UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA UNIDAD XOCHIMILCO TRONCO DIVISIONAL TRIMESTRE 2012-P MODULO ENERGÍA Y CONSUMO DE SUSTANCIAS FUNDAMENTALES Purificación de una enzima (Lisozima del huevo) Integrantes: Bárcenas López Daniel. Jiménez Jiménez Gustavo.
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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA
UNIDAD XOCHIMILCO
TRONCO DIVISIONAL
TRIMESTRE 2012-P
MODULO
ENERGÍA Y CONSUMO DE SUSTANCIASFUNDAMENTALES
Purificación de una enzima(Lisozima del huevo)
Integrantes:
Bárcenas López Daniel.
Jiménez Jiménez Gustavo.
Soto Garibay Ebeleydy Katherine.
Vega Cruz Cesar.
Zamora Jiménez Leonardo. “2012, año de la lectura”
INDICE
1.- INTRODUCCION
2.- MARCO TEORICO
2.1 HUEVO Y COMPONENTES FUNCIONALES. 2.2.- LISOZIMA (IMPORTANTE CATALIZADOR).
2.2.1 ESTRUCTURA Y CLASIFICACIÓN DE
LISOZIMA GALLUS GALLUS (CLARA DE HUEVO).
2.2.2 MECANISMO DE UNIÓN LISOZIMA-
SUSTRATO. 2.3.- PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS CON SULFATO DE
AMONIO.
2.4.- DIÁLISIS.
2.5.- MÉTODO DE LOWRY.
2.5.1 FUNDAMENTO TEÓRICO.
2.5.3 MATERIALES Y REACTIVOS.
2.5.3 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
2.6.- ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA.
2.6.1 FUNDAMENTOS DE LA ELECTROFORESIS.
2.6.2 ELECTROFORESIS EN GEL DE
POLIACRILAMIDA.
2.6.3 FORMACIÓN DEL GEL DE
POLIACRILAMIDA.
2.6.4 FORMACIÓN DEL GEL DE POLIACRILAMIDA
2.6.5 TIEMPO DE CORRIDA.
2.6.6 PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS.
2.6.7 TINCIÓN.
3.- OBJETIVO.
4.- MATERIAL y procedimiento.
4.1.1PURIFICACIÓN DE LISOZIMA POR ELMÉTODO DE SULFATO DE AMONIO.
4.1.2 ELECTROFORESIS DE LAEMMLI:
SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA.
5.- RESULTADOS.
5.1.1 INTERPRTACION DE RESULTADOS.
6.- DISCUSIÓN.
7.- CONCLUSION.
8.- GLOSARIO.
9.- BIBLIOGRAFIA.
1.- INTRODUCCIONEl huevo es uno de los alimentos más nutritivos (fuente de
proteínas de alta calidad y de determinados minerales y
vitaminas) y versátiles para el hombre. Como sea que, en la
actualidad, las gallinas producen huevos en gran abundancia,
esta fuente de alimento ha adquirido una notable importancia
en todo el mundo, tanto desde el punto de vista nutritivo
como desde otros factores (Arias y Fernández ., 2007).
El nombre de lisozima incluye a un grupo de enzimas que
catalizan la hidrólisis de enlaces glicosídicos β (1→ 4) de
los polisacáridos de la pared celular bacteriana. La lisozima
provienen del huevo de gallina, o en ocasiones la podemos
encontrar en algunos componentes de fluidos corporales; es
una proteína pequeña con 129 residuos de aminoácidos, la
estructura se estabiliza por cuatro puentes de disulfuro,
esto se mantienen durante la desnaturalización, además esta
proteína es reversible ( Dobson., 1994).
2.- MARCO TEORICO
2.1.- HUEVO Y COMPONENTES FUNCIONALES.
Un huevo aporta 6 g de proteína aproximadamente, repartidos
fundamentalmente entre la yema y la clara. El albumen
consiste en una solución acuosa (88%) y proteica (11% del
albumen).
De las numerosas proteínas presentes en la clara, destacan la
ovoalbúmina (54%) y ovomucina (11%) responsables de la
consistencia del albumen, y la lisozima (3,4%) por sus
propiedades antibacterianas. El resto de las proteínas del
huevo se encuentran en la yema (16% de la yema), que consiste
en una emulsión de agua (49 %) y lipoproteínas.
