Qualità microbiologica e prestazioni enologiche di starter per la fermentazione alcolica

L'ENOLOGO tr GENNAIO/FEBBRAIO 2OIO

Roffoele GuzzonGiorgio llicolinifizianc llordin

Roberto lorchertorio tolocorne

Laboratorio Chimicoe Consulenza enologica

C entro tr asferimen ", ir#l flr:;:"

San Michele all'Adige (TN)

Da sinístra:R. Guzzon,R. Larcher,T. Nardin,G. Nicoliní,M. Malacarne

QUA1IIA TWCROBIO1OGICA EPRESTAZIONI ENO1OGICHE DI STARTERPER 1A FERINENIAZIONE A1CO1ICAVengono presentate le caratteristiche microbiologiche e le prestazionifermentative di 29 ceppi di lieviti secchi attivi presenti sul mercatonazionale nella vendemmia 2009. Tutti hanno prodotto vinilfenoli ein molti casi significative dosi di anidride solforosa. ll carattere Pof(-)si conferma essere piuttosto raro tra i ceppi commercializzati.

IntroduzioneL'uso di lieviti selezionati

per la gestione della fermen-tazione alcolica è una praticaconsolidata che - grazie inparticolare all ' introduzionefin dagli anni '80 dei lievitisecchi attivi (LSA) - ha or-mai soppiantato la fermenta-zione alcol ica spontanea,condotta con lieviti indigeni.I motivi del grande successodei LSA sono facilmente in-tu ib i l i : i l ievi t i d is idratat inon richiedono onerose con-dizioni di mantenimento e

hanno dimostrato una buonadurab i l i tà ne l tempo. Da lpunto di vista enologico, iLSA - o l t re ad essere d isemplice utilizzo - riducono irischi di arresti di fermenta-zione e più in generale con-sentono fermentazioni rego-lari e dai risultati prevedibili.

Ogg i ass is t iamo ad unaprol i ferazione di ceppi d iLSA disponibili sul mercatoe questa tendenza puo diso-rientare il tecnico, in man-canza di studi mirat i a l lacompaîazione delle proprietàe prestazioni enologiche dei

diversi LSA. Inoltre, moltedelle colture disponibili sonodescritte e commercialmentepromosse facendo riferimen-to alla zona geografica d'iso-lamento, suggerendo ai tec-nici l ' idea che sia possibiletrasferire ai vini, i cui mostifossero stati inoculati con ta-li colture, caratteristiche qua-litative riconducibili dell'a-reale di origine. Questo ap-proccio suscita dubbi perchénon sempre le caratteristichefisiologiche, ed in particolarela produzione di metabolitisecondari. sono facilmente

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fob. | . Ceppi di lieviti seechi ottiyi utilizzoti

Ceppo Produttore o distributore Ceppo dichiarato

Agavin Flower Garzanti S. cerevisiae rf. bayanus

Anchor NT 50 Enologica Vason S.r.1 S. cerevisiae

Anchor VIN 13 Enologica Vason S.r.l S. cerevisiae

Awri Fusion AB Mauri S. cerevisiae x S. cariocanus (hybrid)

