser

extrapolado para as DNMTs dos tumores de Ehrlich de camundongos, tendo

em vista se tratar de enzimas extremamente conservadas nos mamíferos

superiores (LYKO, 2018). Portanto, os tumores controles ou tratados com o

liraglutida mostraram perfis de desmetilação similares, porém, por razões

diferentes, seja pela hipometilação característica de tumores ou pela inibição

das DNMTs. Entretanto, ao analisar o perfil individual de metilação de genes

importantes para o desenvolvimento do tumor, como CDH1 e ADAM33, ficou

claro que a liraglutida está ocasionalmente gerando desmetilação apropriada

para um melhor prognóstico do tumor, o que culmina no aumento de necrose

tumoral.

91

Diante do exposto, neste trabalho foi possível identificar o potencial do

fármaco liraglutida como agente desmetilante do DNA, tendo em vista a

desmetilação gerada nos genes avaliados, o aumento das suas expressões, a

redução da atividade das DNMTs e da malignidade de linhagens tumorais de

mama, incluindo as do tipo TNG, e dos tumores de Ehrlich. Diante desse efeito,

pela primeira vez na literatura, pode-se atribuir a liraglutida o potencial de

medicamento antineoplásico, tendo efeitos similares aos gerados por outras

drogas desmetilantes utilizadas na clínica de pacientes oncológicos, como o

5Azadc (Decitabine) (BROWN; PLUMB, 2004; SABA, 2007; LI et al., 2017a).

Vários estudos com modelos animais e linhagens celulares indicaram que o

decitabine, por hipometilação do DNA, induz a expressão de genes que

controlam a apoptose e o ciclo celular (NIE et al., 2014). Diante de seus efeitos,

esta droga foi aprovada no tratamento de diferentes malignidades (LI et al.,

2017a), sendo amplamente utilizada no tratamento de síndromes

mielodisplásicas (SABA, 2007; BORTHAKUR et al., 2008) e, mais

recentemente, no tratamento de tumores sólidos (YU et al., 2018). Entretanto, o

decitabine é bastante tóxico e causa vários efeitos indesejáveis (HOWELL; LIU;

KHONG, 2010), o que intensifica a importância de sua substituição por um

fármaco menos agressivo e com efeitos similares, como a liraglutida. Além

disso, o uso de liraglutida pode trazer benefícios para pacientes com câncer de

mama, incluindo os do tipo TNG, permitindo a redução de doses de

quimioterapia sem a perda da eficiência.

92

7 CONCLUSÕES

A partir dos resultados obtidos neste trabalho, é possível sugerir o uso

de liraglutida, um medicamento já consagrado no tratamento do diabetes

mellitus tipo 2, como um novo inibidor epigenético no tratamento do câncer de

mama. Atuando diretamente sobre as enzimas DNMTs, é capaz de diminuir

sua atividade e levar a uma desmetilação global do genoma. Como

consequência, se observa um aumento na expressão gênica e proteica,

incluindo de genes importantes para a redução da malignidade celular, como o

CDH1 e ADAM33. Observou-se também que a liraglutida foi capaz de induzir a

expressão de ESR1 e PGR em células tumorais do tipo TNG, o que pode

implicar em um potencial atrativo para o uso de terapia hormonal. Diante disso,

a liraglutida mostrou seu potencial com efeitos anti-proliferativo e anti-

migratório em linhagens tumorais de mama, incluindo as do tipo TNG.

Seus efeitos também foram observados em tumores de Ehrlich in vivo,

onde houve a redução no tamanho tumoral, possivelmente ocasionado por uma

diminuição na expressão de genes como o VEGF, e consequente necrose

celular. Além disso, com os resultados encontrados, sugerimos que a liraglutida

pode ser utilizada como adjuvante à quimioterapia no tratamento de pacientes

oncológicos, permitindo a redução da dose dos quimioterápicos sem a redução

na eficiência do tratamento, tanto in vitro quanto in vivo. Por ser menos tóxico

que outras drogas desmetilantes utilizadas na clínica, o uso do liraglutida pode

trazer grandes avanços não só na clínica do tratamento de câncer de mama,

como no aumento na qualidade de vida dos pacientes.

Contudo, mais estudos são necessários para compreender os efeitos da

liraglutida no genoma e para investigar sua potencial utilidade clínica como

uma terapia adjuvante durante o tratamento do câncer de mama,

especialmente no tratamento do tipo TNG. A partir desses dados, inéditos na

literatura, propõe-se aqui, a utilização da liraglutida na terapia de pacientes

diabéticas com tumores de mama do subtipo TNG.

93

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