La calidad de la proteína que aporta un alimento viene
determinada por su digestibilidad y su composición
aminoacídica. La composición proteica del huevo es
considerada de alto valor biológico, ya que contiene todos
los aminoácidos esenciales y en la proporción adecuada
“ideal”, para cubrir las necesidades de las personas (ver
figura 1). Por ello, se utiliza como patrón de referencia para
la evaluación de la calidad proteica de los alimentos. Además
se considera una fuente de proteína altamente digestible ya
que más del 95 % de la proteína del huevo es digerida y
resulta disponible para cubrir las distintas necesidades del
organismo (Millward, 2004).
Figura 1 Estructura de huevo de gallina2.2.- LISOZIMA (IMPORTANTE CATALIZADOR).
El nombre de lisozima o muramidasa (EC 3.2.1.17) incluye a un
grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces
glucosídicos (ver glosario) β (1→ 4) de ácido N-acetilmuránico
(NAM) a N-acetilglucosamina (NAG) de los polisacáridos (ver
glosario) de la pared celular bacteriana. Fue descubierta como
agente antibacteriano del moco nasal y de otros tejidos y
secreciones naturales, interviene en la defensa natural
contra las infecciones (ver figura 2).
La lisozima de clara de huevo de gallina, son proteínas
globulares constituidas por una sola cadena polipeptídica de
129 aminoácidos con un peso molecular comprendido en el rango
de 14 a 30 KDa (ver glosario).
Estas proteínas contienen cuatro puentes cruzados disulfuro
(ver glosario) que contribuyen a su elevada estabilidad (Sevilla,
2006).
La lisozima carece de actividad como proteasa, quinasa,
amilasa, lipasa o fosfatasa. Sin embargo, la lisozima ha
mostrado actividad bactericida independientemente de su
capacidad lítica (Ludwig O., 2012).
Figura 2 Estructura de la composición de una pared bacteriana.
2.2.1.- ESTRUCTURA Y CLASIFICACIÓN DE LISOZIMA
GALLUS GALLUS (CLARA DE HUEVO).
La molécula tiene una forma más o menos helicoidal 30x30x45Å
(ver figura 3). Hay hélices alfa (α) y algunas regiones de la
cadena tienen conformación de lámina beta (β) extendida.
Su rasgo más llamativo es una hendidura, en el sitio de
fijación del sustrato que a traviesa la cara de la molécula,
siendo su plegamiento más complejo.
En la hendidura se unen 6 residuos del polisacárido por medio
de puentes de hidrogeno con diferentes grupos de los residuos
aminoacídicos de la proteína. (Anon., 2008)
Figura 3 Estructura primaria de la lisozima de huevo de Gallus g.allus
2.2.2.- MECANISMO DE UNIÓN LISOZIMA-SUSTRATO.
Los oligómeros (ver glosario) de NAG con menos de cinco residuos
son hidrolizados (ver glosario) muy lentamente, o no lo son. Sin
embargo, se unen al sitio activo de la enzima, y reaccionan
preferentemente como aceptores en reacciones de
transglucosilación.
El trímero de N- Acetilglucosamina es un potente inhibidor
competitivo de la lisozima. El estudio por rayos X del
complejo lisozima- (NAG)3 muestra que el sustrato se liga a
una hendidura en la superficie de la enzima ocupando cerca de
la mitad de ella. La unión del (NAG)3 y la lisozima se hace
por puentes de hidrogeno e interacciones de Van der Waals (ver
glosario). El grupo carboxílico del Aspartato 101 se une por
enlaces de hidrogeno a los residuos A y B, entre el residuo C
y la enzima hay cuatro enlaces de hidrogeno: uno entre el NH
del anillo indol del triptófano 62 y el oxigeno del C6. Este
enlace aún se produce cuando el triptófano 62 es convertido
en kinurenina y lisozimas mutantes con otros aminoácidos
(Leu, Ile, Val, Ala) en la posición 62 poseen una mayor
actividad lítica. Otro enlace se produce entre el triptófano
63 y el oxigeno del C3, otro entre los grupos NH y CO de la
cadena lateral acetamida y los grupos CO y NH de la cadena
principal de los aminoácidos 107 y 59, respectivamente.