Challenge Selection ES 181 Esseco Group S.r.l S. cerevisiae x bayanus

Elegance AB Mauri S. cerevisiae

EZ Ferm Esseco Group S.r.l S. cerevisiae

Fermol Arome Plus AEB Group S.p.A S. cerevisiae

Flavour 2000 Enologica Vason S.r.l S. cerevisiae

FRSN6 Ferrari S.r.l non descritto

FR.WP Ferrari S.r.l non descritto

roc 18-2007 Paolo Araldo - I. O. C. non descritto

La Claire CGC 62 Pall Filtration & Separations S.p.A S. cerevisiae

La Claire SP 665 Pall Filtration & Separations S.p.A S. cerevisiae rf. bayanus

La Claire Wl5 Pall Filtration & Separations S.p.A S. cerevisiae

Lalvin R 2 Dal Cin Gildo S.p.A S. bayanus

Lalvin RC 212 Dal Cin Gildo S.p.A S. cerevisiae

Lalvin Rhone 2323 Lallemand inc. S. cerevisiae

Montrachet Red Star Essedielle non descrítto

Mvcoferm Cru 3l EVER S.r.l. non descritto

Mycoferm Cru 56 EVER S.r.l. non descritto

Premium Chardonnay Enologica Vason S.r.l S. cerevisiae

Red Fruit Enartis Esseco Group S.r.l S. cerevisiae

S. cerevisiae C.K. S 102 Bio Springer S. cerevisiae

S. cerevisiae Uvaferm 43 Lallemand inc. S. bayanus

S. cerevisiae Uvaferm BC Lallemand inc. S. cerevisiae (ex. bayanus)

S. cerevisiae Uvaferm CM Lallemand inc. non descritto

Vitilevure DVl0 Esseco Group Srl non descritto

Zymaflore VL3 Laffort S. cerevisiae

monitorabili e, in ogni caso,il loro grado d'espressionedipende fortemente dal mostoin cui il LSA si trova a fer-mentare.

Partendo da questi presup-post i , i l lavoro presentato.vuole descr ivere in modoscientificamente rigoroso leprincipali caratteristiche eno-logiche di un consistente nu-mero di LSA reperiti sul mer-cato italiano. I lotti di LSAconsiderati sono stati dappri-ma analizzati secondo le me-todiche OIV per verificarnela carica cellulare e I'even-tuale preselza di contaminan-ti microbici. Per ogni ceppodi LSA sono state valutate lec aratteri stiche fermentative(fase di latenza, velocità difermentazione, resa in alcol)grazie a fermentazioni con-dotte in scala di laboratorio

su tre diversi mosti. Infine, ivini ottenuti sono stati analiz-zati per ricercare eventualidifferenze compositive dow-te ai diversi starter, in partico-lare si è focalizzata l'atten-zione su parametri tecnologi-co-sensoriali signifi cativi qua-li la produzione di anidridesolforosa e di vinilfenoli.

ll pionosperimentole

In Tab. 1 sono riportati i29 LSA analizzati. Tutti ipreparati sono stati prodottiper la vendemmia 2009 e re-periti nelle cantine sociali ecooperative associate a Cavits.c. (Trento). Per la riattiva-zione, i LSA sono stati diluiti1:10 con acqua peptonata (lg/L Mycological Peptone,

Oxoid, Cambridge, UK), edincubati a 37"C per 20 minu-ti, con ripetute agitazionl

Le analisi microbiologicheed i terreni microbiologiciutilizzafi sono descritti este-samente nel metodo OIV F-COEI-2-CONBAC 09. I lie-viti, una volta pronti, sonostati opportunamente diluitied analizzati utllizzando 5terreni microbiologici: YM(conta dei lieviti), MRS (con-ta dei batteri lattici), CAAR(conta dei batteri acetici),CZAPEK (conta delle muffe)e Agar Lisina (conta dei lie-viti non Saccharomyces).

Le fermentazioni sono sta-te condotte su tre differentimosti: Nosiola (20.0 oBrix,

pH 3 .12, aciditàr totale 6.2glL, acido malico 5.6 glL,APA 250 mglL), Pinot gngio(23.1 oBrix, pH 3.30, acidità

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L'ENOLOGO tr GENNAIO/FEBBRAIO 2O1O

fob. 2 . Ptesenzo di specie nierobfuhe conlomi'nonti nei 15[ tesloti

Concentrozione deiprepofoti di lsA

La concentra zione cellularedei LSA, espressa come nu-mero di cellule per grammodi preparato secco, è indub-biamente il primo parametroche deve essere monitorato.La tecnologica e i processi diproduzione di queste culturesono oggi molto evoluti, per-tanto è opportuno attendersiche tutti i preparati di qualitàabbiano concentrazioni d icellule vive di lievito elevate.A riguardo, I'OIV prescriveuna concentrazione minimanon inferiore ai dieci miliardidi cellule per grammo (OIVCodex (Enologique Interna-tional, ed. 2009).

Tutti i lieviti testati hannosuperato questo valore soglia,sebbene vi siano differenze,anche molto significative, trai diversi campioni (Fig. l). Sela concentrazione media neicampioni testati si attesta sui29 miliardi di cellule di lievi-to per grammo, è interessanteosservare come il 50 oA deicampioni superi di 3 volte laconcentrazione minima previ-sta dal l 'OIV, segno che letecnologie produffive sono or-mai in grado di ridurre al mi-nimo il danno dovuto alla di-sidratazione delle cellule, equindi la mortalità cellulare.

