UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA ESCOLA DE NUTRIO
YTANA TADEU OLIVEIRA SANTOS QUALIDADE SANITRIA DE HORTALIAS
CULTIVADAS EM UM DISTRITO SANITRIO DE SALVADOR-BA E EFICINCIA DE
SOLUES ANTIMICROBIANAS SOBRE LINHAGENS DE
ESCHERICHIA COLI
Salvador 2007
YTANA TADEU OLIVEIRA SANTOS
QUALIDADE SANITRIA DE HORTALIAS CULTIVADAS EM UM DISTRITO
SANITRIO DE SALVADOR-BA E EFICINCIA DE SOLUES ANTIMICROBIANAS SOBRE
LINHAGENS DE
ESCHERICHIA COLI
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao da Escola de
Nutrio, Universidade Federal da Bahia, como parte dos requisitos
para obteno do ttulo de Mestre em Alimentos, Nutrio e Sade.
Orientador: Profa. Dra. Rogeria Comastri de Castro Almeida
Co-orientador: Prof. Dr. Paulo Fernando de Almeida
Salvador 2007
Santos, Ytana Tadeu Oliveira S237 Qualidade Sanitria de
hortalias cultivadas em um distrito sanitrio de
Salvador-Ba e eficincia de solues antimicrobianas sobre
linhagens deEscherichia coli / Ytana Tadeu Oliveira Santos.
Salvador, 2007.
85 f.
Orientador: Profa. Dra. Rogeria Comastri de Castro Almeida
Co-orientador: Prof. Dr. Paulo Fernando de Almeida Dissertao
(mestrado) Universidade Federal da Bahia. Escola de Nutrio,
2007.
1. Microbiologia de Alimentos. 2. Hortalias. 3. Irrigao
(Agricultura). I.Universidade Federal da Bahia - Escola de Nutrio.
II. Almeida, RogeriaComastri de Castro. III. Almeida, Paulo
Fernando de. IV. Ttulo.
CDU: 664
YTANA TADEU OLIVEIRA SANTOS
QUALIDADE SANITRIA DE HORTALIAS CULTIVADAS EM UM DISTRITO
SANITRIO DE SALVADOR-BA E EFICINCIA DE SOLUES ANTIMICROBIANAS
SOBRE LINHAGENS DE ESCHERICHIA COLI
Dissertao apresentada como requisito obteno do grau de Mestre em
Alimentos, Nutrio e Sade, Escola de Nutrio, Universidade Federal da
Bahia. Banca examinadora: Rogria Comastri de Castro Almeida
Doutora em Engenharia de Alimentos (Universidade Estadual de
Campinas) Universidade Federal da Bahia Alase Gil Guimares
Doutora em Tecnologia de Alimentos (Universidade Estadual de
Campinas) Universidade Federal da Bahia Elisa Teshima
Doutora em Cincia e Tecnologia de Alimentos (Universidade
Federal de Viosa) Universidade Estadual de Feira de Santana
Salvador, ______ de ______________ de 2007.
Aos meus pais, Gildo e Snia que sempre me apoiaram e, com muito
esforo, conseguiram proporcionar tudo o que tenho hoje. Ao meu
companheiro Fbio pela pacincia e carinho dispensado. Ao meu amigo
Augusto, pelo incentivo para a realizao deste trabalho, pela fora,
ajuda e disponibilidade desde o incio desta batalha. A todos os
colegas da Vigilncia Sanitria, especialmente da Vigilncia Sanitria
de Salvador, pela rdua e gratificante misso da proteo e defesa da
sade.
AGRADECIMENTOS A Deus, por ter me dado tanto nesta vida. A minha
orientadora, Profa.. Dra. Rogeria Comastri de Castro Almeida, pelo
incentivo, ajuda e pelos momentos de preciosa orientao no decorrer
deste trabalho. Aos meus familiares e amigos, pela compreenso e
pacincia pelas minhas faltas durante o convvio familiar nos longos
perodos em que fiquei envolvida com as atividades necessrias
realizao desta pesquisa; A minha grande colega e amiga Clotilde
pelo apoio nas horas difceis, incentivo e ajuda nos momentos
crticos desta batalha. Aos meus amigos e colegas Augusto e Antnia
Maria pela fora, ajuda, carinho e apoio que sempre me ofereceram. A
Vigilncia Sanitria do Municpio de Salvador-Ba pela imensa colaborao
para a execuo deste trabalho. A toda a equipe do Distrito Sanitrio
Cabula Beiru em especial a Dra. Ftima Moraes, Irani Ferreira e
colegas da vigilncia sanitria pela colaborao e apoio. A equipe do
Laboratrio de Biotecnologia e Ecologia de Microrganismo (LABEM), em
especial ao Prof. Dr. Paulo Fernando de Almeida e a aluna
Jaqueline, pela disponibilidade do laboratrio e pela ajuda
prestada. Ao Laboratrio Central Gonalo Muniz - LACEN e sua equipe
pela disponibilidade do laboratrio e pela colaborao prestada. Ao
amigo Lucas Assis pela importante ajuda e disponibilidade sempre. A
Karine Nogueira, pela preciosa ajuda durante a execuo das anlises.
Ao Prof. Dr. Tomomasa Yano da Universidade Estadual de Campinas
pela colaborao na realizao das anlises para a deteco de
citotoxinas. A Profa. Dra. Rizia de Cssia Vieira Cardoso pela ajuda
e apoio dispensados no incio do mestrado. Ao Prof. Dr. Gilnio e
Profa. Dra. Luciara pela colaborao na conduo das anlises
estatsticas. Ao Programa de Ps-graduao em Nutrio, Alimentos e Sade
da Universidade Federal da Bahia, pela oportunidade de realizao
deste mestrado. A todos os demais que de alguma forma contriburam
para a realizao deste trabalho.
Quem me dera ao menos uma vez que o simples fosse visto como o
mais importante....
Renato Russo
RESUMO O consumo de hortalias cruas constitui um importante meio
de transmisso de vrias doenas infecciosas, dentre estas se destacam
aquelas provocadas por bactrias patognicas, ocasionando com
freqncia surtos de Doenas Veiculadas por Alimentos (DVA).
Deficincias no controle em qualquer uma das etapas da produo podem
comprometer a qualidade sanitria das hortalias. Nas hortas
existentes em nosso meio observam-se prticas agrcolas inadequadas
durante a produo das hortalias, dentre estas a utilizao de gua
contaminada, comprometendo a qualidade final dos produtos. Desta
forma, torna-se necessrio o controle durante todas as etapas que
precedem o consumo, incluindo a lavagem e sanitizao adequadas
destes vegetais. O cloro um dos principais agentes sanitizantes
permitido pela legislao brasileira, porm atualmente, seu uso vem
sendo contestado devido possibilidade da formao de substncias
carcinognicas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a qualidade
higinico-sanitria de hortas, hortalias e gua de irrigao e a eficcia
sanitizante de produtos contendo cidos orgnicos de cadeia curta
sobre linhagens de Escherichia coli inoculadas artificialmente em
alface. Foram investigadas cinco hortas, 140 amostras de hortalias
distribudas entre alface, coentro, couve e hortel, e 45 amostras de
gua de irrigao. Para avaliao da qualidade sanitria das hortas foi
aplicado um check-list e para avaliar as hortalias e guas de
irrigao foram conduzidas anlises microbiolgicas pertinentes. Em
etapa posterior, foi investigada a eficcia sanitizante de cidos
orgnicos de cadeia curta sobre duas linhagens de Escherichia coli
inoculadas separadamente em alface e em seguida submetidas aos
tratamentos por 15 minutos, empregando solues de vinagre de lcool,
suco de limo, mistura suco de limo e vinagre (1:1) e mistura suco
de limo,vinagre e gua (1:1:1). Os resultados demonstraram que 40%
das hortas apresentam condies higinico-sanitrias totalmente
insatisfatrias e as anlises microbiolgicas revelaram elevados
ndices de contaminao por coliformes termotolerantes nas hortalias
com 82% de amostras contaminadas, contagens entre < 0,3 a 1500
NMP/g, presena de E. coli em 32% das amostras e ausncia de
Salmonella spp. Na gua de irrigao tambm foram encontrados ndices
elevados de coliformes termotolerantes, com 87% de amostras
contaminadas, contagens entre < 2 a 2100 NMP/100 mL, e presena
de E. coli em 56% das amostras. Um total de 69% das amostras das
guas no atendeu ao padro vigente para coliformes termotolerantes.
Os resultados obtidos a partir do check-list no foram condizentes
com as anlises microbiolgicas. Quanto aos tratamentos com as solues
antimicrobianas, verificou-se que no houve diferena
estatisticamente significativa (p
ABSTRACT The consumption of raw vegetables is surely an
important mean to transmit several infectious diseases, among them
must be highlight the ones caused by pathogenic bacteria, which
frequently cause outbreaks of foodborne diseases. Deficiencies
regarding the control of any of the stages of production may harm
vegetables sanitary quality. Among the patches observed it can be
notice inadequate practices while growing the vegetables such as
the use of contaminated water, which may affect the quality of the
products to be harvested. This way, there is a strong necessity in
order to control all the stages which precede consumption,
including the adequate washing and sanitization of such vegetables.
Chloral is one of the main sanitization agents allowed by Brazilian
laws. However, currently, its use has been contested due to the
possibility to form carcinogenic substances. This work aims to
evaluate the hygienic-sanitary quality of patches, vegetables and
irrigation water and the sanitizing efficacy of products containing
simple series organic acids against Escherichia coli strains
artificially inoculated in lettuce plots. Five patches have been
investigated, 140 samples of vegetables ranging from lettuce,
cilantro, savoy cabbage and mint, and 45 samples of irrigation
water. A check-list form was used in order to evaluate the sanitary
quality of vegetable patches and the adequate microbiological
analysis to investigate the vegetables themselves as well as
irrigation water. Afterwards, the object investigated was the
sanitizing efficacy of organic acids against two Escherichia coli
strains inoculated separately in lettuce, which were after
submitted to a 15-minute treatment consisting on the application of
alcohol vinegar, lemon juice, a mix of lemon juice and vinegar
(1:1), as well as lemon juice, vinegar and water (1:1:1). Results
showed that 40% of the patches present unsatisfactory
hygienic-sanitary conditions and the microbiological analysis
revealed high rates of contamination for thermotolerant coliforms
in vegetables with 82% of samples infected, counts between < 0.3
and > 1500 MPN/g, presence of E. coli in 32% of the samples and
the absence of Salmonella spp. In irrigation water there were also
found high rates of thermotolerant coliforms, with 87% of the
samples contaminated, counts between < 2 and 2100 MPN/100 mL,
and the presence of E. coli in 56% of the samples. A total of 69%
of the water samples did not in compliance to the existing
standards of thermotolerant coliforms. The results obtained over
the check-list havent machted with the microbiological analyses.
Concerning the treatment with antimicrobial solutions, it has been
verified that there was no significant statistic difference (p
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Caracterizao das hortas do Distrito Sanitrio Cabula
Beiru (DSCB) de Salvador - Ba e avaliao pelo check-list.
49
TABELA 2 Distribuio da ocorrncia de coliformes termotolerantes
em hortas do Distrito Sanitrio de Salvador - BA, de acordo com o
tipo de hortalia estudada.
52
TABELA 3 Valores mnimos e mximos do Nmero Mais Provvel (NMP)/ g
de coliformes termotolerantes em hortalias cultivadas em hortas do
DSCB de Salvador Ba.