El (NAG)3 tiene también contactos tipo Van der Waals con la
enzima, así el residuo B se acomoda al anillo indol del
triptófano 57. El hallazgo de que el (NAG)3 llena la mitad de
la hendidura de la lisozima sugería la necesidad de residuos
adicionales de azúcar que llenen la hendidura para que se
forme el complejo enzima-sustrato (ES).
Habrá espacio para tres residuos adicionales de azúcar. Tres
residuos adicionales de azúcar denominados D, E Y F fueron
encajados en la hendidura. El residuo D, para encajar, tuvo
que ser distorsionado de su conformación normal. De los cinco
enlaces del (NAG)6, el único que se hidroliza es el enlace D-
E por lo siguiente: el enlace glucosídico entre A y B no
puede ser el sitio de hidrólisis porque
(NAG)3 es estable. El enlace B-C se excluye por la misma
razón. Otra evidencia crucial es que el sitio C puede ser
ocupado perfectamente por NAG, pero no así por NAM, porque
éste es muy grande debido a su cadena lateral lactilo y no
encaja. Por otra parte, se sabe que el enlace que se rompe en
la pared de las bacterias es el enlace NAM-NAG. Si NAM no
puede encajar en C, se excluyen también E-F como sitio de
hidrólisis, ya que el polisacárido
de la pared celular es un polímero
en el que NAM y NAG alternan, por lo
que si NAM no puede ocupar el sitio
C, tampoco podrá ocupar el sitio E.
Excluidos los enlaces A-B, B-C, C-D
y E-F como sitios posibles de
hidrólisis, se concluye que la
Figura 4
La lisozima se une a la pared
celular bacteriana fijando en
el centro activo un
hexasácarido con la alternancia
NAG-NAM-NAG-NAM-NAG-NAM. El
cuarto residuo D (NAM) se
distorsiona hacia una
conformación de media silla,
debido a que sino se producirán
contactos desfavorables entre
el grupo CH2OH (del C6) y la
proteína.
La lisozima hidroliza el enlace
glucosídico que se rompe es
ruptura se da en el enlace D-E (ver figura 4) (Ludwig O., 2012)
2.3.- PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS CON SULFATO DE
AMONIO.
El primer paso consiste en obtener un extracto crudo del
tejido del cual se pretende aislar la proteína de interés. En
el extracto se encuentran mezclados todos los componentes
celulares, como proteínas, lípidos, carbohidratos, sales,
metabolitos secundarios, etc. El proceso consiste en la
extracción acuosa de algunos componentes celulares. Se
realiza dependiendo del tejido a trabajar; al terminar esta
etapa la muestra se centrifuga y se recupera el sobrenadante
con la finalidad de desechar el precipitado que contiene
algunas impurezas, y descartar restos de tejido (ver figura 5).
Al obtener un extracto crudo se debe de tener en cuenta que
nuestras proteínas de interés se encuentran en solución
acuosa a una baja salinidad. Al incrementar la concentración
de sales en la solución incorporando lentamente sulfato de
amonio, (entre 29-95% de saturación), la proteína comienza a
ceder intercambios iónicos con los iones y sulfato, y
sustituye los sitios de intercambio que compartía con el agua
y pasado un tiempo de esta manera, la proteína disminuye su
solubilidad y precipita.
Por lo general las moléculas de mayor peso molecular se
precipitan primero. Esta nueva solución se centrifuga y el
precipitado que contiene las proteínas se recupera. El éxito
de la precipitación depende del tiempo de contacto y de la
concentración de la solución (Vargas Sanchez, 2011).
Figura 5 modo en como se purifica una proteína cuando es de bajo y alto
Peso Molecular
2.4.- DIÁLISIS.
El siguiente paso en la purificación de proteínas consiste en
tomar una alícuota del precipitado y dializar mediante el
flujo selectivo de materia de una zona de mayor concentración
a otra de menor concentración con ayuda de presión osmótica,
es decir, separando dos disoluciones de concentraciones
diferentes por una membrana semipermeable (una membrana que
permite el paso selectivo de las moléculas del disolvente,
pero impide el paso de compuestos de mayor peso molecular).
De esta manera se puede concentrar un producto o separarlo de
una mezcla de moléculas (ver figura 6). Es necesario realizar
este paso a baja temperatura y en agitación constante, ya que
la diálisis es un proceso molecular que depende
exclusivamente de los movimientos aleatorios de las moléculas
individuales (Vargas Sanchez, 2011).
