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Aula 11 – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

Julio C. J. Silva

Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF) Instituto de Ciências Exatas

Depto. de Química

Juiz de Fora, 2014

QUI 070 – Química Analítica V Análise Instrumental

Introdução • Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é o tipo mais versátil e

mais amplamente empregado de cromatografia por eluição.

• Na cromatografia líquida, a fase móvel é um solvente líquido, o qual contém a amostra na forma de uma mistura de solutos.

• O tipo de cromatografia líquida de alta eficiência é geralmente definido pelo mecanismo de separação ou pelo tipo de fase estacionária:

• (1) partição ou cromatografia líquido-líquido;

• (2) adsorção ou cromatografia líquido-sólido;

• (3) troca iônica ou cromatografia de íons;

• (4) cromatografia por exclusão;

• (5) cromatografia por afinidade;

• (6) cromatografia quiral.

• A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) tornou-se uma ferramenta analítica indispensável. Os laboratórios

• criminais e os programas de televisão policiais e forenses, como CSI, CSI Miami, Crossing Jordan e Law and Order, freqüentemente empregam a CLAE no processo de obtenção de evidências criminais.

Introdução

• Nos anos de 1960 que se desenvolveu a tecnologia para produzir e utilizar recheios com diâmetros de partículas tão pequenos como 3 a 10 µm.

• O termo cromatografia líquida de alta eficiência é sempre empregado para distinguir essa tecnologia dos procedimentos cromatográficos realizados em colunas simples que os precederam.

• A cromatografia de coluna simples, contudo, ainda encontra considerável uso para propósitos preparativos.

Instrumentação

• Cromatografia líquida moderna:

– Altas pressões de bombeamento velocidades

razoáveis por recheios de partículas muito pequenas (3 – 10 µm)

– Equipamentos mais complexos

– Equipamentos mais caros

Instrumentação

Instrumentação

Instrumentação • Reservatório de fase móvel

• Sistemas de tratamento de solventes

– Gases dissolvidos e material particulado devem ser retirados

– Desgaseificadores vácuo, sistemas de destilação, aquecimento e agitação e sistema de “sparging”

– Sparging sistema pelo qual os gases dissolvidos são arrastados para fora de um solvente por pequenas bolhas de um gás inerte e solúvel

• Sistema de Eluição:

– Isocrático constituição do solvente permanece constante

– Gradiente composição do solvente é alterada

Instrumentação

Instrumentação Sistema de Bombeamento

• Requisitos: – Habilidade de gerar pressões altas (até 6.000 psi)

– Saída livre de pulsação

– Vazões na faixa 0,1 – 10 mL/min

– Reprodutibilidade relativa da vazão de 0,5% ou melhor

– Resistência a corrosão

• Tipos de bomba: – De seringa

– Bomba recíproca

– Bomba pneumática de pressão

Instrumentação Sistema de Bombeamento

• Bomba de seringa (rosca): – Saída livre de pulsação

– Pequena capacidade de volume ( ± 250 mL)

– Troca de solventes difícil

• Bomba recíproca: – Fluxo pulsado que deve ser atenuado

– Pequeno volume interno

– Alta pressão de saída (10.000 spi)

– Eluição por gradiente

– Vazões constantes

• Bomba pneumática de pressão – Barata

– Simples

– Livres de pulsação

– Eluição por gradiente não permite

Instrumentação

Instrumentação Sistema de Injeção da Amostra

• Alça de amostragem – Permite a escolha do volume (5 a 500 µL)

– Boa precisão

– Auto-amostradores

Instrumentação Colunas para cromatografia

• Aço inoxidável

• Comprimento 10 a 30 cm

• Diâmetro 2 a 5 mm

• Recheio partículas de 3 – 10 µm

• Microcolunas d.i = 0,1-5 mm, l = 3 – 8 cm, recheio = 3 – 5 µm

• Vantagens:

– Maior eficiência da coluna

– Menor consumo de solventes

– Maior velocidade de eluição

Instrumentação Colunas para cromatografia

• Microcolunas exemplo:

Instrumentação Colunas para cromatografia

• Recheio

– Sílica (suporte) partículas com diâmetros altamente uniformes

– Fase estacionário composto orgânico química ou fisicamente ligados a superfície do suporte.

