1 PROYECTO DE INVESTIGACIÓN “ESTUDIOS PRECLÍNICOS FARMACOLÓGICOS DE EXTRACTOS DE Anthurium schelechtendalii Kunth (RAÍZ DE PIEDRA) EN LA REMISIÓN O PREVENCIÓN DEL DAÑO RENAL INDUCIDO POR ADENINA EN MODELOS MURINOS” DIRECTOR DR. OCTAVIO CARVAJAL ZARRABAL ASESOR EXTERNO M. en C. DULCE MARÍA BARRADAS DERMITZ PRESENTA Q.C. SAYRA QUERO HERRERA, Estudiante de la Maestría en Medicina Forense. VERACRUZ, VER. UNIVERSIDAD VERACRUZANA REGIÓN VERACRUZ INSTITUTO DE MEDICINA FORENSE
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PROYECTO DE INVESTIGACIÓN - uv.mx · De igual manera la Acacia Senegal ... presentes en plantas que por conocimiento etnobotánico se sabe son ... existen algunos elementos de zonas
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PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
“ESTUDIOS PRECLÍNICOS FARMACOLÓGICOS DE EXTRACTOS DE
Anthurium schelechtendalii Kunth (RAÍZ DE PIEDRA) EN LA REMISIÓN O
La insuficiencia renal es un problema de salud en México y especialmente en el
estado de Veracruz, que ocupa desde el 2013 el primer lugar en casos nuevos
con ERC con 600 casos al año por cada millón de habitantes. El modelo murino
de insuficiencia renal creado por la administración de adenina ha sido validado
en diferentes estudios. En este trabajo se plantea estudiar el efecto de remisión
y nefroproteccion para insuficiencia renal.
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3.- JUSTIFICACIÓN.
Desde los inicios de la humanidad el hombre ha tenido como aliadas a las
plantas. Más del 90% de los medicamentos utilizados en el mundo no-
industrilizado son productos naturales y más del 60% de medicamentos usados
en la medicina occidental tienen su origen en plantas y microbios. Un ejemplo
claro es la familia Araceae, pues en México, desde la época prehispánica
diversas especies de esta familia eran utilizadas con fines medicinales,
alimenticios, mágico-religiosos y ornamentales (Mandujano et al., 2002).
Sin embargo, algunas de las plantas de esta familia carecen de estudios
químicos y de actividad biológica; entre ellas podemos citar a las especies del
género Anthurium.
Actualmente se conoce que los extractos de Stenocereus eruca y de
Dracontium loretense tienen efectos analgésicos y antinflamatorios (Imai et al.,
2006;Collantes et al.,2011). Tomando en cuenta lo anterior, en este proyecto se
propone determinar la actividad antiinflamatoria, efecto regenerativo y citotóxico
de extractos orgánicos y metabolitos secundarios de raíz Anthurium
schelechtendalii kunth aplicados a nivel renal.
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4.-OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Determinar la capacidad de raíz de piedra de Anthurium
schelechtendalii kunth en la remisión o prevención del daño renal
por adenina.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
• Establecer la Concentración Letal 50 (LC 50) de los extractos de Anthurium schlechtendalli Kunth en Artemia salina sp.
• Definir las alteraciones bioquímicas e histopatológicas en los riñones inducidas por adenina, en los animales de estudio.
• Determinar la capacidad de remisión de ERC de los extractos de la raíz de Anthurium schelechtendalii Kunth frente al daño renal inducido por adenina.
Determinar la capacidad nefroprotectora de extractos de la raíz de
Anthurium schelechtendalii Kunth frente a la administración de adenina.
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5.- HIPOTESIS
H1 Si existen compuestos bioactivos provenientes de la raíz de Anthurium
schelechtendalii Kunth (Raíz de piedra) en los extractos en estudio, que
muestren capacidad de remisión o prevención del daño renal inducido por
adenina, se harán evidentes en los modelos murinos de experimentación a
través de las valoraciones y exámenes de parámetros bioquímicos e
histopatológicos.
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6. METODOLOGIA
6.1. Tipo de estudio.
Estudio comparativo y experimental en animales, en el cual se evaluará el
efecto nefroprotector y efecto de remisión de Anthurium schelechtendalii
Kunth en un modelo de daño renal inducido por adenina.
Basados en los estudios de Yokozawa, et al., 1986 y Okada, et al., 1999,
respectivamente. Se inducirá un daño renal a los murinos con una dosis de
adenina de 0.75 % administrando en conjunto con la dieta comercial y los
extractos de Anthurium schelechtendalii Kunth elegidos de acuerdo a la
toxicidad para verificar el grado de nefroprotección. Por otro lado, en otro
grupo se administrará la adenina a la misma concentración y ya corroborado el
daño con los marcadores renales se procederá a administrar los extractos de
Anthurium schelechtendalii Kunth.