Figura 6 Diálisis por medio de una membrana semipermeable. Las moléculas
grandes permanecen atrapadas dentro de la membrana mientras que las
pequeñas difunde a través de la membrana en dos direcciones.
2.5.- MÉTODO DE LOWRY.
2.5.1 FUNDAMENTO TEÓRICO.
El método de Lowry (1951) es un método colorimétrico de
valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se
añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las
proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la
concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer A=
.l.c
Este método consta de dos etapas:
1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas
formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces
peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color
azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la
estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los
residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la
segunda etapa de la reacción.
El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su
complejo con tartrato.
2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de
Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de
tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando
el cobre como catalizador. El principal constituyente del
reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido
fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido
por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul
intenso.
2.5.2.- MATERIALES Y REACTIVOS
Materiales:
Tubos de ensayo
Tubos Falcon (50 mL)
Pipetas
Colorímetro
Cubetas de colorímetro
Agitadores de tubos
Reactivos:
Reactivo A: Na2CO3 al 2%, NaOH 0,1 M
Reactivo B1: CuSO4 5H2O al 1%
Reactivo B2: tartrato sódico-potásico al 2%
Reactivo C: Se prepara, mezclando los reactivos: A, B1 y B2,
en proporciones 50:0,5:0,5 (en volumen)
Reactivo Folin-Ciocalteau: reactivo comercial diluido a 1/4
Solución patrón de albúmina de suero bovino (BSA) (2 mg/mL)
Muestra problema
2.5.3.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Para determinar la concentración de proteínas de la muestra
problema se construye una curva patrón o de calibrado a
partir de una solución patrón (BSA) (2 μg/ml). La
concentración que tienen las muestras problema se determina
por interpolación de los valores de absorbencia en la curva
patrón. El tubo 0, que sólo contiene agua destilada y los
reactivos, sirve de blanco para el ajuste del colorímetro a
cero de absorbancia.
Pasos a seguir:
Numerar del 0 al 6, tubos de plástico de 10 mL
Pipetear las cantidades de agua, solución patrón de albúmina
y solución problema señaladas en la tabla.
Preparar el reactivo C, a partir de A, B1 y B2
Pipetear a todos los tubos el reactivo C. Mezclar el
contenido de cada tubo y dejarlo reposar 15 minutos en
oscuridad (dentro de la taquilla).
A continuación añadir a todos los tubos el reactivo de Folin
(diluido 1/4), mezclando bien por agitación. Dejar reposar 30
minutos en la oscuridad para que así se desarrolle
completamente la reacción coloreada.
Leer las absorbancias en el colorímetro a 580 nm. Previamente
el aparato se ajusta a Absorbancia igual a cero con el blanco
(tubo nº 0); de esa forma sólo se mide el color producido por
las proteínas, puesto que se resta el color debido a los
reactivos. Anotar la medida de absorbencia en la tabla.
2.6.- ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
La electroforesis es un método analítico – semipreparativo,
en el que se separan biomoléculas, en dependencia entre otros
factores de su carga y bajo la acción de un campo eléctrico,
fue empleado por primera vez por Tiselius en el año 1937.
Raymond y Weintraub en 1959 emplearon como soporte para la
electroforesis un gel de poliacrilamida (PAGE),
posteriormente el método fue perfeccionado por varios
investigadores como Davis y Ornstein. La popularidad de este
creció rápidamente y se logró un aumento de la resolución.
El dodecil sulfato de sodio (SDS) se introduce en esta
técnica en 1970, y ya en 1972 se emplean agentes reductores y
SDS en la determinación del peso molecular de proteínas en lo
que se denominó electroforesis en geles de poliacrilamida con
SDS (SDS-PAGE). En este trabajo se da un bosquejo general de
la electroforesis, si se tiene en cuenta el desarrollo desde
su surgimiento hasta el presente (García Pérez, 2006).
2.6.1.- FUNDAMENTOS DE LA ELECTROFORESIS
La electroforesis es la migración de solutos iónicos bajo la
influencia de un campo eléctrico; estas partículas migran
hacia el cátodo o ánodo (electrodos - y +), en dependencia de
una combinación de su carga, peso molecular y estructura
tridimensional.