E comunque opportunosottolineare come la concen-trazione cellulare sia un para-metro importante ma nonesaustivo. Tale valore puo di-pendere anche da caratteristi-che intrinseche al ceppo dil ievito e, in ogni caso, nonsempre alte concentrazionicellulari corrispondono poi adelevata vigoria fermentativa.

Pwezzo deipfepofoti

L'assenza, o la bassa con-centrazione, di microrgani-smi contaminanti nei prepa-rati di LSA è un indice dellaqualità del processo produt-tivo. L'OIV fissa dei valorisoglia per i lieviti non ,Sac-charomyces (< 0.01 % deltotale), per i batteri latt ici(104 UFCIg) , per i ba t te r iacetici (103 UFCIg) " per le

muffe (103 UFCIg). Tali va-lori sono stati rispettati nellamaggior parte dei campionipresi in esame (Tab. 2). Cir-ca un terzo dei campioni diLSA non presenta addiritturaalcun contaminante quantifi-cabile e nessun LSA ha dosirilevabili di muffe. Le con-centrazioni di batteri acetici(isolati nel 3 | o/o dei cam-pioni) e lieviti non Saccha-romyces (nel 17 %) non de-stano preoccupazione.

Al contrario, è opportunosegnalare che, relativamenteai batteri lattici, questi eranoquantificabili nel 4l oÀ delcampioni ma, in particolare,ben 5 preparati (LSA 16, 17,25, 26, 27) presentavano unaconcentrazione almeno 10volte superiore al limite in-dicato dall'OIV.

Comporlomenloin fermenlozione

Mentre la concentrazionecellulare è un parametro re-lativamente semplice da mi-surare, più complesso è de-terminare in modo oggettivoe riproducibile le caratteristi-che cinetiche di un micror-ganismo perché queste sonofortemente influenzate dal-I'ambiente in cui esso si tro-va ad agire.

Numerosi tentat iv i sonostati fatti in passato propo-nendo vini sintetici o terrenimicrobiologici che riprodu-cessero le caratteristiche eI'ambiente enologico (Osbor-ne e Edwards, 2006; Man-nazztr et a1.,2008) ma ad og-gi nessuna del le soluzioniproposte è stata riconosciutacome metodo u f f i c ia le d iprova delle prestazioni eno-logiche di LSA.

Si è pertanto scelto di uti-lizzare tre distinti mosti natu-rali, con composizioni chimi-che diverse tra loro, per ve-rif icare che i ceppi di LSAmantenessero le loro pro-prietà in ambienti fermentati-vi differenti e fossero, in buo-na sostanza, adattabili a di-verse condizioni enologiche.

I dati relativi al consumoz u c c h e r i n o a 2 , a T e d a 1 4giorni, espresso come o/o re-sidua degli zuccheri iniziali,nei tre diversi mosti utilizza-

LievitiCodifica non Saccharomyces

(ufc/g)

Batterilattici(ufc/g)

Batteriacetici(ufc/g)

LSAI

LSA3

LSA8 280

LSA9

LSAI2

LSAI3

LSAI4

LSAI6 230000

LSAIT

LSAl8 2000

LSAl9 2000

LSA2O 2000 14000

LSA2I

LSA22 200

LSA23 250

LSA25 62000

s8000LSA27 23000

LSA28

200

totale 4.6 glL, acido malico4.5 glL, APA 366 mglL) eManzoni bianco (21.4 "Brix,

pH 3.16, acidi tà totale 3.9glL, acido malico 3.6 glL,APA 276 mglL). I mosti, do-po pastorizzazione, sono statiintegrati con nutrienti azotatie tiamina (200 mglL, Acti-biol, Pall Filtration & Sepa-rations), l0 mg/L di acido p-cumarico e l0 mg/L di acidoferu l i co (S igma-A ld i rch ,usA).

La dose di inoculo per tut-t i i LSA è s ta ta d i 200mglL; le fermentazioni, con-dot te in beuta da 1 L a22"C, sono state seguite mo-ni torando i l calo peso delmosto in fermentazione do-vuto alla produzione di ani-dride carbonica.

Le analisi chimiche dei vi-ni sono state svolte utilizzan-d o W i n e s c a n ( F O S S A / SDenmark), mentre la quanti-ficazione dei vinilfenoli è av-venuta per HPLC-ECD se-condo quanto proposto daLarcher et al. (2007).