53
TABELA 4 Ocorrncia de coliformes termotolerantes em hortalias de
acordo com a horta do DSCB de Salvador - Ba.
54
TABELA 5 Presena de Escherichia coli de acordo com o tipo de
hortalia cultivada em hortas do DSCB de Salvador Ba.
55
TABELA 6 Presena de Escherichia coli em hortalias de acordo com
as hortas do DSCB de Salvador - Ba.
56
TABELA 7 Valores mnimos e mximos do Nmero Mais Provvel (NMP) de
coliformes totais e coliformes termotolerantes em guas de irrigao,
utilizadas em hortas do DSCB de Salvador - Ba.
59
TABELA 8 Freqncia de coliformes totais e coliformes
termotolerantes em guas de irrigao utilizadas em hortas do DSCB de
Salvador - Ba.
59
TABELA 9 Frequncia de Escherichia coli em guas de irrigao
utilizadas em hortas do DSCB de Salvador - Ba.
60
TABELA 10 Percentual de amostras da gua de irrigao que no
atenderam ao padro microbiolgico para coliformes termotolerantes
(CONAMA, 2005).
62
TABELA 11 Eficcia dos tratamentos sobre Escherichia coli O157:
H7 inoculada artificialmente em folhas de alface, aps 15 minutos de
contato.
65
TABELA 12 Eficcia dos tratamentos sobre Escherichia coli-Ls
inoculada artificialmente em folhas de alface, aps 15 minutos de
contato
67
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Preparo da suspenso bacteriana 44
FIGURA 2 Ocorrncia de coliformes termotolerantes de acordo com o
tipo de hortalia
51
FIGURA 3 Ocorrncia de E. coli de acordo com o tipo de hortalia
cultivada em hortas do DSCB / Salvador-Ba
55
FIGURA 4 Ocorrncia de coliformes totais e termotolerantes em gua
de irrigao de hortas do DSCB / Salvador-Ba
60
FIGURA 5 Ocorrncia de E. coli na gua de irrigao 61
FIGURA 6 Percentual de amostras de gua de irrigao que no
atenderam ao padro da CONAMA
62
FIGURA 7 Eficcia dos tratamentos sobre E. coli O157:47 e E.
coli-Ls inoculadas
artificialmente em alface
57
SUMRIO
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
1 INTRODUO 11
2 OBJETIVOS 13
2.1 Objetivo geral 13
2.2 Objetivos especficos 13
3 REFERENCIAL TERICO 14
3.1 Hortalias 14
3.2 Qualidade sanitria das hortalias 15
3.2.1 Bactrias do grupo coliforme/ Escherichia coli 17
3.2.2 Salmonella spp. 21
3.3 Prticas agrcolas: Condies higinicas sanitrias dos locais de
produo, insumos e manipuladores.
23
3.4 gua de irrigao 24
3.4.1 Qualidade microbiolgica e doenas veiculadas pela gua de
irrigao 25
3.5 Consideraes sobre o controle sanitrio na produo de hortalias
e doenas veiculadas por alimentos
28
3.6 Sanitizao de hortalias 30
3.6.1 Agentes sanitizantes e a sua eficincia na eliminao de
patgenos 31
4 MATERIAL E MTODOS 35
4.1 Material 35
4.1.1 Alimentos 35
4.1.2 Cepas dos microrganismos de referncia 35
4.1.3 Solues de tratamento 35
4.1.4 Meios de cultura e reagentes 35
4.1.5 Equipamentos 37
4.2 Mtodos 38
4.2.1 Local de estudo 38
4.2.2 Desenho de estudo 38
4.2.3 Cadastramento e caracterizao higinico-sanitria das hortas
38
4.2.4 Investigao higinico-sanitria das hortalias e da gua de
irrigao 39
4.2.5 Investigao da eficincia sanitizante de solues contendo
cidos orgnicos sobre E. coli O157: H7 e E. coli isolada de alface
(Lactuca sativa).
44
4.2.6 Investigao da presena de citotoxinas nas cepas isoladas de
E. coli. 46
5 RESULTADOS E DISCUSSO 48
5.1 Caracterizao e investigao das condies higinico-sanitrias das
hortas 48
5.2 Investigao da qualidade higinico-sanitria das hortalias
51
5.3 Investigao da qualidade sanitria da gua de irrigao 58
5.4 Avaliao da eficincia de solues antimicrobianas sobre
linhagens de Escherichia coli inoculadas artificialmente em
alface
64
6 CONCLUSO 72
7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 74
APNDICE
ANEXOS
11
1 INTRODUO
O consumo de hortalias vem sendo cada vez mais incentivado no
mundo atual diante
de todos os seus benefcios nutricionais conhecidos. Porm,
principalmente as hortalias
folhosas, constituem um importante meio de transmisso de vrias
doenas toxinfecciosas,
tendo sido reportadas como fonte potencial de microrganismos
patognicos, contribuindo para
a elevao dos casos de doenas veiculadas por alimentos (DVAs)
(FDA, 1998; BUCK,
WALCOTT & BEUCHAT, 2003).
A contaminao microbiolgica uma das mais relevantes para a sade
pblica,
considerando os elevados ndices de doenas veiculadas por
alimentos (DVAs), provocados
por microrganismos patognicos em todo o mundo (OMS, 2003). O
consumo de verduras
cruas desempenha um importante papel na transmisso de vrias
doenas toxinfecciosas,
destacando-se a prtica freqente da irrigao de hortas com guas
contaminadas como uma
das principais fontes de contaminao das mesmas (AMORIM, 2003;
BASTOS, 2002).
Os riscos microbianos que afetam a segurana dos alimentos podem
estar presentes em
qualquer ponto da cadeia produtiva, desde o cultivo, colheita,
lavagem, armazenamento,
transporte, comercializao, e finalmente na mesa do consumidor
(RANTHUM, 2002).
As pesquisas existentes em nosso meio para avaliar a qualidade
sanitria de hortalias,
em sua grande maioria, s ocorrem nos locais de distribuio e
comercializao das mesmas,
poucas se referem ao local de cultivo ou incio da cadeia
produtiva, onde deveria ter seu
controle e monitoramento iniciados. Portanto, de um modo geral,
dentre os fatores que
concorrem para a contaminao de hortalias, devem ser investigados
o meio ambiente em
que as mesmas so produzidas, destacando-se a gua de irrigao, a
situao higinico-
sanitria das hortas, as prticas agrcolas empregadas como tambm a
situao de sade e
hbitos higinicos dos trabalhadores das hortas.
No Distrito Sanitrio Cabula Beiru (DSCB), municpio de
Salvador-Bahia, a
horticultura uma prtica visvel. Fatores culturais, alternativas
de sustentabilidade,
condies de clima e solo favorveis, contribuem para esta
atividade neste local. Seus
produtos so consumidos pela populao local e distribudos para
centros de abastecimento
em Salvador e adjacncias.
12
No DSCB as hortas esto localizadas em regies de declives, onde
geralmente vivem
pessoas de baixa renda, sem ordenamento do uso do solo,
saneamento bsico precrio e
ausncia de outros servios pblicos fundamentais. O destino dos
esgotos e guas servidas
feito com freqncia em rios e riachos locais, contaminando as
guas superficiais e lenis
freticos com material fecal. Por sua vez, a grande maioria dos
produtores, pela dificuldade ao
acesso ou por desinformao, utiliza destas guas adjacentes s
hortas para irrig-las, sem
nenhum tratamento prvio, fato que repercutir na qualidade
sanitria das hortalias
produzidas. Contudo, mesmo existindo um controle sanitrio nestas
etapas que antecedem a
oferta final do produto, difcil garantir que estes alimentos
cheguem incuos mesa do
consumidor. Dessa forma, a prtica da sanitizao deve ser
utilizada como complementao
s boas prticas de produo (BPF), visando reduzir com maior
segurana a presena de
microrganismos patognicos no alimento.
O processo de sanitizao das hortalias considerado uma etapa
crtica para a
segurana no consumo do alimento e a seleo dos sanitizantes a
serem empregados deve ser
baseada no apenas na eficcia dos mesmos, mas tambm na segurana
do ponto de vista
toxicolgico (NASCIMENTO, 2002). O hipoclorito de sdio o agente
mais comumente
empregado, porm alm de possuir efeito limitado sobre
determinados microrganismos, pode
produzir substncias denominadas trihalometanos, comprovadamente
carcinognicas
(FERRARIS et al., 2005; DUNNICK & MELNICK, 1993).
Considerando-se o fato acima citado, h um interesse por parte
das indstrias de
alimentos em desenvolver sanitizantes alternativos que sejam
mais eficazes que o hipoclorito
de sdio para reduzir ou eliminar patgenos humanos em produtos
frescos, e que no
possuam efeitos deletrios sade. Os cidos orgnicos de cadeia
curta, por serem
considerados substncias reconhecidas como seguras (GRAS), tm
sido muito utilizados
como alternativa em estudos de reduo da populao bacteriana em
alimentos.
Diante do exposto, realizou-se esse estudo para investigar a
qualidade higinico-
sanitria de hortalias e gua de irrigao das mesmas, atravs de
anlises microbiolgicas,
avaliando-se tambm as condies ambientais e higinico-sanitrias
das hortas que as
produziam. Tambm foi objeto desse estudo a avaliao da ao
sanitizante de produtos
contendo cidos orgnicos de cadeia curta e sua combinao sobre
linhagens de Escherichia
coli, inoculadas artificialmente em folhas de alface (Lactuca
sativa).
13
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar a qualidade higinico-sanitria de hortas, hortalias e gua
de irrigao e a
eficcia sanitizante de produtos contendo cidos orgnicos de
cadeia curta sobre linhagens de
Escherichia coli inoculadas artificialmente em alface (Lactuca
sativa).
2.2 Objetivos Especficos
Avaliar as condies higinico-sanitrias de hortas atravs da
aplicao de formulrio
semi-estruturado do tipo check-list.
Avaliar as condies higinico-sanitrias das hortalias investigando
a presena de
Salmonella spp. e o Nmero Mais Provvel de coliformes
termotolerantes/ E. coli.
Avaliar as condies higinico-sanitrias da gua de irrigao
investigando o Nmero
Mais Provvel de coliformes totais e coliformes termotolerantes/
E. coli.
Comparar os resultados encontrados com os padres microbiolgicos
vigentes.
Avaliar a eficcia sanitizante de vinagre, suco de limo, mistura
vinagre e suco de
limo, e mistura vinagre, suco de limo e gua, sobre duas
linhagens de Escherichia
coli inoculadas artificialmente em alface.
14
3 REFERENCIAL TERICO
3.1 Hortalias
.
Originria da Europa e da sia, a alface (Lactuca sativa) pertence
famlia Asteracea
e a verdura mais consumida no Brasil (EMBRAPA, 2006). A alface
possui um caule
diminuto ao qual se prendem as folhas, podem ser do tipo lisa ou
crespa, fechando-se ou no
na forma de um cone. A colorao das plantas pode variar do
verde-amarelado at o verde
escuro e tambm pode ser roxa, dependendo do cultivar.
classificada comercialmente em
Americana, Crespa, Lisa, Mimosa e Romana. Desses tipos, o mais
consumido a alface
Crespa (TRANI et al., 2005).