Es de destacar que a escala analítica, los métodos
electroforéticos son de alta sensibilidad, poder de
resolución y versatilidad, y sirven como método de separación
de mezclas complejas de ácidos nucleicos, proteínas y otras
biomoléculas, donde aportan un potente criterio de pureza. Se
pueden conocer también mediante estas técnicas, las
características ácido-básicas de las proteínas presentes en
un extracto crudo, lo que da la información necesaria si se
pretende realizar una separación cromatográfica basada en
diferencias de carga. Es útil además para determinar otros
parámetros como peso molecular, punto isoeléctrico y número
de cadenas polipeptídicas de las proteínas.
La velocidad de migración (v) de la partícula es directamente
proporcional al producto de su carga efectiva (q) y el
gradiente de potencial eléctrico (E) e inversamente
proporcional al coeficiente de fricción (f) relativo a la
talla y forma de la molécula, o sea, a la resistencia que le
ofrece el medio.
V = q E / f
La movilidad electroforética (Me) es un caso particular de la
velocidad de migración de un ión, UNIV DIAG 2000;1(2):31-4132
cuando se aplica un campo eléctrico de 1 V/cm. Su signo es
igual al de la carga de la partícula.
La velocidad de migración electroforética depende de la
densidad de carga de la molécula (relación carga / peso), del
voltaje aplicado y de la porosidad del gel de electroforesis.
El voltaje no se puede incrementar indiscriminadamente porque
se genera un excesivo calor. En contraste, al aplicar bajo
voltaje puede ocurrir una pobre separación, por causa de la
difusión por tiempo muy prolongado de la corrida
electroforética.
La mayoría de las biomacromoléculas (proteínas, ácidos
nucleicos y polisacáridos) poseen determinada carga eléctrica
con grupos aniónicos y catiónicos capaces de disociarse. La
carga neta de la partícula está dada por el pH del medio y
puede ser modificada por la interacción con pequeñas
moléculas de iones u otras macromoléculas. De lo anterior se
deduce que el pH influye sobre la velocidad de migración de
las moléculas.
2 En el punto isoeléctrico de la biomolécula, pH al cual su
carga neta es 0, esta no migra. Por debajo del punto
isoeléctrico tiene carga neta positiva y migra hacia el
cátodo, y por encima del punto isoeléctrico tienen carga neta
negativa y migra hacia el ánodo (García Pérez, 2006).
2.6.3.- ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
La poliacrilamida es un soporte empleado frecuentemente en
electroforesis en gel, es químicamente inerte, de propiedades
uniformes, capaz de ser preparado de forma rápida y
reproducible. Forma, además, geles transparentes con
estabilidad mecánica, insolubles en agua, relativamente no
iónicos y que permiten buena visualización de las bandas
durante tiempo prolongado. Además tiene la ventaja de que
variando la concentración de polímeros, se puede modificar de
manera controlada el tamaño del poro (García Pérez, 2006).
2.6.4.- FORMACIÓN DEL GEL DE POLIACRILAMIDA
Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización
vinílica del monómero acrilamida CH2=CH-CO-NH2 y del monómero
entrecruzador N, N´-metilen-bis-acrilamida CH2 = CH- CO - NH
- CH2 - NH - CO - CH = CH2. La polimerización se inicia con
la formación de radicales libres del monómero, que se
producen por radicales libres de oxígeno, por causa de la
acción de iones persulfato.
Las aminas terciarias como el N, N, N, N´-tetrametilen-
diamina (TEMED) se emplean como catalizadores de esta
reacción, porque causan la formación de radicales libres del
persulfato. Esta reacción es fuertemente inhibida por altos
niveles de oxígeno, por lo que la solución debe ser des
gasificada para lograr una formación de gel reproducible. Hay
muchos factores que desempeñan una función importante en la
separación electroforética, como son pH, fuerza iónica,
gradiente de potencial, tiempo de corrida, concentraciones de
acrilamida y bisacrilamida, etc. Las condiciones óptimas de
una buena separación, en la práctica se determinan
experimentalmente, con el análisis de cómo influyen los
diferentes factores en la electroforesis en cuestión.
La naturaleza de la muestra sirve de guía para alcanzar las
condiciones en la que se deben obtener los mejores
resultados. Bambeck reporta que durante la polimerización del
gel a temperaturas inferiores a 17 ºC, la iniciación del
control catalítico y el tiempo de elongación de la cadena
comienzan a ser diferencialmente controlables (García Pérez,2006).