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fiq. I . Con(enltozionem;rodo olv

di rellule totoli di lieyiti, determinote seeondo il

t i , sono riportati in Fig. 2.Com'è noto, negli ultimi an-ni le concentrazioni zucche-rine dei mosti sono andatemediamente incrementandoper varie ragioni, sia di ordi-ne climatico generale che digestione viticolo-agronomicadei vigneti. Questa tendenzapuò causare qualche proble-ma ai lieviti in termini di ci-netiche di fermentazione e diproduzione di metaboliti se-condari sgraditi come I'acidoacetico. I dati confermano inparte queste preoccup azioni.Se nel mosto di Nosiola, cheaveva il piu basso grado ntc-cherino, tutte le fermentazio-ni si sono svolte regolarmen-te, all 'aumentare del gradozuccherino sono emerse diÈferenze notevoli tra i LSA,sia nella pronfezza d'avvio(% di zucchero consumata a2 giorni) che nella conclusio-ne del le fermentazioni . Inparticolare, sia in Pinot gri-gio che Manzoni bianco so-no stati osservati alcuni alre-st i , con meno del l '85 % dizucchero consumato dopo 14giorni. A questo proposito èuti le ri levare come le con-centrazioni zuccherine inizia-li non fossero limitanti, nonsuperando i 220 glL di ntc-chero. e futti i mosti avesse-ro una dotazione azotata benpiu che suffrciente. I risultatiottenuti sottolineano pertantoquanto la ricerca nel settoredella selezione dei ceppi dil iev i to per fe rmentaz ion i

enologhe sia ancora utile perarrivare a garantire sempreun'elevata efficacia fermen-tativa.

Produzione diqnidride solforosq

Se si escludono le provein cui si sono osservati alre-sti di fermentazione (consu-mo d i zucchero in fe r io rea l l ' 8 5 o A a l t e r m i n e d e l l eprove), non sono state osser-vate diffeÍenze tecnologica-mente significative relativeai parametri analitici di basedei vini. L'unica eccezionedegna di nota, anche per gliinteressanti sviluppi nel pro-sieguo della vinificazione,r iguarda la produzione dianidride solforosa totale. Imosti erano infatti privi dianidride solforosa, pertantole elevate contrazioni riscon-trate alla fine delle fermenta-zioni sono da imputarsi to-talmente all'attività dei lievi-ti inoculati. Come evidenzia-to in Fig. 3; gli accumuli dianidride solforosa variano inmodo significativo da lievitoa lievito. La produzione me-dia di anidride solforosa siattesta sui 35 mglL, ma rl24oA dei ceppi testati ha produ-zioni significativamente su-p e r i o r i a l l a m e d i a c o nl ' a c c u m u l o d i a l m e n o 5 0mglL di anidride solforosadurante la fermentazione al-colica. Tale valore soglia è

importante perché, se som-mato all 'anidride solforosaaggiunta nel processo di vi-nificazione, può rappresenta-re un ostacolo allo svolgi-mento della fermentazionemalolattica, anche ufilizzan-do ceppi starter di batterimalolattici. Questi risultatitrovano conferma in altri la-vori scientif ici che sottoli-neano I'importanza di un'ac-cura ta sce l ta de l la copp ialievito/batteri per garantirepronte ed efficaci fermenta-zioni enologiche (Arnink eHenick-Kling, 2005).

l'srido nslicoe i vinilfenoli

Acido malico. Al terminedella fermentazione alcolicamediamente 11 25 o/o dell'aci-do malico inizialmente pre-sente nei mosti è stato con-sumato, con punte anche del30 % (Fig. ). Le differenzetra i diversi ceppi sono mol-to limitate ed è interessantenotare come i vini fermenta-ti con ceppi di LSA che con-tenevano elevate concentra-zioni di batteri latt ici nonabbiano avuto demalicazionisuperiori alla media. Questoindica che i bat ter i lat t ic ipresent i nei LSA di f f ic i l -mente riescono ad insediarsiefficacemente nei mosti e adinterferire con la fermenta-zione alcolica e con la qua-l i tà de l v ino , sempre che