O Coentro (Coariandrum sativum L.), tambm conhecido como
cheiro-verde pertence
famlia Apiaceae, foi originado do sul europeu e do oriente e,
acredita-se que chegou ao
Brasil trazido pelos portugueses (EMBRAPA, 2006). uma hortalia
bastante usada como
condimento em todo o Brasil, principalmente nas regies norte e
nordeste e em menor
proporo no sudeste. Suas folhas so bastante utilizadas na
culinria, em diversos pratos
tpicos, no tempero de carnes alm de molhos e saladas. J a sua
semente bastante til na
indstria de condimento para a carne defumada, fabricao de pes,
doces e licores finos
(ALVES et al., 2005).
A couve (Brassica oleracea), originria da costa do Mediterrneo,
uma planta que
apresenta grande diversidade, sendo a couve manteiga como um dos
22 tipos encontrados
no Brasil, a mais comumente produzida e consumida. Possui folhas
verde-claras, tenras, lisas
ou pouco onduladas, com pecolo e nervuras verde-claras (EMBRAPA,
2006). Seu uso
muito apreciado em todo o Brasil na forma de salada crua, cozida
ou na elaborao de sucos.
A hortel (Menta villosa), originria da sia e Europa, uma planta
medicinal e
aromtica cultivada tambm em todo o Brasil e largamente utilizada
pelas indstrias
qumicas, farmacuticas e de alimentos (PAULUS, 2005). Como
alimento, seu uso muito
apreciado como tempero em diversas preparaes e tambm como
ingrediente na elaborao
de sucos em combinao com algumas frutas.
15
Segundo Moretti (2003), as hortalias constituem parte integrante
da dieta da
populao mundial. No Brasil, de acordo com o ltimo levantamento
realizado atravs da
Pesquisa de Oramento Familiar (2003), o consumo de frutas e
hortalias ainda se encontra
abaixo dos nveis recomendados. Na Bahia de acordo com as
informaes da Central de
Abastecimento S.A. (CEASA, 2005), entre o perodo de 2002 a 2005,
houve um crescimento
significativo na comercializao de hortalias folhosas como a
alface, coentro, couve e
hortel.
Em relao s recomendaes dirias na ingesto de hortalias, as
diretrizes dietticas
atuais recomendam a diminuio do consumo de gordura, acar e sal,
manuteno do peso
desejvel e aumento do consumo de hortifrutigranjeiros e gros
(WHO, 2003). Ao mesmo
tempo em que os benefcios de sade relacionados ao consumo destes
produtos j esto
claramente estabelecidos, necessrio garantir tambm que as mesmas
apresentem uma
qualidade sanitria adequada, visando garantir o fornecimento de
um alimento seguro sade
dos comensais.
3.2 Qualidade sanitria das hortalias
A alimentao tem sido motivo de preocupao em vrios pases do mundo
(WHO,
2003) e adequar a produo de alimentos demanda crescente da
populao tem sido um
grande desafio. Entretanto, este desafio no se resume apenas em
atender a essa nova
demanda, mas tambm em oferecer alimentos com qualidade
satisfatria e livres de agentes
contaminantes (BALBANI & BUTUGAN, 2001).
Com o processo de globalizao atual, verificou-se uma maior
preocupao com a
segurana alimentar, tanto no aspecto quantitativo ligado a
oferta do alimento, quanto no
aspecto qualitativo, o que torna mais evidente os problemas
relativos qualidade dos
alimentos para consumo humano (CAVALCANTI, 2004).
Nesse ltimo aspecto, as principais preocupaes a respeito das
contaminaes
alimentares esto centradas geralmente em torno dos riscos de
contaminao microbiolgica,
resduos de pesticidas, utilizao inadequada de aditivos
alimentares, contaminantes qumicos
incluindo as toxinas biolgicas, adulteraes e mais recentemente
as transformaes advindas
da engenharia gentica, como os alimentos transgnicos, substncias
alergnicas, resduos de
16
medicamentos de uso veterinrio e hormnios (OMS, 2002).
Apesar dos riscos inerentes presena de todos os contaminantes
supracitados, a
contaminao microbiolgica umas das mais relevantes para a sade
pblica, considerando
os elevados ndices de doenas veiculadas por alimentos (DVAs),
provocados por
microrganismos patognicos em todo o mundo (OMS, 2003).
O nmero de surtos de DVAs ocasionado pelo consumo de frutas e
hortalias in
natura tem aumentado ao longo dos anos, fato este observado em
vrios pases do mundo,
onde este grupo de alimentos tem sido considerado como fonte
potencial de microrganismos
patognicos (FDA, 1998; BUCK, WALCOTT & BEUCHAT, 2003).
A maioria dos pases que dispem de sistemas operantes para
notificar casos de
doenas veiculadas pelos alimentos tem documentado aumentos
significativos durante as
ltimas dcadas, e os principais microrganismos implicados so
Salmonella spp,
Campylobacter jejuni e Escherichia coli do tipo enterohemorrgica
(OMS, 2002).
Todo alimento apresenta uma microbiota natural bastante varivel,
concentrada
principalmente na regio superficial (BRENES, 2002). Ao lado
desta microbiota natural, os
alimentos esto sujeitos contaminao por diferentes
microrganismos, provenientes da
atmosfera ambiental, da manipulao, utenslios, equipamentos,
dentre outros, conhecidos
como fatores extrnsecos (VALSECHI, 2006).
Segundo Janisiewicz et al.(1999), as frutas e os vegetais contm
os nutrientes
necessrios para o crescimento rpido de bactrias patognicas. E
apesar das barreiras
mecnicas, como a casca, que impede a entrada dos microrganismos
para o interior destes
alimentos, quando estas se encontram com fissuras ou so
cortadas, esta barreira rompida,
criando assim uma oportunidade para a colonizao bacteriana.
A microbiota presente em vegetais frescos constitui-se
basicamente de
microrganismos pertencentes famlia Enterobacteriaceae e
Pseudomonadaceae
(NASCIMENTO et al., 2005). Entre os gneros da famlia
Enterobacteriaceae, encontra-se a
Escherichia, sendo a principal espcie a Escherichia coli,
pertencente ao grupo dos
coliformes termotolerantes (FRANCO, 1996).
17
3.2.1 Bactrias do grupo coliforme/ Escherichia coli
As bactrias do grupo coliformes compreendem os coliformes totais
e
termotolerantes; neste grupo se incluem as bactrias em forma de
bastonetes Gram-negativos,
no esporognicos, aerbios ou anaerbios facultativos, capazes de
fermentar a lactose com
produo de gs, entre 24 a 48 horas a 35C, os coliformes totais, e
em 24 horas a 44,5 C os
coliformes termotolerantes (CUNHA, 2006).
O grupo dos coliformes totais inclui espcies que podem ser
originrias do trato
gastrintestinal de humanos e animais de sangue quente e outras
no entricas. J o grupo dos
coliformes termotolerantes inclui bactrias originrias do trato
gastrintestinal, o gnero
Escherichia e outras de origem no fecal, como os gneros
Enterobacter e Klebsiella
(FRANCO & LANDGRAF, 1996).
A presena de coliformes termotolerantes nos alimentos pode
indicar qualidade
higinico-sanitria insatisfatria dos mesmos, quer seja pela
contaminao da matria-prima e
do produto nas fases de processamento ou mesmo quando acabado,
podendo inferir tambm, a
respeito da potencial presena de patgenos nestes substratos
(AMNCIO et al., 2003).
Marques (2003) adverte, porm, que a presena de coliformes
termotolerantes em
alimentos menos representativa, como indicao de contaminao fecal
do que a
enumerao de Escherichia coli, por ser, como j foi citado, uma
bactria predominante da
microbiota intestinal.
A Escherichia coli distribui-se a partir das fezes, habitat
especfico e ou primrio,
alcanando o solo e sendo veiculada principalmente atravs da gua
at os vegetais
(AMNCIO et al., 2003).
A Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA) aprovou o
regulamento
tcnico sobre padres microbiolgicos para alimentos, atravs da
Resoluo da Diretoria
Colegiada (RDC), n 12 de 02 de janeiro de 2001 (BRASIL, 2001a).
Esta resoluo
estabelece planos de amostragem, no qual se define o nmero de
unidades a serem analisadas,
bem como o tamanho destas; define os microrganismos que devem
ser estudados para cada
tipo de alimento e estabelece os padres, normas e especificaes
de acordo com outros
rgos internacionais que definiro se o produto ser aprovado ou
no. Para as hortalias in
natura, no sanitizadas, esta legislao estabelece parmetro apenas
para a Salmonella spp.,
18
que ausncia em 25g da amostra. Com relao presena de bactrias do
grupo coliformes,
essa Resoluo somente apresenta padres para hortalias prontas
para o consumo.
No Brasil, algumas pesquisas tm sido conduzidas para verificar a
qualidade
higinico-sanitria das hortalias que so ingeridas in natura.
Dentre os microrganismos
pesquisados, os coliformes termotolerantes so frequentemente
includos. Vrios desses
estudos demonstram a relevncia deste problema, ou seja, a
presena desses microrganismos,
muitas vezes em altos nmeros, nas amostras estudadas
(TAKAYANAGUI et al., 2000;
NOGUEIRA, 2002; CABRINI et al., 2002; NASCIMENTO et al., 2005;
PAULA, 2003;
SIMES et al., 2001; RIBEIRO et al., 2005).
Takayanagui et al. (2000), em Ribeiro Preto - SP analisaram 129
hortas identificando
irregularidades em 20,1% delas, destacando-se a elevada
concentrao de coliformes
termotolerantes em 17% das mesmas. Cabrini et al. (2002)
avaliando 42 amostras de alface
comercializada nos mercados da cidade de Limeira-SP, verificaram
que quase 100% das
mesmas (41) apresentaram coliformes totais e 17 apresentaram E.
coli. Simes et al. (2001),
em Campinas-SP, tambm investigaram a presena desse grupo de
bactrias em hortalias e
condenaram pela anlise bacteriana 22,3% das amostras colhidas em
hortas desta cidade.
Ribeiro et al. (2005) encontraram nmeros mais elevados no
isolamento de coliformes
termotolerantes em 60 amostras de alface colhidas em hortas da
Ilha de So Lus - MA, ou
seja, 83,3% de amostras positivas para o microrganismo.
Apesar de a Escherichia coli exercer um efeito benfico sobre o
organismo,
suprimindo a multiplicao de bactrias prejudiciais e sintetizando
algumas vitaminas,
existem algumas cepas que desenvolveram a habilidade de causar
doena. Estas cepas
patognicas de E. coli podem ser divididas pelo menos em seis
categorias diferentes com
esquemas patognicos distintos (SILVA et al., 2003; NATARO &
KAPER, 1998).
Dentre as linhagens de E. coli patognicas as mais estudadas so:
Escherichia coli
enterotoxignica (ETEC), Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC).
Escherichia coli
enteropatognica (EPEC), Escherichia coli enterohemorrgica (EHEC
ou VTEC),
Escherichia coli enteroagregativa (EaggEC) ( AMNCIO et al.,
2003).
A E. coli enterotoxignica (ETEC) est normalmente associada s
diarrias nos pases
em desenvolvimento e conhecida tambm como diarria do viajante. A
E. coli
enteropatognica (EPEC) e a E. coli enteroinvasiva (EIEC)
infectam principalmente crianas
19
menores de dois anos nos pases em desenvolvimento, sendo que a
EPEC tem sido reportada
como causa importante de diarria no recm nascido (BALBANI &
BUTUGAN, 2001). A
Escherichia coli enteroagregativa (EaggEC) uma linhagem que se
dispe de poucos dados e
sua patogenicidade parece estar relacionada com a adeso mucosa
intestinal, sendo esta
diferente das demais cepas, podendo causar diarria aquosa
(LANDGRAF, 1996).