2.6.5.- TIEMPO DE CORRIDA
La determinación del tiempo adecuado de corrida es muy
importante, pues corridas muy cortas impiden que las muestras
avancen el espacio necesario para su correcta separación,
pero también se ha probado que tiempos de corrida cortos
minimizan la dispersión de la muestra y el ensanchamiento de
la banda (García Pérez, 2006).
2.6.6.- Preparación de las muestras
En el caso de la SDS-PAGE es necesario lograr una completa
desnaturalización de las proteínas, para evitar la aparición
de bandas fantasmas en la electroforesis (bandas dobles por
la concentración de bME o por el tiempo de incubación).
Seichi y Chait reportaron que la alquilación de la cisteína
antes de la electroforesis evita la formación accidental de
aductos de acrilamida durante la electroforesis (García Pérez,
2006)
2.6.7.- TINCIÓN
Las proteínas coloreadas naturales como la mioglobina,
hemoglobina, ferritina y citocromo C, pueden ser observadas
directamente en los geles, sin embargo la visualización de la
mayoría de las proteínas requiere el uso de colorantes. Los
colorantes orgánicos fueron los que se emplearon primero para
teñir proteínas en los geles (ejemplo de estos bromofenol
azul, azul de Coomassie, etc.). Una rápida tinción,
destinción y fijación son esenciales en el caso de las
proteínas pequeñas para evitar su elusión; la omisión del
metanol de la solución de tinción es beneficiosa ya que se
reduce el tiempo de tinción y disminuye el hinchamiento de
los geles.
Existen diferentes tipos de tinción, entre ellos la plata que
es muy sensible y tiene la característica de producir
generalmente coloraciones carmelita o negro, sin embargo
algunas proteínas tienen colores característicos como las
lipoproteínas que tienden a colorearse de azul y algunas
glicoproteínas que aparecen amarillas, carmelitas o rojas.
Este efecto cromático se ha demostrado que está dado por la
difracción de la luz en la plata. Se han desarrollado algunos
procedimientos de tinción con plata para identificar ciertas
proteínas, con el empleo de combinaciones de tinción.
La tinción con Coomassie puede emplearse para la
determinación de proteínas cuando estas son abundantes, pero
no para la determinación de pureza de proteínas trazas. Esta
tinción requiere un medio ácido para la generación de la
atracción electrostática entre las moléculas del colorante y
los grupos amino de las proteínas. La atracción iónica es a
través de las fuerzas de Van Der Walls, que une a las
proteínas y al colorante formando un complejo. Esta unión es
totalmente reversible en condiciones apropiadas.
Se ha reportado la tinción de proteínas por otros métodos
entre los que se encuentran: eriocromo negro, compuestos
fluorogénicos, modificación de los aminoácidos de las
proteínas (García Pérez, 2006)
3.- Objetivo
Purificar la enzima lisozima a partir de la clara de huevo
por purificación de proteínas con sulfato de amonio (NH4)2SO4.
Así como la técnica de la electroforesis en gel
poliacrilamida para analizar la purificación de la enzima
LISOZIMA, su composición proteica de las distintas fracciones
y su grado de pureza de la lisozima.
4.- Material y procedimiento-Tubos de 16 x 150.
-Balanza Granataria.
-Pipetas de 1ml, 5ml, 10ml.
-Perilla de hule.
-Espectrofotómetro.
-Eppendor o microfugas.
-Micro pipetas de 20μl, 100μl, 200μl
-Membranas semipermeables.
-Vasos de precipitados de 1000ml.
-Matraces Erlenmeyer de 250ml.
-Centrifuga.
-Gradilla.