• Colunas de proteção (guarda)

– Posicionada a frente da coluna analítica

– Função aumentar a vida útil da coluna analítica

– Composição semelhante a composição da coluna analítica

• Termostato para coluna manter a temperatura sob controle.

Instrumentação Detectores

• Pequeno volume morto

• Pequeno e compatível com a vazão de líquido

• Não existe detector universal

• Tipos de detectores:

Instrumentação

Detectores

Instrumentação

Tipos de CLAE (partição) • Cromatografia por partição a fase estacionária

é um líquido imiscível com a fase móvel

• Cromatografia por partição líquido-líquido FE é um solvente que é imobilizado por adsorção

• Cromatografia por partição com fase ligada FE é um composto orgânico imobilizado por ligações químicas

• Amplamente empregada

Tipos de CLAE (Partição) Recheios com fase ligada

• FE diferentes polaridades

• Características:

– Maior estabilidade

– Compatível com CLAE por gradiente

– Pequena capacidade de amostra

• Recheios de Fase Normal e Reversa

– Fase normal A FE é polar e a fase móvel é apolar

– Fase reversa A FE é apolar e a fase móvel é polar

Tipos de CLAE (Partição) Escolha das Fases Móvel e Estacionária

• Regra geral:

iguala-se a polaridade do analito com a da FE

Usas-se uma FM com polaridade diferente da FE

Analito e FM com polaridades semelhantes não é vantajoso...

Analito e FE com polaridades muito parecidas também não é vantajoso...

Tipos de CLAE (Partição)

• Aplicações:

Tipos de CLAE (Partição)

• Aplicações:

Tipos de CLAE (Adsorção)

• CLAE por adsorção Os analitos são adsorvidos sobre uma superfície de um sólido polar finamente dividido (recheio)

• A FM é constituída por um solvente orgânico ou por uma mistura de solventes orgânicos

• A FE é composta por partículas de sílica ou alumina

Tipos de CLAE (Troca Iônica)

• Existem dois tipos Baseadas em supressores e coluna única

• Cromatografia de íons baseadas no uso de supressores:

• Detector de condutividade sensíveis, universais para espécies carregadas, simples, baixo custo e fáceis de serem miniaturizados

• Limitação alta concentração de eletrólito para eluição da maioria dos íons dos analitos

• Conseqüentemente alta condutividade e baixa sensibilidade

• Porém, em 1975...

Tipos de CLAE (Troca Iônica)

• Porém, em 1975...

• Coluna supressora de eluente coluna recheada com uma resina trocadora de íons que converte os íons do solvente de eluição para espécies moleculares de ionização limitada

• Na determinação de cátions:

• Na determinação de anions:

Tipos de CLAE (Troca Iônica)

Supressora Coluna

Tipos de CLAE (Troca Iônica)

Coluna de guarda

Tipos de CLAE (Troca Iônica)

Fluoreto

Sulfato Cloreto

Tipos de CLAE (troca iônica)

Tipos de CLAE (Exclusão)

• O fracionamento é baseado nos tamanhos das moléculas

• Filtração em gel recheio hidrofílico (espécies polares)

• Permeação em gel recheio hidrofóbico (espécies apolares)

Tipos de CLAE (Exclusão)

• Aplicação:

CLAE versus CG

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Silva, L.L.R. Notas de Aula. FACET, UFVJM, 2008.

2. Cadore, S. Notas de Aula. IQ, UNICAMP, 2004.

3. SKOOG, D. A; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A., Princípios de Análise Instrumental, 5ª edição, Editora Bookman, 2006.

4. COLLINS, H. C.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S., Fundamentos de Cromatografia, Editora Unicamp, 2006.