A Escherichia coli enterohemorrgica (EHEC ou VTEC),
caracteriza-se pela produo
de uma toxina chamada de verotoxina (VT) ou "shiga-like" toxina
(ST), similar produzida
pela bactria Shigella dysenteriae tipo I, associadas colite
hemorrgica (HC) e Sndrome
Urmico Hemoltica (HUS) (WEAGANT et al., 1995; FENG, 1995).
O comportamento sorolgico da Escherichia coli enterohemorrgica
identificado por
meio de antissoros preparados contra as trs variedades de
antgenos que podem estar
presente: O, antgeno somtico; K, antgeno capsular e H, antgeno
flagelar. Existem vrios
sorovares catalogados, sendo O26: H11 e O157: H7 os mais
citados, destacando-se este
ltimo como agente etiolgico da grande maioria de surtos fora do
Brasil (KOBAYASHI,
2001).
Estas cepas diferem das demais cepas de E.coli em algumas
caractersticas,
destacando-se a no fermentao do sorbitol, a no produo da enzima
-glicuronidase e o
seu crescimento pobre ou nulo a 44C (MARCH & RATNAM, 1986).
A Escherichia coli
O157: H7 apresenta tambm a habilidade para se desenvolver em
valores de pH prximos a 3
e 4, o que a distingue de outros patgenos e atribui-lhe a
caracterstica cido-resistente
(DOYLE, 1989).
A sintomatologia decorrente da doena provocada pela Escherichia
coli O157: H7
caracteriza-se inicialmente por um quadro severo e sbito de HC,
acompanhado
posteriormente por diarria aquosa, sangramento e no caso de
pacientes com a imunidade
mais baixa, pode evoluir para um grave acometimento renal, a HUS
(FDA, 2006a).
A Escherichia coli O157 foi isolada pela primeira vez em 1975,
nos Estados Unidos, a
partir de fezes de doentes que apresentavam diarria
sanguinolenta. Entretanto, o seu
reconhecimento como microrganismo responsvel pela gnese desta
enfermidade s ocorreu
na dcada de 80, associado a um surto ocorrido em estados
americanos, aps o consumo de
hambrgueres contaminados pela bactria, oriundos de uma grande
rede de fast-foods
(DOYLE, 1989; TAUXE, 1997).
20
Na dcada de 90 ocorreu um surto maior envolvendo 600 pessoas e
quatro mortes,
provocadas tambm pelo consumo de hambrgueres em uma rede de
lanchonete, o que
contribuiu para aumentar a sua importncia como patgeno de
veiculao alimentar (BELL,
GOLDOFT, GRIFFIN, 1994). A partir da, as pesquisas demonstraram
que o trato intestinal
de ruminantes, particularmente bovinos e ovinos, parece ser o
principal reservatrio das cepas
enterohemorrgicas de E. coli O157: H7 (TAUXE, 1997).
A transmisso de E. coli O157: H7 em surtos e casos de HC e HUS,
sempre esteve
relacionada principalmente ao consumo de produtos de origem
animal, especialmente a carne
bovina e seus derivados, leite cru e iogurte (DOYLE, 1989; FDA,
1998). Nos ltimos 10
anos, no entanto, verificou-se um aumento significativo no nmero
de surtos associados a
outros alimentos alm da carne, em particular as frutas, os sucos
de frutas, os vegetais e as
saladas preparadas com vegetais (FDA, 2006a). Recentemente, o
Food and Drug
Administration - FDA notificou um surto envolvendo 26 estados
americanos, onde 183 casos
da doena provocada pela E. coli O157: H7 foram relatados,
incluindo 29 casos com a
sndrome urmica hemoltica (HUS), tendo sido registrada uma morte.
O surto foi atribudo
ao espinafre consumido cru ou em preparaes onde o mesmo era
utilizado cru (FDA, 2006c).
Segundo informaes do Centers for Disease Control and Prevention
(FDA, 2006b),
so estimados 73.000 casos de infeco por Escherichia coli O157:
H7 e 61 mortes por ano
nos Estados Unidos. A infeco pode ocorrer atravs do consumo de
alimentos contaminados
ou pela transmisso da bactria de uma pessoa para outra devido a
hbitos higinicos
inadequados.
No Brasil, de maneira especfica, ainda no h relatos de surtos
epidmicos
relacionados E. coli O157: H7 (AMNCIO et al., 2003).
O Centro de Vigilncia Epidemiolgica do Estado de So Paulo
(CVE/SP, 2002),
registrou no perodo de 1998 a 2000, 15 casos de HUS em hospitais
pblicos do Estado, com
histrico anterior de diarria e possvel associao com E. coli
O157: H7. Nos casos em que
foi feita a coprocultura, a presena de E.coli foi detectada, mas
o agente no foi isolado e/ou
sorotipado para confirmao.
No Rio Grande do Sul, um estudo retrospectivo de casos de HUS
ocorridos no
Hospital Universitrio da Universidade Federal de Santa Maria, no
perodo de maro de 1997
a agosto de 1999, apontou a existncia de 31 casos da doena em
crianas com idade de dois
21
a 57 meses (CVE/SP, 2002). Esses relatos confirmam a existncia
da sndrome hemorrgica
urmica - HUS no pas e deixam clara a necessidade de
monitoramento dessa bactria em
diferentes produtos e regies (SILVA et al., 2003).
A dose infectante para a contaminao humana por Escherichia coli
O157: H7 no
conhecida, porm avaliando-se dados de surtos, incluindo a
habilidade do organismo de ser
transmitido de pessoa a pessoa, a dose pode ser similar quela de
Shigella spp., ou seja,
apenas 10 organismos so suficientes para causar a doena (FDA,
2006a).
No perodo de janeiro de 1997 a outubro de 1999 foi feito uma
investigao quanto a
ocorrncia de Escherichia coli 0157: H7 em 2.095 amostras de
alimentos produzidos no sul e
sudeste do Brasil, incluindo 1.111 amostras de produtos crneos
(hambrguer e lingia), 115
amostras do ambiente industrial (frigorficos) e 869 amostras de
vegetais (alface, chicria e
rcula), porm no foi detectada a presena do patgeno em nenhuma
das amostras analisadas
(SILVA et al., 2003).
3.2.2 Salmonella spp.
A Salmonella outro gnero de grande relevncia como patgeno
alimentar
pertencente famlia Enterobacteriaceae; so bacilos
Gram-negativos, no produtores de
esporos, anaerbios facultativos, produzem gs a partir da glicose
(exceto Salmonella Typhi),
so capazes de utilizar o citrato como nica fonte de carbono,
sendo a maioria mvel
(FRANCO & LANDGRAF, 1996).
O principal reservatrio desta bactria o trato gastrintestinal do
homem e de animais,
principalmente aves e sunos. Este gnero abriga as espcies
causadoras de febre tifide
(Salmonella Typhi), febres entricas (Salmonella Paratyphi A, B,
C) e das enterocolites que
genericamente se enquadram no grupo das doenas designadas por
salmoneloses (FRANCO
& LANDGRAF, 1996).
Pesquisas tm demonstrado que a Salmonella pode sobreviver por at
87 dias em gua
de abastecimento pblico, 115 dias em solo de jardim, acima de 30
meses em esterco bovino
seco e 28 meses em fezes de aves infectadas (FARIAS, 2000).
A dose infectante do microrganismo pode variar entre 15 a 20
clulas a depender da
22
idade e da imunidade da pessoa infectada e do tipo de cepa
envolvida (FDA, 2006c). Estima-
se de dois a quatro milhes de casos de salmoneloses nos Estados
Unidos anualmente, sendo
os sorotipos mais comuns o Typhimurium e o Enteritidis (CDC,
2005; FDA, 2006d,2006e).
No Brasil o sorotipo de Salmonella mais freqentemente isolado de
casos de infeces
humanas e tambm de materiais de origem no humana, principalmente
alimentos, a
Salmonella Enteritidis (BRASIL, 2002).
Levantamento realizado entre os anos de 1991 a 1995, pelo
Instituto Adolfo Lutz de
So Paulo, com 2.254 linhagens isoladas de casos de infeces
humanas e 3.236 de materiais
de origem no humana, evidenciou um aumento significativo na
participao da S. Enteritidis,
ou seja, um incremento de 1,2% para 64,9% entre as amostras
humanas e de zero para 40,7%
para as amostras no humanas, com expressivo aumento a partir de
1993, particularmente em
ovos, aves (matrizes) e amostras do meio ambiente (TAVECHIO et
al., 1996).
Apesar da principal fonte de transmisso de Salmonella ser os
alimentos de origem
animal, vrios estudos realizados com produtos de origem vegetal
detectaram a presena da
bactria nos mesmos. Takayanagui et al. (2000), em Ribeiro Preto,
SP, analisaram hortalias
provenientes de 129 hortas, encontrando a presena de Salmonella
spp. em 3,1% das mesmas.
Bruno et al. (2005) tambm estudando vegetais minimamente
processados, detectaram a
presena de Salmonella spp. em 66,6% das amostras de hortalias e
tubrculos e em 26% das
frutas investigadas. Pal et al. (2002) encontraram Salmonella
spp. em cinco (16,6%) das 30
amostras analisadas de vegetais crus (frutas e hortalias),
comercializadas em restaurantes do
Rio de Janeiro, RJ. Sousa et al. (2002) investigaram a presena
do microrganismo em sucos e
nctares de frutas comercializados por uma indstria em Belm-PA, e
encontraram
positividade em 4,2 % das amostras analisadas.
Embora os sorotipos mais isolados no Brasil pertenam Salmonella
Enteritidis, a
febre tifide provocada pela Salmonella Typhi tambm uma preocupao
atual, pois se trata
de uma doena de distribuio mundial associada situao precria de
saneamento bsico,
higiene pessoal e ambiental. Transmitida principalmente atravs
da ingesto de gua ou de
alimentos contaminados com fezes humanas ou com urina. Ocorre no
Brasil de forma
endmica, com algumas epidemias onde as condies so mais precrias
(BRASIL, 2006a).
23
3.3 Prticas agrcolas: Condies higinicas sanitrias dos locais de
produo, insumos e
manipuladores.
Pelo fato das hortalias serem produzidas sob diferentes condies
climticas,
estruturais e utilizando-se prticas agrcolas diversas,
pressupe-se que os perigos
microbiolgicos variem entre estes sistemas. Portanto, todos os
procedimentos devem ser
conduzidos sob condies higinicas e estruturais satisfatrias,
visando minimizar os riscos
potenciais a sade do consumidor (FDA, 1998).
Os riscos microbianos que afetam a segurana dos alimentos podem
estar presentes em
qualquer ponto da cadeia produtiva, desde o cultivo, colheita,
lavagem, armazenamento,
transporte, comercializao e finalmente na mesa do consumidor
(RANTHUM, 2002).
Durante o cultivo, as fontes potenciais de contaminao devem ser
identificadas.
Freqentemente observam-se irregularidades com a gua utilizada, o
adubo, saneamento
bsico, a presena de animais nos locais de produo, alm de outras
deficincias na infra-
estrutura dos locais de produo e manejo agrcola (MORETTI,
2003).
A produo agrcola de hortalias provoca um desgaste muito grande
da matria
orgnica do solo, pelo uso intensivo da mesma rea (BRASIL, 1999).
