Purificazione e de novo sequencing di Pol1 e Pol2 due nuovi peptidi antibatterici isolati dalla saliva di larve di Polistes dominulus
Purificazione e de novo sequencing di Pol1 e Pol2 due nuovi peptidi
antibatterici isolati dalla saliva di larve di Polistes dominulus
Interazione ospite-patogeno
Gli insetti riconoscono dei pattern molecolari associati ai patogeni (Pathogen associated molecular pattern PAMPs) utilizzando delle molecole chiamate recettori di riconoscimento per Pattern patogeni (pattern recognitionreceptors PRRs)
Gli insetti non hanno un sistema di difesa antigene-anticorpo, caratteristico del sistema immunitario dei vertebrati
Drosophila melanogaster è stato scelto come modello per lo studio della risposta umorale innata verso batteri e funghi
ANTIMICROBIAL PEPTIDES (AMPs)
• Antifungini (Candida, Cryptococcus, Aspergillus)
• Antiparassitari (Malaria, Leishmania, Trypanosoma)
• Antibatterici• Gram positivi• Gram negativi
• Antivirali
Piccole proteine cariche positivamente
Prodotti da fat body e epitelio dotto gastrico
Divisi in tre classi principali negli insetti:
2) Peptidi stabilizzati da Cisteina
3) Peptidi ricchi in Prolina e/o Glicina
1) Peptidi lineari, privi di residui di Cisteina, con struttura ad α-elica
ANTIMICROBIAL PEPTIDES
1) Peptidi lineari, privi di residui di Cisteina,
con struttura ad α-elica
Cecropina A di Hyalophora(farfalla)
29-42 residui
Random coil in soluzione, α-
elica a contatto con membrana
Gram-
2) Peptidi stabilizzati da Cisteina
Defensina di Phormia (mosca)
34-46 residui
2-6 Kda
Loop N-terminale, α-elica e due
fogliettiβ antiparalleli, stabilizzati
da 3 ponti di-solfuro
Gram+, Gram-, Fungi
3) Peptidi ricchi in Prolina e/o Glicina
Proline rich:
es.ApidecinaRandom coilGram+, Gram-
Glycine rich:
es. Diptericina e GloverinaGram-
Organism of origin Name Primary structureDrosophila melanogaster Drosocin GKPRPYSPRPTSHPRPIRV
Metchnikowin HRHQGPIFDTRPSPFNPNQPRPGPIYApis mellifera Apidaecin IA GNNRPVYIPQPRPPHPRIBombus pascuorum Abaecin FVPYNPPRPGQSKPFPSFPGHGPFNPKIQWPYPLPNPGHMyrmecia gulosa Formaecin 1 GRPNPVNNKPTPHPRLBombyx mori Lebocin 3 DLRFLYPRGKLPVPTLPPFNPKPIYIDMGNRYTrichoplusia ni Lebocin SLPSLRLPGRNFPIPPTTPPFVPKPRRFPIYVPyrrhocoris apterus Pyrrhocoricin VDKGSYLPRPTPPRPIYNRNPalomena prasina Metalnikowin I VDKPDYRPRPRPPNM 19-30 AA, 25% Pro
Attività antibatterica di saliva di P.dominulus
Microorganism Antimicrobial Antimicrobial Volume of saliva No. tests No. positivestandard1 volume (µl) (µl) performed
tests of saliva 2
B. subtilis Penicillin G [1.15] 1 5 11 11
[5.09 ± 0.93]E. coli Tetracycline [0.6] 1 5 8 8
[7.88 ±4.02] C. parapsilosis Nystatin [1.35] 25 (in disk) 5 10 0C. albicans Nystatin [1.15] 25 (in disk) 5 10 0C. krusei Nystatin [1.1] 25 (in disk) 5 10 0
Purificazione componenti antibatteriche della saliva di Polistes dominulus
Precipitazione frazionata (etanolo 40%)
Purificazione mediante RP-HPLC
Saggi di attività antimicrobica (su B. subtilis)
Analisi MALDI-TOF
Proteine totali (µg)
Attivitàantibatterica
(ng di penicillina)
Peptide A 94,5 7,2
Peptide B 105 12,5
A B
Analisi MALDI-TOF
Peptide A Peptide B
Sequenza peptide A
Degradazione di Edman
Spettrometria ESI-Trap
Spettrometria MALDI-TOF
ESI-Trap sul frammento interno
1 5 10 15 20
R G N I P I I P V V P N V P R L V D P K S
Proline-rich peptide
Caratterizzazione peptide A
Spettro in dicroismo circolare (CD)
Produzione per sintesi chimica del peptide A
Saggi di attività antibatterica negativi (attivi solo ad alte concentrazioni)
Non altamente strutturato (picco negativo a 200 nm)
Predizione struttura secondaria
Riattivazione peptide A sintetico
- Riattivazione su colonna a scambio cationico
- Riattivazione su resina con ancorato PPI
- Riattivazione su piastra (isomerizzazione a contatto con il bersaglio)
- Trattamento con Peptidil Prolil Isomerasi (PPI)
Riattivazione su colonna a scambio cationico
Attività su B.subtilis
Conclusioni I
Prodotto sinteticamente non si è dimostrato attivo e neanche riattivabile in buona resa a seguito di vari trattamenti
Appartiene alla sottofamiglia dei peptidi ricchi in Prolina
UniProt KnowlwdgebaseAccession number Pol2 P86457
PEPTIDE A
Isolamento gene ed espressione eterologa
Caratterizzazione peptide B
Carbamidometilazione
Degradazione di Edman
AA Picco B
Asx 0,23 (1,4)
Thr 0,27 (1,6)
Ser 0,43 (2,5)
Glx 0,47 (2,8)
Gly 0,6 (3,5)
Ala 0,18 (1,0)
Val 0,25 (1,5) Met 0
Ile 0,19 (1,1)
Leu 0,17 (1,0)
Tyr 0
Phe 0
Lys 0,16 (1,0)
His 0
Arg 0,42 (2,5)
Analisi di AA
4042 – 3700 ≈ 342 Da / 57 = 6 Cys
X Cys ?