4.1.1PURIFICACIÓN DE LISOZIMA POR EL MÉTODO DESULFATO DE AMONIO
1.- Pesar 55 g de sulfato de amonio (NH4)2SO4 y disolverlos en70 ml de agua
2.- Elaborar una dilución 1:5 de agua destilada (120 ml) yclara de huevo (30 ml)
3.- Tomar 50 ml de la mezcla de (NH4)2SO4 y 50 ml de la mezclade clara de huevo y homogenizar (1:1)
4.- Esperar 24 horas a que se precipite
5.- Verter en 8 tubos con 12 ml cada uno
6.- Centrifugar 15 min. a 5000 rpm
7.- Decantar todos los tubos
8.- Colocar el residuo en 2 tubos y centrifugar 15 min. a5000 rpm
9.- Retirar el excedente de agua y dejar solo el sedimento
10.- Adicionar 1 ml de buffer fosfato salino 0.1 M pH 7.2(PBS) y dejarlo todo en un solo tubo
11.- En una bolsa de diálisis vaciar la mezcla (residuo ybuffer) para eliminar el (NH4)2SO4
12.- Dejar 72 horas en agua destilada, para retirar el(NH4)2SO4 de la muestra cambiar el agua en dos ocasiones
13.- Pasado el tiempo, retirar la membrana de diálisis,colocar la muestra en un tubo y centrifugar 15 a 5000 rpm
14.- Retirar la proteína y colocarla en tubos eppendor omicrofugas
15.- Hacer tres diluciones 1:100, 1:250, 1:500 (proteína yagua)
16.- Para elaborar la curva de calibración por la técnica deLowry elaborar la siguiente tabla con los correspondientesreactivos
Tubo 1 2 3 4 5 6BSA (100μg/ml)
- 0.2ml
0.4ml
0.6ml
0.8ml
1.0ml
H2O 1ml
0.8ml
0.6ml
0.4ml
0.2ml
-
-----------------3ml de reactivo A-------------------
10minutos a temperatura ambiente
---------------Folin 1:1 en H2O------------------------
Incubar 30minutos a temperatura ambiente
Leer a 500 nm
Valores X YTubo BSA *(100μg/ml)
μg/ml Absorbancia a500nm
Blanco 0 0.0630.2 *100μg/ml 20 0.0950.4 *100μg/ml 40 0.1260.6 *100μg/ml 60 0.1540.8 *100μg/ml 80 0.1821.0 *100μg/ml 100 0.213Diluciones(muestra)1:100 69.14 0.1671:250 24.57 0.1021:500 19.42 0.094
Reactivo “A”
0.5 ml Tartrato de Nay K
0.5 ml de sulfatocúprico
50 ml de carbonato desodio
NaOH 0.1N
4.1.2 ELECTROFORESIS DE LAEMMLI: SEPARACIÓN DE
PROTEÍNAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA.
Se utilizo la técnica de electroforesis en gel para la
purificación de la enzima lisozima para determinar el grado
de pureza.
Reactivos para preparar el gel separador (inferior).
-3.75 μl de acrilamida.
-3.75 μl de TRIS 1.5M.
-7.4 μl de H2O destilada.
-0.3ml de SDS (detergente).
-10 μl de TEMED (tetrametilnediamina).
-100 μl de Persulfato de Amonio.
1.- Preparar el gel al 7.5% en un matraz de 125ml.
2.- Añadir 100 μl del Persulfato de Amonio y suspenderlo,
pesar en la balanza 0.07 μg y suspender a 0.7μg en el matraz
y revolver el reactivo.
3.- con una pipeta verter el reactivo en el molde hasta un
poco por encima de la marca en el separador inferior poner el
peine y dejar polimerizar.
4.- Una vez polimerizado el gel de separación, quitar el
peine, lavar la superficie del gel con agua destilada y secar
las paredes.
5.- Verter 20 μl de COCKTAIL (contiene TRIS 0.5M, H2O y azul
de bromofenol) en eppendor o micro fugas y 7.7 μl de la
muestra problema.
6.- Cargar las muestras en cada carril del gel.
7.- Sacar el molde del porta moldes verde y adosarlo al porta
electrodos (éste se ha untado con gel de sellado a lo largo
de la gomilla verde), con el cristal pequeño hacia dentro.
Colocarlo a su vez en el porta moldes de electroforesis y
todo junto dentro de la cubeta. Marcar los geles como A y B.
8.- verter TRIS glicina y SDS (boffer) de corrida (es para
que las muestran corran y para que no reboten las muestras.
9.- Llenar los compartimentos interior (125 ml) e inferior
(200 ml) con buffer de electroforesis.
10.- Colocar la tapa porta electrodos y correr la
electroforesis a 175volts durante 1 hora.
11.- retirar las placas de la cubeta y lavarlas con agua.
NOTA: lavarse las manos para no romper el gel.
12.- teñir los geles en un recipiente con reactivo azul
decormassie (acido acético al 7.5% y metanol al 5%) y dejar
reposar durante24hrs.
Reactivos para preparar el gel concentrador (superior).
-1 μl de acrilamida.
-1.9 μl de TRIS 1.5M.