6.2. Recolección del material vegetal.
Para este estudio se empleará material vegetal previamente recolectado.La
recolección se llevó a cabo el 01 de septiembre de 2013 en la zona de
Tlacojalpan del estado de Veracruz. El muestreo fue a base de conveniencia de
la zona antes mencionada, con un peso total de 2-2.5 kg de planta total. Se
tomó exclusivamente la raíz de este ejemplar, se realizó un tratamiento previo
con agua destilada para eliminar todo tipo de residuo, en seguida se fraccionó
el material en trozos pequeños obteniendo un peso 1850 kg. De este total se
obtuvieron dos partes: la parte A correspondiente a muestra fresca la cual fue
congelada por una semana y la parte B representaba la muestra seca; el cual
se puso a secar a temperatura ambiente en el laboratorio por una semana.
6.3. Obtención de los extractos
6.3.1.- Extractos orgánicos.
El material vegetal recolectado (raíz) se lavará minuciosamente con agua, para
eliminar residuos e impurezas, y se fraccionará en dos partes. Una de ellas se
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secará a temperatura ambiente durante una semana dentro del laboratorio pero
donde le lleguen los rayos del sol y la otra se trabajará como material fresco
dentro de las 48 horas después de la recolección.
100 g del material fresco someterá a extracción con acetato de etilo utilizando
dos extractores Soxhlet (50 gr serán depositados en cada extractor). El extracto
se concentrará en un evaporador rotatorio marca BUGUL-ROTAVAPOR
modelo RE 120 acoplado a una bomba de vacio (aspiración de agua) marca
Cole palmar modelo 7049-50 y a un ciculador refrigerado marca FISONS
modelo HAAKE CH, fijado a una temperatura de 18°C . El extracto se
recolectará y secará con corriente de nitrógeno de alta pureza. (EOMF =
Extracto Orgánico del Material Fresco)
20 gramos del material seco se tratará de la misma forma descrita en el
párrafo anterior para obtener el extracto orgánico correspondiente: EOMS =
Extracto Orgánico de Material Seco.
6.3.2. Extractos Acuosos
6.3.2.1. Maceración
El material vegetal 400 gramos fresco se macerará durante 24 horas en agua,
en recipiente de vidrio ámbar, a temperatura ambiente y con movimientos
rotacionales cada hora, por espacio de 3 minutos cada vez.
Se filtrará el macerado. Primero, a través de coladera de plástico, y el filtrado
que se recolectó se someterá a filtración en embudo Buchner, papel Whatman
No.2, con bomba de aspiración al vacío (marca Cole palmar modelo 7049-50 ).
Se congelará el filtrado resultante por 24 hrs.,y se liofilizará en LABCONCO
FREEZE DRY SISTEM 4.obteniéndose el Extracto Acuoso de Material Fresco
Macerado EAMFM.
Al material vegetal seco se le realizará el mismo procedimiento anterior,
obtenièndose finalmente el Extracto Acuoso de Material Seco Macerado
EAMSM.
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6.3.2.2. Infusión
Otra parte de material 400 gramos se someterá a extracción por infusión. Se le
agregará a la materia prima 1000 ml con agua desionizada a temperatura de
ebullición, durante 1 minuto y 4 minutos en reposo (sin mayor calentamiento).
Y se procesará de la misma forma que el material acuoso por maceración.
De igual manera el material seco se someterá al mismo proceso de extracción
por infusión, después de obtenido, se procederá a seguir con los pasos de
filtración, congelado y liofilización que en el de maceración.
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6.4. Determinación de la CL50 de los extractos
Esta prueba se realizará con Artemia salina,la cual se expondrá a diferentes
concentraciones del extracto tanto acuoso como orgánico.
SE DETERMINARAN LA
CL50 CON LA ARTEMIA
SALINA.
SE REALIZA LA PRUEBA DE
TOXICIDAD AGUDA CON
DIF. CONCENTRACIONES
DICROMATO DE POTASIO.
ESTO TAMBIÉN SERVIRÁ
PARA CONTROL POSITIVO.
LAS PRUEBAS SE REPETIRAN 30
VECES PARA CADA
CONCENTRACIÓN.DEPENDIENDO
DEL RESULTADO.SE AUMENTA O
DISMINUIRA LAS
CONCENTRACIONES.
SE REALIZARAN LOS ENSAYOS
CORRESPONDIENTES PARA
ESTABLECER EL TIEMPO DE
INCUBACIÓN, LA TEMPERATURA
Y EL TIEMPO EN QUE
ECLOSIONAN LAS LARVAS PARA
OPTIMIZAR TIEMPO
SE REALIZA UN ENSAYO
PARA ADQUIRIR DESTREZA
EN LA MANIPULACIÓN DE LAS
LARVAS .Y REALIZAR LOS LAS
PRUEBAS DE CONTROL.
EL CONTROL
NEGATIVO SERA AGUA
SUPLEMENTADA CON
LEVADURA DE
CERVEZA COMERCIAL.
SE PREPARARA DE CADA EXTRACTO UNA SOLUCION
PATRON ( c = 100 g/mL )
DETERMINAR LA
CONCENTRACION LETAL
MEDIA REALIZANDO
DILUCIONES DE 10,100 Y 1000
EN CADA POZO.
