PROTEINE RESPIRATORIE DEI VERTEBRATI EMOGLOBINA …people.unica.it/.../files/2018/11/lezioni-2018-emoglobina1-2.pdf · PROTEINE RESPIRATORIE DEI VERTEBRATI EMOGLOBINA E MIOGLOBINA

PROTEINE RESPIRATORIE DEI VERTEBRATIEMOGLOBINA E MIOGLOBINALegano reversibilmente l’OSSIGENO.

L’emoglobina (tetramerica) è presente negli eritrociti, e trasporta ossigeno nel sangue

La mioglobina (monomerica) è presente nelle cellule muscolari.

Aumenta la solubilità dell’ossigeno nel plasma, da 3ml/L a 220 ml/L.

Essenziale per la loro funzione è il legame con un gruppo prostetico: Il gruppo EME in cui è presente lo ione ferroso Fe2+ che funziona da sito di legame per l’O2

La mioglobina

e l’emoglobina

sono proteine

coniugate

GRUPPO EME

4 anelli pirrolici uniti da ponti metilenici (protoporfirina IX), struttura coniugata e planare che coordina il FERRO nello stato ferroso -Fe(II) (Fe2+)-Esso è coordinato dai 4 atomi di azoto dell’anello tetrapirrolico

5 | 3Nelson • Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2014

Il gruppo EME è alloggiato in una «tasca», formata dal ripiegamento della catenapolipeptidica (globinica), in cui si affacciano diversi residui amminoacidici idrofobici(Val, Leu, Iso, Phe, Met) che interagiscono con l’anello tetrapirrolico dell’EME e lomantengono in sede.

interazioni idrofobiche, contatti di van der Waals e legami H

Nella tasca idrofobica è impedito l’ingresso

all’H2O e il Fe2+ è protetto dall’ossidazione

irreversibile.

Istidina prossimaleHis93 (His F8)

Piano dell’anello porfirinico

Lo ione Fe2+ è coordinato dai 4 atomi di azoto dell’anello tetrapirrolico, e formaaltri 2 legami di coordinazione: con l’ossigeno molecolare (O2) e con l’istidinaprossimale (His93; His F8)

Elica F della Catena

globinica,

Lo ione ferroso Fe2+

può legare O2

J. M. Berg et al. BIOCHIMICA 7/E Zanichelli editore S.p.a Copyright © 2012

L’interazione tra Ferro e Ossigeno è descritta dalla combinazione di 2 strutture di risonanza

Lo ione ferrico Fe3+ non può legare O2

La Mb o l’Hb SI OSSIDANO(Meta-Mb o Meta-Hb)

La struttura della Mb o delle catene globiniche di Hb sono fatte in modo da proteggere il ferro dall’ossidazione, ed evitare la

formazione di ioni superossido

La tasca dell’EME è idrofobica e quindi è impedito l’ingresso di acqua

Esiste un sistema anti-ossidante che rimuove le specie reattive dell’ossigeno (ROS) basato sull’attività del glutatione.

Nella tasca dell’EME esiste un secondo residuo di ISTIDINA chiamato DISTALE che interagisce con l’ossigeno e indebolisce il legame fra ossigeno e ferro

Mioglobina: 1 catena globinica composta da 8 α-eliche (indicate con le lettere da A a H) unite da segmenti di interconnessione (anse e curve)

His-93 (F8)prossimale

His-64 (E7)distale

His prossimale

His distale

Phe

Val

Val-68 e Phe-43 aiutano a mantenere

l’EME in posizione

La formazione e il rilascio dell’anione superossido è impedito da un LEGAME H fra l’O2 e l’Istidina DISTALE (His64, E7).

Questo legame impedisceanche l’ossidazione dello ione Fe2+ a Fe3+

Il legame H fra O2 e His-64(distale) assicura chel’interazione O2/Fe2+ siareversibile, abbassa l’affinitàdell’eme per il suo ligando

La tasca dell’EME può accogliere anche altre piccole molecole, come per es. il MONOSSIDO DI CARBONIO (CΞO)

Il monossido di carbonio blocca i siti di legame per l’ossigeno nell’Hb e nella Mb, rendendola non-funzionale.

Si blocca la respirazione per intossicazione da CO.

Il legame è molto forte ma reversibile,il CΞO può essere rilasciato in condizioni di alte pressioni di O2

(camera iperbarica)

il CΞO lega il Fe2+ dell’EME con un’affinità molto maggiorerispetto all’O2 (CO e Fe2+ sono perfettamente allineati).

Mioglobina: 1 catena globinica composta da 8 α-eliche (indicate con le lettere da A a H) unite da segmenti di interconnessione (anse e curve)

La Mb ha un solo gruppo EME, può legare 1 molecola di O2.

