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Purification de protéines - stratégies
1CHM 3102
Propriétés des protéines et stratégie de purification
• Instabilité à la température• Stabilité au pH• Stabilité au solvants organiques• Nécessité d’utiliser des détergents• Sel (force ionique)• Co-facteur et stabilité d’activité• Sensibilité aux protéases• Sensibilité aux métaux• Activité redox• Poids moléculaire• Charge• Affinité biospécifiques• Modifications post-traductionelles• Hydrophobicité
pH acide inférieuraux pI des protéines, interactions préférentielles avec résine échangeusede cation
pH basique supérieuraux pI des protéines, interactions préférentielles avec résine échangeused’anion.
pH moins basique. Uneprotéine positivementchargée (rouge) interagitavec la résine cationiqueet peut être séparée des autres. Alternativementles autres protéinespeuvent etre séparéesavec une résine anionique, alors que la protéine en rouge n’est pas retenue.
pH moins acide. Uneprotéine negativementchargée(bleu) interagitavec la résine anionique et peut être séparée des autres. Alternativement les autres protéines peuventetre séparées avec unerésine anionique, alors quela protéine en bleu n’estpas retenue. résine échangeuse d’anion
résine échangeuse de cation
Chromatographie par échange d’ions
8CHM 3102
Force ionique et facteur de capacité
Ln(k
’)
1/√I
lysosyme α-chymotrypsinogen
Cytochrome C
ou: Ap: Aire du polyelectrolyteσp: Densité de chargeF : Constante de Faradayε0: Cst. Permittivitéεr: Cst dielectrique de la phase mobileI : Force ioniqueΦ: Rapport volume occupé par phase
stationnaire et mobile: Vs/Vm
Anal. Chem, 63, 1867 (1991)
Chromatographie par échange d’ions
9CHM 3102
Sélectivité et élution
Gradient linéaire
Elution par plateau
Chromatographie par échange d’ions
10CHM 3102
Diamètre des particules et résolution
Amersham BiosciencesIon Exchange Chromatography& ChromatofocusingPrinciples and Methods11-0004-21
Chromatographie par échange d’ions
11CHM 3102
Caractéristiques des résines
Chromatographie par échange d’ions
12CHM 3102
Tampons
Purifying proteins for proteomicsR.J. Simpson, p. 127
Chromatographie par échange d’ions
13CHM 3102
Exemples de séparation
Amersham BiosciencesIon Exchange Chromatography& ChromatofocusingPrinciples and Methods11-0004-21
Anion (faible)
Anion (fort)
Anion (fort)
Anion (faible)
Chromatographie par échange d’ions
14CHM 3102
Exemples de séparation
Amersham BiosciencesIon Exchange Chromatography& ChromatofocusingPrinciples and Methods11-0004-21
Phase mobileSolubilise l’échantillonGonfle le gelCompatible avec le système de détectionIsocratiqueEx : TRIS, phosphate, NaCl, et detergent neutre
Séparationbasée sur la taille des molécules, et donc leur aptitude à pénétrer dans le réseau de pores
Chromatographie d’exclusion moléculaire
17CHM 3102
Chromatographie d’exclusion moléculaire
18CHM 3102
Gel, structure et porosité
Harris, 6e Ed. p. 652Structure de polyacrylamide
Chromatographie d’exclusion moléculaire
19CHM 3102
Coefficient de distribution et masse moléculaire
ViV0
Vm
VR = V0 + KD Vi KD = VR – V0Vm – V0
Volume mort, V0 est determiné en utilisant le dextran blue 2000 (Mr = 2 x 106 Da). Vmcorrespond au volume de la phase mobile et est la somme du volume mort et du volume interne Vi.
Chromatographie d’exclusion moléculaire
20CHM 3102
Exemple de séparation
L’ordre d’élution est inversementproportionel à la masse moléculaire.
Utilité pour l’observation et le contrôledu repliement et de l’aggrégation de protéines. Frequemment utilisée pour désaler les protéines par exempleaprès digestion ou modification chimique.
Harris, 6e Ed. p. 653
Chromatographie d’exclusion moléculaire
21CHM 3102
Gamme de linéarite
Diamètre des pores de la phase stationnaire de polystyrene
Harris, 6e Ed. p. 653
Pour chaque phase stationnaire il existe un domaine ou le log Mr et le volume d’élution est linéaire. La gamme de masse augmente avec la dimension des pores (Ex: G2000SW, pore 13 nm, separation: 0.5-60 kDa et G5000SW, pore 100 nm, separation > 1.5 MDa)