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6.5. Manejo de animales y toma de muestras.
Ratas Wistar machos (9-10 semanas con peso de 240 ±10 gr) estarán en una
habitación a una temperatura de 22 º C , con una humedad relativa del 60
%,con un ciclo de luz y oscuridad de 12 h (luces encendidas las 6:00),tendrán
libre acceso al agua y a una alimentación estricta compuesta de la dieta en
polvo que contiene 0.85% de fósforo, 1.12% de calcio, 0.35% de magnesio,
25.3% de proteína cruda y 2,5 UI / g vitamina D3 (Omán Flour Mills, Muscat,
Omán). Los procedimientos con animales y su cuidado se llevaran a cabo de
acuerdo con las leyes y políticas internacionales.
Durante el periodo de tratamiento ratas se pesaran semanalmente y serán
colocadas individualmente en jaulas metabólicas para recoger el orina de 24
hrs. Al final de experimento las ratas se anestesiaran con tratamiento
intraperitoneal y la sangre (3 ml aproximadamente) se tomará de la vena cava
anterior, y se colocará en tubos para colectar suero o plasma(opcional). La
sangre y la orina se centrifugaran a 900 g a 4 ºC durante 15 min. El suero o
plasma obtenido, junto con las muestras de orina, se almacenaran congeladas
a 2-8 ºC en espera de análisis. Los dos riñones serán extirpados envueltos
en papel de filtro y se pesaran. Un corte del riñón derecho se colocara en
formalina al 10% para el procesamiento histológico posterior. El resto de los
riñones se mantendrán congelados a 2 – 8 ºC a la espera de análisis
bioquímico.
Pasada una semana. El riñón izquierdo se homogeneizara en tampón Tris
enfriado con hielo (pH 7,4) para dar un 10% w / v homogeneizado. Este último
se centrifugara a 1500 g a 48C durante 15 min, y el sobrenadante obtenido
será utilizado para medir la actividad de la SOD.
6.6. Esquema de tratamiento.
Los animales (n= 36) se mantienen por una semana en las condiciones
referidas para su adaptación. Se dividen al azar en 6 grupos con 6 ratas en c/u.
El primer grupo o grupo control (gc) se le administra la misma dieta (alimento
comercial) hasta el final del estudio. Al segundo grupo o grupo de daño renal
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inducido (gdri) se le modifica la dieta anterior incorporándosele adenina (0.75%
p/p). La mezcla de adenina con el alimento comercial se realiza pulverizando
ambas. El tercer y cuarto grupo (ExtAx% y ExBy%) reciben la dieta comercial
mezclado con adenina y dos diferentes concentraciones del extracto
respectivamente en estudio. La mezcla de extracto con el alimento comercial
se realiza pulverizando ambos ingredientes. El quinto y sexto grupo (gdri +
ExtA% y gdri+ExtBy%) se les da la mezcla de dieta comercial con adenina
durante dos semanas para producir las alteraciones y después se le deja de
administrarla adenina y se deja con dieta más extracto, todo en forma de
polvo. El tiempo total de experimentación para el estudio en estos 6 grupos es
de 4 semanas.
6.7. Histología renal
Los riñones se fijarán en 10% formalina, deshidratados en concentraciones
crecientes de etanol, serán aclaradas con xileno y embebidos en parafina.
Cinco secciones micrométricas serán preparadas a partir de bloques de
parafina y se tiñeran con hematoxilina y eosina y tricrómico de Masson
utilizando procedimientos estándar.
La evaluación microscópica de las secciones de riñón se llevarán a cabo
asignando una puntuación, que evalúa el área de necrosis de los túbulos
proximales en una escala arbitraria de 0-4 (0, sin necrosis; 1, Área de necrosis
hasta un 25 %de los tubulos ; 2, área necrótica de hasta un 50% de los
tubulos; 3, Necrosis que afecta el 75% de los túbulos 4, Necrosis del 76 al
100% de los túbulos
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6.8. Esquema de determinaciones
ORINA SUERO o PLASMA HOMOGENEIZADO
RENAL
Creatinina
Urea
Acido urico
Proteínas en
orina.
Lactato
Deshidrogenasa
LDH
Capacidad
Antioxidante
GSH Glutatión
SOD Super
Óxido
Dismutasa
CRP Proteína C
Reactiva
TNF-alfa
IL-10
*CHECAR LA PRESION DE LOS MURINOS
6.8.1. Determinaciones analíticas
Las concentraciones de creatinina y urea en plasma o suero serán medidas
por método enzimático. El ácido úrico por método uricasa-PAP. En las
determinaciones de Lactato deshidrogenasa usara el método UV(Fosfatos-
Piruvatos-NADH) .Para las proteínas en orina el método de rojo de pirogalol.
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Realizando las mediciones en espectrofotómetro utilizando kits comerciales
(Randox).
Actividad antioxidante total (TOA) se medirá en suero utilizando un kit de