Dessa forma, visando
aumentar a produtividade e melhorar o cultivo, os agricultores
optam muitas vezes pelo uso
de adubos orgnicos, como por exemplo, o esterco animal, pelo
baixo custo e pela sua
eficcia como fertilizante (EMBRAPA, 2001b). Essa fonte de adubo
indevidamente tratada
pode conter patgenos e contaminar as hortalias, como por
exemplo, a Escherichia coli
0157: H7, que pode sobreviver por at 70 dias nas fezes destes
animais (TAUXE, 1997).
Culturas rentes ao solo, como algumas hortalias folhosas, so
mais vulnerveis a
patgenos que podem sobreviver no solo, ou serem borrifadas com
terras contaminadas
durante a irrigao ou chuvas fortes (FDA, 1998). Terras que foram
usadas para outras
atividades, como solos que anteriormente serviram como depsitos
de lixo, podem apresentar
contaminao por bactrias patognicas, pois contm matria orgnica em
decomposio e
possivelmente material fecal (EMBRAPA, 2001a).
A rea de cultivo quando situada em regies ngremes favorece o
escoamento de guas
superficiais contaminadas, situao essa que se agrava com a
presena de residncias
prximas a este local que no dispem de drenagem adequada para as
guas servidas (LEITE,
24
2000). Acresce a isso a presena de animais circulando nas hortas
ou em reas prximas, pois
suas fezes constituem uma fonte de patgenos que podem contaminar
as hortalias (MORETI,
2003).
Outros fatores como a inexistncia de instalaes sanitrias
adequadas para os
trabalhadores ligados ao cultivo e colheita das hortalias
implica em m administrao dos
dejetos humanos, podendo aumentar bastante o risco de contaminao
da lavoura (LEITE,
2000).
De acordo com Silva Jr. (2001), a sade e a higiene pessoal dos
trabalhadores que
entram em contato direto com os alimentos devem ser monitoradas.
Funcionrios que
apresentam algum tipo de molstia, como ferimentos na pele
infeccionados, diarria, gripe e
vmito, podem veicular microrganismos para os alimentos, devendo,
portanto, serem
encaminhados para avaliao mdica e se necessrio afastados de suas
atividades.
3.4 gua de irrigao
A gua est se tornando, cada vez mais um bem escasso e sua
qualidade vem se
deteriorando muito rapidamente (OPAS, 2001). Em razo do
crescimento natural da
populao e dos altos ndices de contaminao das fontes de gua, a
oferta deste produto de
boa qualidade, principalmente em reas urbanas constitui um
grande desafio (FILIZOLA et
al., 2002).
De acordo com o relatrio Situao Global de Suprimento de gua e
Saneamento
do ano 2000, da Organizao Pan-americana de Sade, 2,4 bilhes de
pessoas no vivem em
condies aceitveis de saneamento, enquanto 1,1 bilhes de pessoas
no tm acesso a um
adequado abastecimento de gua (OPAS, 2001).
A gua utilizada na lavoura envolve diversas operaes, tais como:
irrigao,
aplicao de pesticidas, fertilizantes e lavagem das hortalias
(MORETTI, 2003). O principal
objetivo da irrigao consiste em fornecer gua s culturas de forma
eficiente. Para satisfazer
a esta demanda cerca de 70% do consumo hdrico do mundo
destina-se a esta finalidade
(GINESTE, 2004). A agricultura irrigada, em muitas situaes, a
nica maneira de se
garantir a produo de alimentos, em bases sustentveis e com
segurana, mesmo em perodos
de escassez de chuvas (AMORIM, 2003).
25
Os recursos hdricos utilizados para a irrigao, encontram-se
segundo Oliveira et al.
(2001), na sua grande maioria, a partir de guas provenientes de
rios, crregos e lagos
adjacentes s plantaes, sem nenhum tratamento prvio, podendo esta
ser uma fonte
potencial de contaminao. Este problema torna-se ainda mais grave
nos cintures verdes dos
grandes centros urbanos, onde quase toda a gua superficial est
severamente contaminada
por efluentes municipais no tratados (MAROUELLI & SILVA,
1998).
De acordo com alguns pesquisadores, a contaminao microbiolgica
das hortalias
durante o seu cultivo ocorre principalmente devido irrigao com
gua contaminada ou
quando se utiliza adubo como dejetos humanos (FDA, 1998;
OLIVEIRA & GERMANO,
1992; SILVA et al., 2005).
Os principais fatores que contribuem para contaminao microbiana
destas guas so
as condies ecolgicas em que se encontram as fontes de gua, tais
como: proximidade com
reas domsticas, poluentes do tipo lixo, currais, canais,
esgotos, fossas, presena de adubo
orgnico prximo s fontes, declive acentuado do solo, presena de
animais, poos artesianos
com as instalaes precrias e utilizao de gua proveniente de rios
e riachos contaminados
(OLIVEIRA et al., 2001).
As guas residurias domsticas, quando utilizadas sem tratamento
adequado, podem
contaminar o ambiente por concentrarem bactrias, parasitas e
vrus que geram graves
problemas de sade pblica, uma vez que propagam enfermidades de
veiculao hdrica, que
podem afetar no s os trabalhadores, mas tambm, os provveis
consumidores das culturas
irrigadas (SOUSA et al., 2006).
No planejamento de irrigao todas as medidas devem ser tomadas
para reduzir a
demanda de gua potvel para este fim, optando-se por vias
alternativas, incluindo o reuso de
guas servidas. No entanto, as mesmas devem ser tratadas antes de
serem utilizadas, medida
que nem sempre ocorre (SOUSA et al., 2006).
3.4.1 Qualidade microbiolgica e doenas veiculadas pela gua de
irrigao
O transporte de microrganismos patognicos pela gua representa um
fator importante
no comprometimento dos recursos hdricos e na disseminao de
processos infecciosos, em
26
especial quando sistemas de abastecimento de gua e tratamento de
esgotos so precrios
(RIVERA & MARTINS, 1996).
Os principais agentes biolgicos encontrados nas guas
contaminadas so as bactrias,
os vrus e os parasitos (OMS, 2000). As doenas de veiculao hdrica
so causadas
principalmente por microrganismos patognicos de origem entrica,
animal ou humana,
transmitidas basicamente pela rota fecal-oral, ou seja, os
microrganismos so excretados nas
fezes de indivduos infectados e ingeridos na forma de gua ou
alimento contaminado por
gua poluda com fezes (AMARAL et al., 2003).
Nos pases em desenvolvimento, em conseqncia das precrias condies
de
saneamento e da m qualidade das guas, as doenas de veiculao
hdrica, como a febre
tifide, clera, salmonelose, hepatite A e verminoses, tm sido
responsveis por diversos
surtos e elevadas taxas de mortalidade infantil. Nesses pases,
as doenas diarricas
acometem em torno de 1,5 bilhes de crianas com at cinco anos de
idade a cada ano (OMS,
2000).
Vrias agentes patognicos podem estar presentes em fontes de gua
ou em guas
residurias, sendo que os principais envolvidos em surtos so:
Shigella spp., Salmonella spp.,
Campylobacter spp., Escherichia coli, Vibrio cholerae, dentre
outros (OMS, 2003;
MORETTI, 2003). Dessa forma, sempre que a gua permanecer em
contato com produtos
agrcolas frescos, sua qualidade poder influenciar diretamente no
potencial de contaminao
destes produtos (EMBRAPA, 2001a), especialmente quando a parte
comestvel do alimento
exposta em contato direto com a gua contaminada, ou quando a
irrigao realizada prxima
ao horrio de colheita (FDA, 2001).
Segundo, Steele & Odumeru (2004), o risco da transmisso de
doenas causadas por
microrganismos patognicos presentes na gua de irrigao
influenciado pelo nvel de
contaminao das mesmas, pela persistncia do patgeno na gua, no
solo, na colheita e de
acordo com a rota da exposio.
27
As tcnicas de isolamento e identificao dos microrganismos
patognicos a partir da
gua so complexas, onerosas e a obteno dos resultados demanda
muito tempo, por isto ao
invs de verificar a presena de agentes patognicos, pesquisa-se a
presena de
microrganismos indicadores de poluio fecal, representado pelos
coliformes termotolerantes
(MARQUES, 2003).
A presena de coliformes totais nos alimentos no indica,
portanto, a contaminao
fecal recente ou ocorrncia de enteropatgenos, sendo assim, a
enumerao de coliformes
totais em gua menos representativa como indicao de contaminao
fecal comparada
coliformes termotolerantes (LANDGRAF, 1996).
O padro microbiolgico para a gua de irrigao, vigente no Brasil,
foi
regulamentado pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA),
atravs da
Resoluo no. 357 de 17 de maro de 2005 (CONAMA, 2005). Esta
normativa estabelece a
classificao das guas com base nos usos preponderantes,
estabelecendo nveis de qualidade
a ser alcanado e ou mantidos. Assim a gua destinada irrigao de
hortalias consumidas
cruas, recebe a classificao de Especial, tipo1, no devendo
exceder um limite de 200
coliformes termotolerantes por 100 mililitros em 80% ou mais, em
pelo menos seis amostras
coletadas durante o perodo de um ano, com freqncia
bimestral.
Vrios estudos tm demonstrado a contaminao da gua de irrigao em
hortas no
Brasil. Leite (2000) verificou atravs da anlise microbiolgica a
presena de bactrias do
grupo coliformes totais em 93,5% das guas e coliformes fecais em
65,2% delas. Nogueira
(2003), em estudo com hortas no municpio de Jaboticabal, SP,
encontrou 22,9% de
coliformes fecais na gua de irrigao no perodo chuvoso e 23,5% em
perodo sem chuva.
Marques (2002), em Goinia Go encontrou em seu estudo 93,2% de
contaminao
por coliformes termotolerantes e 86,41% de Escherichia coli na
gua de irrigao de
hortalias.
Farache Filho et al. (2001) verificaram que entre as 47 hortas
pesquisadas, 40,4%
tiveram pelo menos uma das amostras de gua acima do padro
brasileiro vigente. Solomon et
al. (2002), estudando a transmisso de Escherichia coli O157: H7
s plantas atravs de dois
sistemas diferentes de irrigao, demonstraram a possibilidade de
contaminao em ambos,
sendo que em um deles (sistema de pulverizao), um percentual
significativo das culturas
permaneceu com a bactria at 20 dias aps a irrigao. Os resultados
deste estudo sugerem
28
que no obstante o mtodo da irrigao usado, as colheitas podem se
tornar contaminadas.
3.5 Consideraes sobre o controle sanitrio na produo de hortalias
e doenas
veiculadas por alimentos
Um alimento pode apresentar risco sade por razes como:
contaminao ou
crescimento microbiano; uso inadequado de aditivos qumicos; adio
acidental de produtos
qumicos; poluio ambiental ou degradao de nutrientes. H um
consenso geral de que o
problema mais importante do ponto de vista de sade pblica a
ingesto de alimentos
contaminados por microrganismos patognicos (FRANCO &
LANDGRAF, 1996).
A deficincia no controle da qualidade sanitria em qualquer uma
das etapas da cadeia
alimentar, durante o cultivo, colheita, armazenamento,
transporte e comercializao um
fator predisponente ocorrncia de casos ou surtos de doena
veiculada por alimento (DVA)
(BRASIL, 2002).
A identificao dos riscos inerentes a um processo produtivo
constitui ferramenta
valiosa para reconhecer as aes preventivas que possam ser
implementadas (COSTA, 1999).
Entretanto, o desenvolvimento de estratgias para reduzir os
riscos relacionados com a
alimentao, requer o conhecimento prvio de dados sobre as DVAs do
local, para evidenciar
o problema sade pblica e facilitar o desenvolvimento de aes
baseado nos riscos que
aquele alimento oferece (OMS, 2002).