Caratterizzazione peptide B
Trattamento con Arginina-C-proteasi
1 5 10 15 20 25 30 35
L S C Q A L G P I G C A A N C K R L G F R G G W C T T G N T C R C F RL S C Q L G G I I G C S S S C A Y Q G R R …
Culicoides sonorensis
Polistes dominulus
2000 2100 2200 2300 24000
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000 Peptide 10 Arg-C2173.28
rela
tive
abun
danc
e
m/z
Analisi MALDI-TOF
850 900 950 1000 10500
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000Peptide 5 Arg-C
867.20
1038.32
882.21
rela
tive
abun
danc
e
m/z
850 900 950 1000 1050
0
10000
20000
30000
40000
50000Peptide 7 Arg-C
1035.60
879.44
rela
tive
abun
danc
e
m/z
Regione N-terminale
?
?
1 5 10 15 20
L S C Q L G G I I G C S S S C A Y Q G R R …
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 10000
2500
5000
7500
10000
12500
15000S
928.4
S
841.4
CCAMA
754.4
594.3
YQGHO-R
523.3360.3232.3
175.3Inte
nsity
[a.u
.]
m/z
1000 1250 1500 1750 2000 22500
2500
5000
7500
10000
12500
15000I/L
2174.2
S
2060.7
CCAM
1973.7
Q
1813.8
I/L
1685.7
GG
1572.7
1515.6
I/L
1458.5
I/L
1345.5
G
1232.5
CCAM
1175.5
S
1015.5
Inte
nsity
[a.u
.]
m/z
L S C Q L G G I I G C S S S C A Y Q G R. . …
Peptide 10
Confermata la sequenza…
Peptide 5
Degradazione di Edman
L S C Q A L G P I G C A A N C K R L G F R G G W C T T G N T C R C F R
L S C Q L G G I I G C S S S C A Y Q G R R . . . . . . . S G C Y C N R
Peptide 5
Culicoides sonorensis
Polistes dominulus
Purtroppo i risultati degli esperimenti MS/MSnon hanno fornito utili informazioni…
600 800 10000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
LIFT Picco 7 m/z 500-1000 serie y
608.31 707.37
764.44
879.48CAM-C V G D
rela
tive
abun
danc
e
m/z
0 100 200 300 400 5000
1000
2000
LIFT Picco 7 m/z 0-500serie y
??
??
335.22 448.28
I/L CAM-C
rela
tive
abun
danc
e
m/z
Peptide 7
L S C Q A L G P I G C A A N C K R L G F R G G W C T T G N T C R C F R
L S C Q L G G I I G C S S S C A Y Q G R R D G V C I . . S G C Y C N R
Peptide 5
Culicoides sonorensis
Polistes dominulus Peptide 7L
Conclusioni IIPEPTIDE B
La presenza di 6 Cys e l’allineamento con altre proteine simili portano a concludere che sia appartenente alla famiglia delle DEFENSINE
Sono stati ottenuti dati parziali sulla sequenza
(UniProt KnowlwdgebaseAccession number Pol2 P86458)
Come per il PEPTIDE A isolamento del gene…
Dipartimento di Scienze Biochimiche
Luigia PazzagliEleonora PagniGianni Cappugi
Centro Interdipartimentale Spettrometria di Massa
Guido MastrobuoniGloriano MonetiStefano Turillazzi