Proteome analysis of X-ray irradiated human erythroleukemia cells Kelly Tinonº USP: 5413841 Letícia Oyamada nº USP: 5672034 Thays Nogueira nº USP: 5414157.

Proteome analysis of X-ray irradiated human

erythroleukemia cells

Kelly Tino nº USP: 5413841Letícia Oyamada nº USP: 5672034 Thays Nogueira nº USP: 5414157

Eleuterio, E.; Di Giuseppe, F.; Sulpizio, M.; Di Giacomo, V.; Rapino, M.; Cataldi, A.; Di

Ilio, C.; Angelucci, S.

Biochimica et Biophysica Acta 1784 (2008) 611-620

Introdução

Radioterapia atingir o máximo de controle do tumor com o mínimo de complicações para os tecidos normais

Radioterapia apresenta um efeito deletério em sistemas biológicos tratamento de câncer

Dose normal: 20-30 frações de 2-3 Gy cada, durante 5 a 6 semanas

Principal complicação da radioterapia dano do tecido normal ROS interagem com DNA e proteínas morte celular

Efeitos radioresistentes Alteração da expressão de proteínas – reparo de DNA,

apoptose, controle do ciclo celular, resposta a estresse oxidativo

Objetivo

Identificação de proteínas envolvidas na resistência à radiação. Modelo: linhagem celular humana K562 de eritroleucemia radio-

resistente Mecanismo de resistência: oncoproteína com atividade tirosina

quinase (PTK) desregulada envolvida na inibição da indução da apoptose e morte celular promovendo sobrevivência dessas células

Desenho do estudo

Linhagem K562 submetida a 6 Gy de raio-X Dose subótima protocolo de tratamento tumoral com

radioterapia em humanos Análise de alterações no ciclo celular e microscopia 1 hora após tratamento análise proteômica Identificação de proteínas relacionadas e sua expressão:

Proteína stress-70 Glutationa transferase pi e ômega Complexo mitocondrial de síntese de ATP

Método

Células K562 foram cultivadas em suspensão em meio RPMI 1640, suplementada com SFB, glutamina, HEPES, penicilina/estreptomicina em atmosfera controlada, a temperatura ambiente

Irradiação com 6 Gy

Cultura celular e tratamento com radiação ionizante

Método

Após 24h após irradiação 2-5 x 105 células centrifugação, (200g/10min/4ºC), fixação

com etanol, ressuspensão, RNAse Ciclo celular Citometria de Fluxo

Avaliação da apoptose tardia DNA subdiploide calculado e expresso em porcentagem de células apoptóticas versus não apoptóticas

Detecção de células em apoptose precoce – Ensaio Annexin V - translocação de resíduo de fosfatidilserina para a parte externa da membrana plasmática

Avaliação do ciclo celular e apoptose prematura

Resultados

confluência de células na transição

G2/M4,6 % células apoptóticas

Resultados

14,2% apoptose precoce

Método

Fixação, desidratação, adição de resina e polimerização com UV, corte ultrafino e fixação com acetato de uranila e citrato de chumbo preservação da morfologia

Fotografia com microscópio eletrônico

Microscopia eletrônica

Resultados

Não tratada Apoptose precoce:

Condensação da cromatina e

emarginação do núcleo (seta)

Apoptose tardia: retração da membrana,

separação de vesículas e

cromatina densa

Método

Suspensão de células foi centrifugada (1200 g), lavada com SFB gelado (3x)

Extração das proteínas de 107 células com tampão de lise Sonicação do extrato (3 x/20 s), centrifugação, incubação com

endonuclease, purificação Determinação da concentração de proteína 2D Quantin kit

Preparação da amostra para Eletroforese Bidimensional (2DE)

Métodos

Triplicata das amostras 1ª dimensão: separação das proteínas de acordo com seu pI em fita de 18cm, pH 3-10 2ª dimensão: separação das proteínas por massa molecular (gel com gradiente de 9-16% de poliacrilamida)

Géis analíticos - nitrato de prata amoniacal Géis para espectrometria – prata sem glutaraldeído

Eletroforese bidimensional

Coloração

Método

Proteínas marcadoras: proteína de choque térmico Hsp 90-alfa, Peroxiendoxina 1, Subunidade beta tipo 3 de Proteosoma (distribuídas nos géis e identificadas por espectrometria de massa)

3 géis para cada condição Parâmetros de comparação:

% volume para quantificar os spots média (entre o menor limite de uma classe e o maior

limite de outra classe)

Análise das imagens

Resultados

Não tratadas – 1430 ± 79 proteínas

Irradiadas – 1590 ± 98 proteínas

83 % de proteínas coincidentes – coeficiente de correlação: 0,9

Método

As proteínas das amostras controle e tratadas foram separadas em eletroforese uni e bidimensional e transferidas para membranas de nitrocelulose.