As ltimas notificaes de doenas transmitidas por alimentos, no
mundo, indicam o
surgimento de um novo cenrio epidemiolgico, caracterizado
principalmente pela rapidez de
propagao, alta patogenicidade e carter cosmopolita dos agentes
patognicos, com especial
destaque aos infecciosos, como Listeria monocytogenes e
Salmonella spp. (LOPES, 2005).
A evoluo da dinmica das DVAs, incluindo o surgimento dos novos
patgenos
acima referidos, a globalizao da economia e o intercmbio
internacional, aumentam o risco
de contaminao dos alimentos (LOPES, 2005). H de se considerar
tambm o crescente
aumento da populao implicando na necessidade de produo em grande
escala de
alimentos, o aumento no consumo de fast-foods, processos de
urbanizao desordenados, a
existncia de grupos populacionais vulnerveis ou mais expostos
devido ao aumento da
expectativa de vida atravs do consumo de novas drogas e
diagnsticos mais precoces, e o
29
deficiente controle dos rgos pblicos e privados (BRASIL,
2006b).
Outro fator contribuinte para o aumento das DVAs est relacionado
a mudana de
hbitos alimentares, especificamente o aumento no consumo de
vegetais frescos, frutas e
verduras sem a adequada higienizao ( BRASIL, 2006b; BUCK et al.,
2003 ).
A vigilncia das DVAs fundamental para o fornecimento de
alimentos incuos, pois
serve como eixo para direcionar as aes mais prioritrias, avaliar
os programas preventivos
e de controle implementados, auxiliando tambm na identificao de
questes que podem
surgir relacionadas inocuidade dos alimentos (OMS, 2004).
Na maioria das vezes, em funo da ausncia de sistemas de
vigilncia sanitria ou
debilidade dos programas de controle das DVAs, principalmente
nos pases em
desenvolvimento, as informaes mundiais existentes no representam
a magnitude do
problema, estimando-se uma incidncia de 10% nos pases com
sistemas de informao mais
eficientes e apenas 1% nos demais pases com sistemas
incipientes, como o caso do Brasil
(RANTHUM, 2002).
O perfil epidemiolgico das DVAs no Brasil pouco conhecido,
somente alguns
estados dispem de estatsticas e dados sobre os agentes
etiolgicos mais comuns, alimentos
mais freqentemente implicados, populao de maior risco e fatores
contribuintes (BRASIL,
2002).
O Art. 6, Pargrafo 1 da Lei Federal n 8.080 de 19/09/1990, que
dispe sobre as
condies para a promoo, proteo e recuperao da sade, define a
Vigilncia Sanitria
como um conjunto de aes capaz de eliminar, diminuir ou prevenir
riscos a sade e de
intervir nos problemas sanitrios decorrentes do meio ambiente,
da produo e circulao de
bens e da prestao de servios de interesse da sade. Esta atribuio
da vigilncia sanitria
lhe confere um papel fundamental para que os alimentos
oferecidos populao sejam
seguros e com qualidade (BRASIL, 1990).
Contudo, segundo Silva (1998), a ocorrncia de doenas infecciosas
transmitidas por
alimentos pode ser vista como falha na implantao das medidas de
inspeo e controle
vigentes no pas.
30
3.6 Sanitizao de hortalias
O risco de toxinfeces humanas por patgenos de origem alimentar,
pode ser
reduzido prevenindo-se a contaminao dos alimentos, controlando o
crescimento dos
microrganismos patognicos, removendo-os ou diminuindo-os atravs
das lavagens e uso de
sanitizantes (BEUCHAT, 2004).
De acordo com o FDA (1988), a preveno da contaminao das
hortalias
prefervel aplicao de agentes qumicos antimicrobianos, porm isto
nem sempre
alcanado, devido existncia de falhas no controle das etapas que
antecedem o consumo .
Segundo Silva Jr. (2001), a higienizao dos alimentos se
caracteriza principalmente, pelos
processos atravs dos quais os alimentos se tornam higienicamente
e sanitariamente
adequados para o consumo, utilizando-se vrias tcnicas de
processamento, dentre estas os
produtos para limpeza e desinfeco dos alimentos.
A lavagem em gua corrente de boa qualidade pode reduzir em at
74% a carga
microbiana dos vegetais (LEITO et al., 1981), porm, no
suficiente para manter a
contaminao em nveis seguros, sendo essencial aplicao de uma
etapa de desinfeco
com agentes antimicrobianos (LEITO et al., 1981, TAKEUSHI &
FRANK, 2001).
De acordo com o estudo realizado por NASCIMENTO (2002), aps a
lavagem de
hortalias em gua corrente, as mesmas permaneceram com altos
ndices de contaminao,
atribudas s etapas de produo, transporte e comercializao.
Concluindo desta forma, que
apenas a lavagem em gua corrente no foi suficiente para diminuir
a carga microbiana a
nveis seguros.
No entanto, Leito et al. (1981), ressaltam que a pr-lavagem em
gua corrente um
requisito essencial para retirada da matria orgnica na superfcie
das hortalias, diminuindo
assim a inativao dos sanitizantes qumicos utilizados
posteriormente na etapa da
sanitizao. Para Brenes (2002), os agentes sanitizantes so
substncias qumicas que podem
destruir ou reduzir substancialmente a populao de microrganismos
presentes na gua de
lavagem e resfriamento, reduzindo a contaminao cruzada, como
tambm podem reduzir,
mas no eliminar os patgenos da superfcie dos produtos.
A eficcia dos sanitizantes em produtos de origem vegetal
frequentemente
questionada, em parte atribuda inacessibilidade dos sanitizantes
na estrutura interna ou nos
31
tecidos destes vegetais, que podem abrigar patgenos (TAPIA DE
DAZA & DIAZ, 1994).
Burnett & Beuchat (2000), destacam a presena da cutcula
hidrofbica dos vegetais, as
superfcies morfolgicas diferentes e as abrases na epiderme dos
vegetais, como fatores
limitantes para a eficcia dos sanitizantes. Outro fator
importante so as prticas de
manipulao durante o processo de sanitizao dos alimentos, pois
quando realizadas
inadequadamente, podem significar uma fonte potencial de
contaminao (FDA, 1988;
LUENGO & LANA, 2007).
De acordo com Santana et al. (2002) a sanitizao de vegetais, sob
o ponto de vista de
segurana alimentar, considerada etapa crtica do processamento,
assim tambm como os
aspectos de higiene pessoal na manipulao do produto. Estatsticas
de pases industrializados
revelam que 60% das intoxicaes alimentares so atribudas
manipulao incorreta de
alimentos, sugerindo um ndice ainda mais elevado para os pases
em desenvolvimento, em
funo das precrias condies de infra-estrutura e educao dos seus
habitantes
(NASCIMENTO et al., 2002).
3.6.1 Agentes sanitizantes e a sua eficincia na eliminao de
patgenos
A lavagem dos vegetais a prtica mais comum para se obter um
produto mais seguro,
entretanto, a eficcia da operao de lavagem pode ser aumentada
acrescentando solues
sanitizantes, objetivando a reduo e ou eliminao de
microrganismos presentes nestes
alimentos (BERBARI et al., 2001).
A atividade germicida de sanitizantes utilizados na indstria de
alimentos depende de
vrios fatores, entre estes: concentrao, tempo, temperatura, pH,
solubilidade, concentrao
de matria orgnica, tipo de superfcie e espcie e populao do
microrganismo que se quer
destruir (BEUCHAT et al., 2001; BRENES, 2002).
Segundo a Association of Official Analytical Chemists (AOAC,
1995), um
sanitizante para ser considerado eficaz dever reduzir 99,999%,
ou seja, cinco ciclos
logartmicos, da populao microbiana inicial. Vrios agentes
sanitizantes vm sendo
utilizados na higienizao de frutas e hortalias, sendo os mais
comumentes utilizados aqueles
base de cloro (BRENES, 2002). Porm, segundo Beuchat et al.
(1988), o cloro utilizado nas
concentraes recomendadas (
32
no elimina mais do que dois ciclos logartmicos da microbiota de
frutas e vegetais.
No estudo conduzido por Nascimento et al. (2003), foi realizada
uma avaliao
comparativa da eficincia do hipoclorito de sdio a 200 mg L -1,
dicloroisocianurato de sdio
a 200 mg L -1, cido actico 2,0% e 4,0%, cido peractico 80 mg L
-1 e vinagre 6,0%, 25,0%
e 50,0% na sanitizao de uva. A anlise estatstica dos resultados
demonstrou que todos os
sanitizantes testados apresentaram eficincia semelhante ou
superior ao hipoclorito de sdio.
Fantuzzi et al. (2004) observaram que aps a sanitizao do repolho
por 10 minutos,
temperatura ambiente, em solues sanitizantes de hipoclorito de
sdio a 200 mg L-1,
composto orgnico clorado a 200 mg L-1 ou cido actico a 1%, a
reduo de microrganismos
aerbios mesfilos foi de no mximo 1,8 log10 UFC g-1. Takeuchi
& Frank (2001) avaliaram
o efeito do hipoclorito de sdio (200 mg L-1 de cloro residual
livre/ 5 min/ 22C) sobre E.coli
O157: H7 inoculada na superfcie intacta e em cortes de folhas de
alface, observando 0,3 e 0,4
redues decimais, respectivamente.
Segundo alguns pesquisadores, em adio ao limitado efeito da
lavagem com
hipoclorito, o sistema pode produzir substncias carcinognicas
como trihalometanos,
(FERRARIS et al., 2005; DUNNICK & MELNICK, 1993). Tais
substncias so denominadas
subprodutos da clorao, originrias das reaes entre o cloro e as
substncias orgnicas
presentes na gua, os cidos hmico e flvico (MACEDO et al.,
2001).
H, portanto, um grande interesse em desenvolver sanitizantes
alternativos para a
lavagem de vegetais e frutas, por parte das indstrias de
alimentos, que sejam mais eficazes
que o hipoclorito para reduzir ou eliminar patgenos em produtos
frescos, e que no possuam
efeitos deletrios ao organismo humano (NASCIMENTO et al.,
2003).
Neste aspecto destacam-se os cidos orgnicos de cadeia curta, que
embora no sejam
considerados sanitizantes, tm sido muito utilizados em estudos
de reduo de populao
bacteriana em alimentos (FDA, 2001; NASCIMENTO et al.,
2003).
Os cidos orgnicos de cadeia curta so produzidos a partir do
metabolismo natural
das frutas e hortalias, entre estes se destacam: os cidos
actico, benzico, ctrico, mlico,
srbico, succnico e tartrico (FDA, 2001). Os mesmos proporcionam
uma proteo natural
contra a proliferao de patgenos bacterianos, visto que, a
maioria destes microrganismos
no pode se desenvolver a um pH inferior a quatro, embora alguns
tipos possam adaptar-se a
33
este pH e provocar enfermidades (BRENES, 2002).
A eficcia dos cidos orgnicos como sanitizantes ou
antimicrobianos varia
amplamente com o tipo de cido empregado e com a clula bacteriana
presente (BRENES,
2002). So compostos com caractersticas lipoflicas solveis em sua
forma no dissociada, o
que permite sua entrada na clula, interferindo na fosforilao
oxidativa, inibindo o transporte
de eltrons e a produo da adenina dinucleotdeo reduzido - NADH.