-4.6 ml de H2O.
-7.5 μl de SDS (detergente).
-10 μl de TEMED (tetrametilnediamina).
-50 μl de Persulfato de Amonio.
1.- preparar el gel superior al 4% en un matraz de 125ml.
2.- seguir los pasos anteriores con la muestra para el gel
concentrador.
5.- Resultados
En la purificación de la enzima (lisozima) por el método de
Lowry se obtuvo en una dilución 1:100 una concentración de
69.14 μg que al multiplicarlo por el factor de dilución
(0.100 μl) se obtuvo como resultado 6.914 μg/ μl.
De la dilución 1:250 se obtuvo una concentración de 24.57 μg
que al multiplicar por el factor de dilución (0.250 μl) se
obtuvo como resultado 6.1425 μg/ μl.
De la dilución 1:500 se obtuvo una concentración de 19.42 μg
que al multiplicar por el factor de dilución (0.500 μl) se
obtuvo como resultado 9.71 μg/ μl.
Se obtuvo en la muestra de gel una pequeña banda de color
azul en la parte inferior (lo que indica la presencia de una
sola proteína).
5.1 Interpretación de resultados
Para obtener los μl de muestra para electroforesis se tomaron
en cuenta solo los valores de las diluciones 1:100 y 1:250
pues sus valores eran cercanos, omitiendo así el valor de la
dilución 1:500.
Por lo tanto el valor de la muestra para electroforesis es de
7.7 μl.
De acuerdo a la información obtenida en clase la proteína de
la electroforesis es de bajo peso molecular ya que se
encuentro en la parte inferior del gel.
Cada banda del gel representa una proteína diferente (o
subunidad proteica); las proteínas más pequeñas se desplazan
más rápidamente y, por tanto, se encuentran cerca del extremo
inferior del gel.
6.- DiscusiónLa electroforesis en gel es el método más conveniente para
realizar separaciones de macromoléculas.
La separación de proteínas permite ver la composición
proteica en distintas fracciones que puede actuar un grado de
pureza de una lisozima. Las separaciones moleculares están
basadas en el tamizado molecular junto ala movilidad
electroforética de las moléculas que van a ser separadas.
La eficacia del método propuesto ante la purificación de la
enzima (Lisozima) de la clara de huevo de gallina la proteína
total que había en el carril 3 fue muy alta pues en el gel no
corrió hacia la parte superior si no a la parte inferior lo
que significa que tiene un alto peso molecular. De acuerdo a
la técnica de Lowry hace que la proteína pueda tener más
sensibilidad y mejor visualización.
7.- Conclusión
Se logro purificar la proteína (lisozima) por medio del
método de sulfato de amonio y posteriormente se dializó para
eliminar la presencia del mismo y por medio de la
electroforesis se pudo visualizar una pequeña cantidad de la
proteína. El gel de poliacrilamida nos mostro solo una banda
de proteína en la parte inferior lo que nos indica que tiene
bajo peso molecular.
Concluimos que al final de la práctica, logramos tener los
resultados esperados siguiendo con cuidado cada método.
8.- Glosario
Enlaces glucosídico: Enlace químico formado entre las
moléculas de azucares.
Fuerzas de Van der Waals: Es una fuerza de atracción débil
consecutiva a las simetrías transitorias de carga entre los
átomos o moléculas adyacentes.
Hidrólisis: Es una reacción química entre una molécula de
agua y otra molécula, en la cual la molécula de agua se
divide y sus átomos pasan a formar parte de otra especie
química.
KDa: El kilo Dalton es la más pequeña unidad de masa usada
para expresar masas atómicas y masas moleculares.
Metabólitos: cualquier molécula utilizada o producida duranteel metabolismo.
Ovoalbúmina: La ovoalbúmina es la principal proteína de la clara del huevo (60-65% del peso de la clara de huevo).
Ovomucina: glucoproteínas derivada de la clara de huevo.
Polisacárido: Son biomoléculas formadas por la unión de una
gran cantidad de monosacáridos.
Puentes de disulfuro: Es un enlace covalente fuerte .
Oligómero: Consiste en un número finito de monómeros.
9.- BibliografíaAnon., 2008. Lisozima. [En línea] Available at: http://gmein.uib.es/otros/enzimas/Jmoldesarrollo/lisozimajmol/lisozimajmol.html[Último acceso: 16 Julio 2012].
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