5,E+10

4,E+10

3,9+10

2,E+10

1 , E + 1 0

0,E+00

E F 9 g 9 g g 9 -e -e 9 -e g 9 9 9 9 9 g 9 9 -e g -e -e -e g 9 9r i o 5 o o , - - r o @ É j È ó È d e ì d A B \ N E N E t s \ È B

In tutti gli istogrammi è indicata anche la media generale e la relativa deviazione standard

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L'ENOLOGO tr GENNAIO/FEBBRAIO 2OIO

--e.- 2 giorni --r- 7 giorni --,r- 14 giorni

LSA 28 LSA 3

LSA 27 : . - LSA4

LSA 26 LSA 5

LSA 25 LSA 6

LSA 24 LSA 7

LSA 23

LSA 22

LSA 8

LSA 9

LSA 21 r LSA10

LSA20 N' / ' tser

lsn rg'$ 7 LSA12

LSA 18 LSA 13LSA 14

-r- 2 giorni --o- 14 giorni

LSA 28

LSA 27

LSA 26

LSA 25

LSA 24

LSA 23

LSA 22

LSA21 !

2 giorni --t - 7 giorni -f- 14 giorni

LSA 28

LSA27 -.

LSA 26

LSA 25

LSA 24

LSA 23

LSA 22

LSA 2,1

LSA 20 \ '..x..LSA 19 ' . . \

lsn ta \

' - r ' - 7 giorni

LSA 29 . ̂ ^LSA 1

LSA 19

LSA 18

LSA 17

lio. 2 .zu-crhetodopo 2,

Consumo zurcherino espresso ininiziolmele presenle n-ei nosti,7 e l4 giornì di fernrentozione

%-ilellO nelle fasi successive del pro-Yofutato cesso di vinific azione si at-

tuino tutte le procedure ne-cessarie al loro controllo.

I vinilfenoli. I dati analiti-ci relativi alla produzione difenoli volatili sono riportatiin Fig. 5. In queste prove siè voluto "stressare" il meta-bolismo dei l ievit i aggiun-gendo ai mosti quantità diprecursor i ben super ior i aquelle naturalmente presentinei mosti. I mosti utilizzatisono stati pastorízzati, ed èpertanto da escludersi la pre-senza di lieviti contaminanti.Le elevate concentrazioni divinilfenoli riportate in tabel-la sono quindi da imputarsiall'elevata presenza dei pre-cursori e alle attività enzi-matiche dei LSA testati.

N e l l e c o n d i z i o n i s p e r i -mentali tutti i ceppi hannoprodotto 4-vinilfenolo e 4-vinilguaiacolo. La timitatanumerosità di replicazioni ele elevate differenze tra testcondotti con lo stesso lievitosu diversi mosti rendono dif-f ic i le mettere in evidenzadifferenze statisticamente si-gnificative tra i ceppi. Tuffa-v ia, sembra appar i re unatendenza almeno nel diffe-renziare i "poco produttori"(LSA 5 e 14) dai ceppi che,hanno prodotto fenoli volati-l i in quantità significativa-mente superiore alla media( L S A 2 , 6 , l l , 1 7 , 2 3 ) . C o -me peraltro atteso, Ia catat-teristica Pof (+) di decarbos-silazione degli acidi cinna-mici a v in i l fenol i è la piudiffusa tra i ceppi commer-cialmente uti l izzati per laproduzione di LSA, anche sespesso questa informazioneè omessa o non chiaramenteritracciabile sulle schede tec-niche. Quella Pof(-) è inveceminoritaria e non chiaramen-te identificabile dal presentepiano sperimentale che purincludeva ceppi commercial-mente dichiarati come Pof(-).A questo riguardo - ancheal la luce di quanto da noiosserva to ne l corso de l lavendemmia precedente (Ni-colini et al. 2009) - un'inda-gine sulla reale disponibilitàcommerciale e sulle presta-zioni dei ceppi Pof(-) è forseopportuna.

Considerozionicondusive

I l lavoro qui presentatofornisce all'enologo un utilecont r ibu to per una sce l tasempre piu ragionata e con-sapevole del formulato com-merciale di LSA da utilizza-re - in relazione ai vincoli eagli obiettivi prefissati - nelprocesso di vinificazione. Alfine di facilitare la divulga-zione delle informazioni ac-quisite, i dati riportati - con-giuntamente a più dettagliatespecifiche sui ceppi - sonocomunque disponibili anchesulla pagina web htp://www.ismaa.ilservizi contextjsp?ID LINK:I lI&arer6.