Esse comprometimento
da atividade metablica em combinao com a acidificao do contedo
celular resulta na lise
da clula (NASCIMENTO, 2002).
A atividade antimicrobiana dos cidos orgnicos pode ser
classificada em duas
categorias: ao bacteriosttica, inibio do crescimento bacteriano
e ao bactericida, que
seria a reduo do nmero de clulas viveis (BJORNSDOTTIR,
2005).
O vinagre e o suco de limo contendo os cidos actico e ctrico,
respectivamente, so
usados como flavorizantes e acidificantes para saladas de
vegetais e podem ser considerados
como sanitizantes alternativos para remover ou pelo menos
reduzir a carga de patgenos, no
causando risco sade dos consumidores (SEGUN & KARAPINAR,
2004). Essas
substncias so geralmente reconhecidas como seguras ou General
Recognized as Safe
(GRAS) pelo Cdigo Federal de Regulamentaes dos Estados Unidos.
No Brasil, o cido
ltico e o cido peractico tm seu uso aprovado como sanitizantes
para ovos, carcaas e
partes de animais de aougue, atravs das Resolues RDC n 7 de 02
de janeiro de 2001 e
RDC n 02 de 08 de janeiro de 2004 da Agncia Nacional de
Vigilncia Sanitria,
respectivamente (BRASIL, 2001a, BRASIL, 2004). Porm em outros
pases, o vinagre e o
cido actico podem ser utilizados. Esses produtos ganharam
aceitao no comrcio
internacional tanto em funo das controvrsias da toxidade do
cloro em alimentos, como
tambm por serem considerados to eficazes e seguros quanto o
cloro (NASCIMENTO,
2002).
A atividade antimicrobiana dos cidos orgnicos de cadeia curta
vem sendo estudada
por vrios pesquisadores. Silva et al. (2001), avaliaram a
sanitizao de carcaas de frango
com solues de cidos orgnicos comerciais e suco de limo, e
concluram que todos os
tratamentos foram eficientes na reduo da contaminao inicial, com
destaque para o cido
actico que eliminou cepas de Salmonella spp. Castillo &
Escartin (1994), avaliaram a
sobrevivncia do Campylobacter jejuni em mamo e em melancia aps a
aplicao do suco
34
do limo superfcie de cubos inoculados das frutas, e observaram
reduo significativa nas
contagens desta bactria durante o armazenamento das frutas.
Segun & Karapinar (2004) avaliaram a eficcia do suco de
limo, vinagre e a mistura
de limo com vinagre na eliminao de Salmonella Typhimurium
inoculada artificialmente
em rcula e cebola, conseguindo redues significativas,
principalmente na mistura do
vinagre com o limo. Vijayakumar & Hall (2002), avaliando o
efeito bacteriosttico e
bactericida da concentrao mnima de sanitizantes, incluindo o
vinagre e suco de limo,
contra cepas de Escherichia coli em caldo tripticasena de soja
(TSB), demonstraram que
estes sanitizantes em concentraes relativamente baixas
apresentavam atividade bactericida
contra as cepas testadas.
Eiroa & Porto (1995), avaliaram o efeito bactericida de
diferentes desinfetantes a base
de cloro e vinagre contra linhagens de Vibrio cholerae
inoculados em alface e concluram que
o vinagre foi o melhor dos produtos avaliados, seguido em ordem
decrescente de eficincia
pelos compostos base de dicloroisocianurato de sdio e
hipoclorito de sdio.
35
4 MATERIAL E MTODO
4.1 Material
4.1.1 Alimentos
Alface crespa (Lactuca sativa), couve (Brassica oleracea),
coentro (Coriadrum
sativum) e hortel (Mentha villosa).
4.1.2 Cepas dos microrganismos de referncia
Escherichia coli 0157: H7, Escherichia coli ATTCC 23229,
Salmonella spp.,
Salmonella Typhi.
4.1.3 Solues de tratamento
Vinagre de lcool (Marca Minhoto); Limo, variedade Taiti
4.1.4 Formulrio estruturado tipo check-list
4.1.5 Meios de cultura e reagentes
Caldo Tripticase de Soja (TSB) (OXOID),
Caldo Tetrationato (MERCK)
Caldo Rappaport (MERCK)
Caldo Lauril Sulfato Triptose (MERCK),
Caldo EC (MERCK)
Caldo Lactosado Bile Verde Brilhante a 2% (MERCK)
Brain Heart Infusion Broth (BHI) (DIFCO)
gar entrico Hektoen ( HE) (MERCK)
36
gar Salmonella Shigella (SS) (MERCK)
gar Verde Brilhante (MERCK)
gar Tryptic Soy (TSA) (OXOID)
Meio SIM (DIFCO)
gar Eozina Azul de Metileno (EMB) (DIFCO)
gar MacConkey sorbitol (HIMEDIA), adicionado de 0,05mg/L de
Cefixina
Agar Triple Sugar Iron (TSI) (DIFCO)
gar Lisina-ferro (LIA) (DIFCO)
Caldo VM-VP (Vermelho de metila/Voges Proskauer) (DIFCO)
gar Uria (DIFCO)
Agar Citrato de Simmons (DIFCO)
gua Peptonada Tamponada (DIFCO)
Tampo Fosfato de Butterfield (DIFCO)
Soluo alcolica de alfa-naftol
Hidrxido de potssio a 40%
Reagente de Kovacs (MERCK)
Reagente Vermelho de Metila
Hidrxido de sdio 0,1 N
Fenolftalena 1%
gua Peptonada a 0,1%
37
4.1.6 Equipamentos
Balana semi-analtica Marca: SANTER RC 2022
Autoclave vertical Marca FANEM
Autoclave vertical - Marca FABBE, modelo 106751
Estufa de incubao tipo BOD Marca: NOVA TICA, modelo NT 515
Banho-maria circulante Marca: FANEM, modelo 146
Incubadora Digital tipo shaker Marca INOVA, modelo 4080
Cmera de fluxo laminar Marca: TROX TECHNICK
Cabine de fluxo laminar - Marca: TROX, modelo classe biolgica
II
Homogeneizador de amostras Marca: NOVA TICA
Balana semi-analtica Marca: MARTE, modelo 200
Balana analtica - Marca METTLE H15
Contador de colnias Marca PHOENIX, modelo EC 550
Agitador mecnico de tubos Marca PHOENIX, modelo AP 56
Estufa bacteriolgica Marca FANEM, modelo 002 CB
Potencimetro Marca: ANALYSER, modelo 300 M
Cmera cientfica Marca: INDREL RC 1500 D
E demais equipamentos comuns em laboratrio de microbiologia.
38
4.2 Mtodos
4.2.1 Local do estudo
Foi utilizado como local de estudo hortas comerciais,
particulares, situadas na cidade
de Salvador-Ba, no Distrito Sanitrio Cabula Beiru (DSCB). O DSCB
localiza-se na regio
central da cidade, correspondendo a uma rea de 25,3 km, com uma
populao estimada em
385.109 habitantes (Bahia, 2006).
4.2.2 Desenho do estudo
Este estudo foi desenvolvido em duas etapas. Na primeira etapa,
foi realizado um
estudo transversal de carter descritivo, onde foram avaliadas as
condies higinico-
sanitrias das hortas e realizada investigao da qualidade
higinico-sanitria das hortalias e
gua de irrigao. Na segunda etapa, foi feito um estudo
experimental, onde avaliou-se a ao
do vinagre de lcool, suco de limo, mistura suco de limo e
vinagre (1:1) e mistura suco de
limo, vinagre e gua (1:1: 1), sobre cepas de Escherichia coli
inoculadas artificialmente em
folhas de alface cortadas.
4.2.3 Cadastramento e caracterizao higinico-sanitria das
hortas
Para o cadastramento das hortas, foi aplicada a metodologia de
busca ativa e
informaes prestadas pelas unidades de sade situadas no DSCB.
Buscou-se atravs da
aplicao de um formulrio semi-estruturado (check-list),
investigar as condies higinico-
sanitrias dos locais de produo das hortalias, objetivando
detectar a presena de fatores de
riscos relacionados ao ambiente de produo (presena de focos de
insalubridade, origem da
gua de irrigao, tipo de adubo, topografia do terreno, sade e
hbitos higinico-sanitrio dos
trabalhadores), Este formulrio foi adaptado dos modelos
propostos pela Diviso de
Vigilncia Sanitria da Bahia destinados inspeo em
estabelecimentos da rea de alimentos
(BAHIA, 1996), e tambm de um check-list destinado ao Clube dos
Produtores Relatrio
de Vistorias da cidade de Porto Alegre - RS (SONAE DISTRIBUIO
BRASIL S.A., 2005).
Na aplicao desse formulrio foram atribudas notas a cada item
investigado e, de acordo
39
com a pontuao final obtida, a horta era classificada: excelente
(9,0 a 10,0); boa (7,0 a 8,9);
regular (5,0 a 6,9); ruim (3,0 a 4,9) e pssima (0,0 a 2,9).
Amostragem
a.Critrios para a seleo das hortas:
- Hortas com fins comerciais;
- Volume da produo de hortalias.
b. Critrios de incluso:
-Hortas produtoras de alface, couve, coentro e hortel;
- Hortas com maior volume de produo.
c. Critrios de excluso:
-Hortas no produtoras das hortalias selecionadas;
- Hortas com pequena produo.
d- Tamanho da amostra
Atendendo aos critrios acima, foram cadastradas 10 hortas e
destas cinco (50%)
foram selecionadas para o estudo.
4.2.4 Investigao da qualidade higinico-sanitria das hortalias e
gua de irrigao
Amostragem
a. Critrios para seleo das hortalias:
As variedades de hortalias para o estudo foram escolhidas
levando-se em
considerao os seguintes fatores:
1) A forma de consumo, geralmente ingeridas cruas;
2) O freqente consumo por parte da populao;
40
3) A disponibilidade durante, praticamente, todos os meses do
ano;
4) Hortalias que permanecem em contato direto com o solo, cujas
folhas constituem a
parte comestvel e que, por sua estrutura fsica, oferece condies
para reteno e
sobrevivncia de microrganismos nelas depositadas.
Dessa forma, as hortalias selecionadas foram: alface, coentro,
couve e hortel.
b.Tamanho da amostra
Hortalias
Foi coletado um total de 140 amostras das hortalias
selecionadas. Essas coletas foram
feitas em dias distintos, sendo que cada horta foi visitada por
no mnimo cinco vezes, e a cada
visita coletava-se quatro amostras das diferentes hortalias.
Estabeleceu-se, como unidade
amostral para as alfaces, o p (ou touceira), independentemente
do peso ou tamanho que
apresentassem. Para a couve, hortel e coentro, considerou-se o
mao, constitudo de folhas
agrupadas com peso aproximado de 200g. O tamanho da amostra foi
baseado no plano de
amostragem proposto pela Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
(ANVISA), atravs do
Regulamento Tcnico sobre Padres Microbiolgicos para Alimentos,
Resoluo da Diretoria
Colegiada (RDC) no.12 de 02 de janeiro de 2001 (BRASIL, 2001a).
Cada horta estudada foi
considerada como um lote, visto que as mesmas condies de cultivo
eram aplicadas.
gua de irrigao
Em cada horta foram coletadas 10 amostras da gua de irrigao para
anlise, exceto
em uma das hortas que s foi possvel coletar cinco amostras,
totalizando-se 45 amostras. As
coletas da gua de irrigao foram realizadas concomitantemente com
as das hortalias, sendo
duas amostras por cada visita.