Anticorpos primários diluídos 1:1000 Anticorpos secundários diluídos 1:3000 Medidas das bandas mono e bidimensionais

Análise por Western-Blot

Resultados

5,4 6,2

EXPERIMENTOS MONO E BIDIMENSIONAIS – resultados semelhantes à análise do proteoma

Método

Recorte dos spots do gel 2-DE Análise por mass finger printing (PMF) com MALDI-TOF-

espectrômetro de massa Comparação com banco de dados

Digestão de proteínas e MALDI-TOF-Espectrometria de Massa

Resultados

39 proteínas foram expressas diferentemente nas células não tratadas e nas tratadas 29 super-reguladas 10 sub-reguladas

Resultados

5,4 6,2

EXPRESSÃO CELULAR – análise do proteoma

Discussão

Análise Annexin V evidências de radioresistência Proliferação celular mais lenta (porcentagem de G2/M aumentada) Sensibilidade celular diminuída em situação de estresse Resposta apoptótica à radiação baixa (14,2 %) se comparada com

outras linhagens celulares Análise proteômica

Diferenças entre as proteínas expressas nos grupos estudados Associação dessas proteínas com atividades celulares importantes

Metabolismo energético, motilidade do citoesqueleto, biossíntese proteica, detoxicação, entre outros.

Super expressão de proteínas envolvidas no metabolismo de carboidratos

Discussão

PROTEÍNA EXPRESSÃO ATIVIDADE OBSERVAÇÃO

3 isoformas dos fatores de elongação (EF1A1)

AUMENTADA Crescimento celular/ inibição da apoptose/

tumorigênese/ regulação do citoesqueleto

Relato de resistência à cisplatina de células de

câncer de cabeça e pescoço

Proteínas de choque-térmico (Hsp) –

Stress-70 e proteínas 1 do complexo T

AUMENTADA Atuam como chaperonas para reconhecimento de

proteínas com conformação anormal /

defesa celular em condições de estresse

RESITÊNCIA / SOBREVIVÊNCIA /

PROLIFERAÇÃO CELULAR

Enzimas conjugadas da Fase II (Glutationa

transferase P1-1 e O1-1)

AUMENTADA Resistência a fármacos quimioterápicos

(etoposide, cisplatina, docetaxol, tamoxifeno)

Aumentadas em células radioresistentes – fator

indicativo de dificuldades no tratamento quimioterápico

DJ-1 AUMENTADA Proteção celular contra ROS

Proteção contra radioterapia

Discussão

PROTEÍNA EXPRESSÃO ATIVIDADE OBSERVAÇÃO

Creatina Quinase B AUMENTADA Transferência de fosfato entre o ATP e

fosfógenos

RADIORESISTÊNCIA

2 comp. do complexo mitocondrial ATP sintase

DIMINUÍDA Síntese ATP também encontrada em células resistentes de

câncer de cólon - RADIORESISTÊNCIA

Proteína Actin-like 3 / tropomiosina cadeia alfa

3

AUMENTADA / DIMINUÍDA

Polimerização da actina / ligação aos filamentos de actina e estabilização do

citoesqueleto

Desorganização do citoesqueleto/aumento

da plasticidade = RESISTÊNCIA

RuvB like2 AUMENTADA Helicase dependente de ATP – reparo da dupla

fita de DNA após exposição à radiação

Proteção da célula tumoral contra radiação (observada no estudo)

Conclusão

Identificação de inúmeras proteínas com alteração da expressão após radiação Stress-70, Glutationa transferase e ATP sintase

Também relacionadas à resistência a fármacos antitumorais Mecanismo de radio e farmacoresistência podem ser

semelhantes Análise proteômica ferramenta simples e útil para identificação

de biomarcadores da resistência celular Novas investigações com as proteínas descritas

Novas estratégias para o tratamento de câncer Tratamentos radio e quimioterápicos combinados na terapia de

leucemia humana