Ringraziamenti. Gli auto-ri ringraziano Cavit s.c. peril supporto economico e lacortese disponìbìlità alla dí-vulgaztone dei dati, nonché ícolleghi Agostino Cavazza,Giovanna Facchinelli e Ma-rina Agostini per la gentilecollaborazione.

RisssunloVengono presentate le ca-

ratteristiche microbiologichee le prestazioni fermentativedi 29 ceppi di lieviti secchiattivi presenti sul mercatoitaliano nel 2009. I ceppi so-no stati analizzati dal puntodi vista microbiologico se-condo i metodi OIV. Suc-cessivamente la loro attitudi-ne fermentativa è stata testa-ta fermentando in scala dilaboratorio 3 diversi mostiprec edentemente pastorizza-ti, privi di SO2 ed addiziona-ti di acido p-cumarico e diacido ferulico. Tutti i ceppihanno prodotto 4-vinilfenoloe 4 - v i n i l g u a i a c o l o , e d i nmolti casi anche notevoli do-si d i anidr ide sol forosa. I lcarattere Po(-) sembra esse-re piuttosto raro tra i ceppidi lievito commerc ializzatr.

SumnoryMicrob io log ica l qua l i t y

and fermentative behaviourof a lcohol ic fermentat ionstarters. The microbiologicalcharacteristics and the fer-

9 l

L'ENOLOGO I ] GENNAIO/FEBBRAIO 20IO

nrcn ta t ion per fb r r lances o f2 9 s t r a i n s o f d r y s e l e c t e dyeas ts ava i lab le on thc I ta -l i a n n r a r k e t i n 2 0 0 9 i ì r es h o u n . T h e s t r a i n s w e r eanalyzed fbl low, in-q the OIVp r o t o c o l s . a n d t h c n t e s t c df c r n r e n t i n g o n l a b o r a t o r yscalc 3 di f fcrcnt n l l ls ts pre-viously pasteur ized, wi thoLrtSO2 and enr iched with p-cu-nrar ic e rnd fè ru l i c ac ids . A l lstrains prodr"rccd 4-r,inylphe-nol and rl-r ' inyl-qr;aiacol, ar-rdnliìny of thenr produccd alsohigh quant i t ies of SO.. Pof(-)charactcr scenls to be ratherra rc s i th in t l re yeas t s t ra insavai lablc on thc market.

BibliogrqfiaA r n i n k K . . H c n i c k - K l i n g

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N i c o l i n i G . . M o s e r S . .L a r c h e r R . . I n n o c e n t i M . ,Z a n o n N . . B a r c h e t t i P .( 2 0 0 9 ) . V a r i a b i l i t à i n d o t t ada l icv i t i cor l l rnercial i nel laccnr-rposizionc di vini bianchis p c r i m e n t a l i . L ' E n o l o g o .4 5 ( 9 ) : 8 9 - 9 6 .

Osborne JP.. Edwards CG.( 2 0 0 6 ) I n h i b i t i o n o f r n a l o -lact ic fèrmentat ion by Sac-t' lt u ro nt.t'c'e^s duritr-e alcoholicfèrmentation under low- andh igh-n i t ro_qcn cond i t ions : as t u d y i n s y n t h e t i c n - r e d i a .A u s t . J . G r a p e W i n e R e s . .l 2 ( l ) : 6 9 - 1 8 .

tiq. 3 - Produzione di onidride solforoso totole ol termine dello fermenlq.zióne okolico (nediu t d.s.l

fiq. 4 - Percentuqle di orido moliro residuo nei vini ol termine dello fermen.tqiione olcolirq rispetto ol contenulo iniziole nei mosti (medio t d.s.l

f ig. 5 - Produzione di vinilfenoli l^g/ 1; medio + d. s.l nei vini do mosti pq.slórizzoti oggiunti di | 0 mgl L di ocìdo p-(unarico e di otido feruliro

E so, rotate 1mglr1

- - - - - - - - - r - - - -a a a a (n (n a a a a a a a u) a u) u) a (D a a a a u) a (n a a a

N O s o ó ! @ @ 3 - È ; É ; d ì A ó 3 \ s 3 X A B \ t s 3

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