Coleta das amostras
Hortalias
A coleta das hortalias foi feita de forma aleatria,
procurando-se pontos eqidistantes
da horta para se ter uma melhor representatividade.
41
Com o auxlio de uma faca previamente esterilizada, as amostras
foram coletadas
utilizando-se sacos plsticos individuais de 1 uso para coleta e
acondicionamento das
mesmas. No momento da coleta as mos dos manipuladores foram
protegidas por sacos
plsticos de 1 uso, evitando-se o contato direto com a amostra,
de acordo com a tcnica
preconizada por Messer et al. (1992). Aps a coleta, as amostras
foram imediatamente
transportadas para o laboratrio em caixas de isopor contendo
gelo reciclvel, e submetidas s
anlises pertinentes.
gua de irrigao
As amostras foram retiradas de pontos diferentes e de acordo com
a disponibilidade de
cada horta, sendo assim os pontos de escolha ficaram distribudos
entre: diretamente das
fontes (cisternas, riachos, torneira e minadouros) e durante a
irrigao atravs das mangueiras
utilizadas. Para a coleta das amostras utilizaram-se sacos
estreis, especficos para este fim e
acrescentado de tiossulfato de sdio (0,5%) quando se tratava de
gua potvel. No momento
da coleta as mos dos manipuladores foram protegidas por sacos
plsticos de 1 uso, evitando-
se o contato direto com a amostra (MESSER et al., 1992). As
amostras foram acondicionadas
em caixa de isopor contendo gelo reciclvel e transportadas
imediatamente para o laboratrio
para proceder s anlises pertinentes.
Anlises microbiolgicas
Hortalias
Ao chegar ao laboratrio foram removidas as folhas externas das
hortalias e
selecionadas aquelas situadas na parte interna para proceder s
anlises microbiolgicas.
Investigao da presena de Salmonella spp.
A investigao da presena de Salmonella spp. foi baseada na
metodologia preconizada por
Flowers et al. (1992), modificado por Instituto Nacional de
Controle de Qualidade de Sade
(INCQS), procedendo-se o pr-enriquecimento em gua peptonada
tamponada 0,1% ( 35C
por 24h), enriquecimento em caldo tetrationato (35C por 24h),
caldo Rappaport, ( 42C por
24h) e isolamento em gar entrico Hektoen (HE), gar
Samonella-Shiguella (SS) e gar
Verde Brilhante (BG), incubados a 35C por 24h. As colnias
caractersticas foram
42
confirmadas preliminarmente pelo teste da urease e reao em
Trplice Acar Ferro (TSI). A
confirmao final foi realizada em gar Lisina Ferro (LIA), produo
de sulfito, indol e
motilidade em meio SIM, reduo do malonato, produo de acetona e
reduo do vermelho
de metila (Voges - Proskauer/ Vermelho de Metila) e utilizao do
citrato como nica fonte
de carbono (Meio Citrato de Simons ).
Investigao da presena de coliformes termotolerantes em
hortalias:
A anlise foi fundamentada na determinao do Nmero Mais Provvel
(NMP) de
coliformes termotolerantes, segundo a tcnica recomendada por
Hitchins et al. (1992),
utilizando-se trs tubos por diluio. As amostras foram diludas em
tampo fosfato de
Butterfield. Os tubos positivos (turvos com produo de gs),
incubados a 35C durante 24h,
foram registrados e ento determinados o NMP/g de acordo com a
tabela de Hoskins.
-Determinao de Escherichia coli
De acordo com Hitchins et al. (1992), os tubos positivos de EC
foram estriados
separadamente em placas contendo o meio de cultura gar Eozina
Azul de Metileno (EMB)
que foram incubadas a 35 C por 24 horas. Colnias nucleadas com
centro preto com ou sem
brilho metlico, foram selecionadas para a confirmao do
microrganismo. Foram realizados
os testes bioqumicos do IMViC para confirmao final, sendo
consideradas como
Escherichia coli as culturas indol positivo ou negativo, VM
positivo, VP negativo e citrato
negativo.
gua de irrigao
Investigao da presena de coliformes totais, termotolerantes e
Escherichia coli
As anlises para a investigao de coliformes totais e
termotolerantes foi feita
utilizando-se a metodologia do Nmero Mais Provvel (NMP), segundo
a tcnica
recomendada por CLESCERI et al. (1988) para gua bruta,
utilizando-se cinco tubos por
diluio. Para a primeira srie de cinco tubos foi adicionado 10 mL
da amostra em 10 mL de
caldo LST em dupla concentrao. Na segunda srie de cinco tubos,
adicionou-se 1 mL da
amostra em 10 mL de caldo LST em concentrao simples. Os tubos
foram incubados a 35C
por 24 horas para observar se houve crescimento com produo de
gs. Foram considerados
43
positivo-presuntivos os tubos que apresentaram crescimento e
formao de gs. A
confirmao de coliformes totais foi realizada em caldo lactosado
bile verde brilhante
(CLBV) a 2%, determinando-se o NMP/100 mL de coliformes totais
atravs da tabela de
Hoskins.
Para a gua tratada, utilizou-se cinco tubos contendo 10 mL de
caldo LST em dupla
concentrao e acrescentou-se 10 ml da amostra. Os tubos foram
incubados a 35C por 24
horas para observar se houve crescimento com produo de gs. Foram
considerados positivo-
presuntivos os tubos que apresentaram crescimento e formao de
gs. A confirmao de
coliformes totais foi realizada em caldo lactosado bile verde
brilhante (CLBV) a 2%,
incubados a 35C por 24 horas, determinando-se o NMP/100 mL de
coliformes totais atravs
da tabela de Hoskins.
Para a confirmao de coliformes termotolerantes, uma alada dos
tubos positivos para
coliformes totais foi transferida para tubos de caldo EC. Aps
incubao a 44,5 C por 24
horas, os tubos mostrando produo de gs foram considerados
positivos. O NMP/100 mL de
coliformes termotolerantes foi determinado de acordo a tabela de
Hoskins.
-Isolamento e identificao de Escherichia coli
A partir dos tubos positivos de Caldo Escherichia coli (EC), foi
estriada uma alada
em placas com gar Eozina Azul de Metileno (EMB) que foram
incubadas a 35C por 24
horas. Colnias tpicas de Escherichia coli foram submetidas s
provas bioqumicas do
IMViC, conforme j descrito nas anlises das hortalias. Foi
considerado como positivo para
Escherichia coli as culturas com as seguintes caractersticas:
Indol positivo ou negativo, VM
positivo, VP negativo e citrato negativo.
Anlises dos resultados
Os resultados encontrados na investigao da presena de Salmonella
spp. em
hortalias foram comparados com os padres microbiolgicos vigentes
para hortalias frescas
in natura, de acordo com a RDC n 12 /2001 (BRASIL, 2001a).
Os resultados encontrados na investigao do NMP de coliformes
totais e
termotolerantes na gua de irrigao foram comparados com os padres
microbiolgicos para
a gua de irrigao, de acordo com o CONSELHO NACIONAL DO MEIO
AMBIENTE -
CONAMA, atravs da Resoluo no.357 de 17 de maro de 2005 (BRASIL,
2005).
44
4.2.5 Investigao da eficincia sanitizante de solues contendo
cidos orgnicos de
cadeia curta sobre Escherichia. coli O157: H7 e Escherichia
coli-Ls, isolada de alface
(Lactuca sativa)
Preparo da suspenso bacteriana de E. coli O157: H7 e E.
coli-Ls.
Culturas bacterianas de E. coli O157: H7 e E. coli-Ls (isolada
de alface) mantidas em
gar inclinado Tryptic Soja (TSA) foram subcultivadas em caldo
BHI a 37 oC por 2 dias
consecutivos (48 horas), sob agitao em uma incubadora do tipo
shaker (120 rpm). Aps a
incubao, 0,5 mL da cultura de E. coli O157: H7 ou E. coli-Ls foi
adicionado superfcie de
placas contendo gar TSA (em duplicata), espalhando-se o inculo
com auxlio de ala de
Drigaslki e incubando-se as placas a 37 C/ 24 horas.
Posteriormente, a superfcie das placas
foram lavadas com 2 mL de gua peptonada a 0,1% tambm com o
auxlio de ala de
Drigaslki, transferindo-se em seguida a suspenso obtida para
tubos do tipo eppendorf
estreis. A partir desta suspenso foram realizadas diluies em
tubos de ensaio contendo 9
mL de gua peptonada a 0,1% (1:10), em seguida inoculadas em
duplicata na superfcie de
placas contendo gar TSA. Aps incubao a 37C/ 24 horas, placas
contendo entre 30 e 300
colnias foram selecionadas para contagem do microrganismo. Este
experimento foi repetido
por trs vezes (SEGUN & KARAPINAR, 2004, 2005). Para melhor
compreenso, segue a
descrio do procedimento do preparo da suspenso bacteriana de E.
coli O157: H7 e E. coli-
Ls, conforme a Figura 1.
FIGURA 1. Preparo da suspenso bacteriana 0,5 ml cada
Incubar 24 h/37C
Cepas de E. coli 1
Ativar/ 2dias consecut.
120rpm/37C Caldo BHI 9ml
TSA Lavar com 2 ml de H2O pep.
1ml 10-71ml 10-1 1ml 10-2 1ml 10-3 1ml 10-4 1ml 10-61ml 10-52
1ml
Suspenso do
inculo 0,1 ml cada
0,1 ml cada
0,1 ml cada
0,1 ml cada
0,1 ml cada
0,1 ml cada
0,1 ml cada
Incubar por 24h /37C Efetuar a contagem das colnias
45
Preparo das solues de tratamento
Tratamento I Vinagre de lcool
Tratamento II - Suco de limo
Tratamento III Mistura suco de limo e vinagre (1:1)
Tratamento IV - Mistura suco de limo, vinagre e gua (1:1:1)
Controle: gua peptonada tamponada
Limo taiti: Foi adquirido em supermercado da rede local, lavado
com gua corrente,
dividido em metades com faca estril e seu suco obtido de modo
assptico.
Vinagre de lcool: Foi adquirido em supermercado da rede
local
Determinao da acidez: mtodo volumtrico (v/v) expresso em cido
actico para
o vinagre e a mistura de limo com vinagre (AOAC, Mt. 930.35,
2000), e cido ctrico para
o suco de limo (AOAC, Mt. 942.15, 2000).
Preparo da amostra
Alface do tipo crespa de cultivo tradicional, adquirida em
supermercado foi submetida
remoo das folhas externas (3 a 4) e do centro. As folhas
restantes foram cortadas de modo
assptico em pedaos de 3 x 3 cm (aproximadamente 1 g), lavadas em
gua fria corrente e
secas em papel de filtro estreis. Posteriormente, a alface
cortada foi submetida luz
ultravioleta (30W, 50 cm de distncia) em cabine de fluxo laminar
tipo II por 30 minutos (15
min de cada lado) para reduzir a microbiota natural (SEGUN &
KARAPINAR, 2004, 2005).
Inoculao na alface
Volume de 2 mL do inculo de E. coli O157: H7 ou E. coli-Ls,
anteriormente obtido
na concentrao aproximada de 1010 foi diludo em 200 mL de gua
peptonada a 0,1 %,
resultando em aproximadamente 108 clulas. Aps esta etapa, 60 g
de alface, j submetida ao
tratamento ultravioleta acima descrito, foram imersos na soluo
contendo o inculo e ento
agitados em incubador do tipo shaker (120 rpm) por 1 min,
temperatura de 21C para
46
permiti