Si forma un complesso MbO2

secondo un rapporto di 1:1. Il legame fra Mb e O2 è

reversibile ed è regolato secondo un equilibrio da una costante di dissociazione:

Mb + O2 MbO2Mb + O2 MbO2Kdiss

La concentrazione di proteina ossigenata (legata all’ossigeno, MbO2) rispetto allaconcentrazione totale di Mb (Mb + MbO2), varia al variare della concentrazione diossigeno (ligando) fornito alla proteina. Questo rapporto è chiamato FRAZIONE DISATURAZIONE DELLA Mb (si esprime in % o in frazione)

Mb + O2 MbO2Mb + O2 MbO2Kdiss

[Mb] [O2 ]Kdiss =

[MbO2]

[Mb] [O2 ]Kdiss =

[MbO2]

[MbO2]Y =

[MbO2] + [Mb]

[MbO2]Y =

[MbO2] + [Mb]

2) dall’affinità che la proteina ha per il suo ligando, cioè dalla costante di dissociazione (Kdiss) del complesso MbO2

LA FRAZIONE DI SATURAZIONE DIPENDE DA: 1) dalla concentrazione del ligando [O2] che si esprime come pO2

Se la Kdiss è piccola l’affinità proteina/ligando è elevata

Kdiss= p50

Il valore della Kdiss corrisponde al valore di pO2

che consente di saturare la Mb al 50% (Y = 0.5).Questo valore di pO2 è detto p50

pO2

Y = p50 + pO2

pO2

Y = p50 + pO2

pO2

Y = p50 + pO2

La frazione di saturazione Y, la concentrazione di O2, e la Kdiss sono legate da una relazione matematica:

Y = Kdiss+

Y = Kdiss+

pO2Y =

Kdiss+ pO2

Y = Kdiss+

Y = Kdiss+

pO2Y =

Kdiss+ pO2

Eq. di HILL

[O2] = pO2 (pressione parziale di ossigeno)

[O2]Kdiss + [O2]

Y =

Kdiss+ pO2 = 2pO21 pO2

2 Kdiss + pO2

Y = = Kdiss = 2pO2 - pO2 = pO2

La p50 è il parametro che misura l’AFFINITA’ di unaemoproteina per il suo ligando (l’OSSIGENO).

Più è grande il valore della p50 più è grande la Kdiss equindi minore l’affinità dell’emoproteina per l’O2

Il valore della p50 e quindi della Kdiss si ricava sperimentalmente utilizzando il grafico di

ossigenazione della Mb.

Y

QUANDO SI MISURA la FRAZIONE di SATURAZIONE (Y) della Mb a DIVERSI VALORI di pO2 si OTTIENE UNA CURVA di LEGAME o OSSIGENAZIONE

IPERBOLICA

[MbO2]Y =

[MbO2] + [Mb]

[MbO2]Y =

[MbO2] + [Mb]

Pressione parziale di O2

Tutti i siti di legame della Mb sono

OCCUPATI

Tutti i siti di legame della Mb sono

LIBERI4

O2

O2

O2

O2

Y

la Mb rilascia EFFICACEMENTE

l’ossigeno che aveva legato.

Fase di deossigenazione

minore consumo di O2: la pO2 intracellulare è in equilibrio con quella del sangue capillare

p50 della mioglobina è ~ 4 mmHg, la sua affinità per l’O2 è molto elevataÈ una caratteristica necessaria affinchè Mb sia funzionale: DEVE ESTRARREO2 DAL SANGUE E ACCUMULARLO NEL TESSUTO MUSCOLARE

Nelle cellule muscolari metabolicamente

attive:

si consuma O2: la pO2cellulare diminuisce

< 10 mmHg

Nelle cellule muscolari a riposo:

Mb è quasi satura: accumula O2

Fase di ossigenazione

pO2 nei capillari ~ 30 mmHg

Emoglobina (Hb): tetramero (le globine si associano formando due copie di dimeri αβ (α1β1 e α2β2) che si associano a formare un tetramero attraverso interazioni idrofobiche, legami H e ponti salini. Le interazioni si formano nell’interfaccia α1β1 e α2β2 e α1β2 e α2β1

Ogni globina ha una tasca in cui lega un gruppo EME,

quindi l’Hb può legare e trasportare 4 molecole di O2

2 catene globiniche α (7 α-eliche) e 2 catene globiniche β (8 α-eliche)

Il grado di ossigenazione della Hb dipende dalla pO2 e dalla Kdiss

del complesso Hb(O2)4.

Frazione di saturazione: % di Hbossigenata (di siti EME occupati

dall’O2) rispetto all’Hb totale

Kdiss = p50n

Hb + 4[O2] Hb[O2]4Hb + 4[O2] Hb[O2]4

[Hb(O2)4]Y =

[Hb(O2)4] + [Hb]

[Hb(O2)4]Y =

[Hb(O2)4] + [Hb]

[Hb(O2)4]Y =

[Hb(O2)4] + [Hb]

La Frazione di saturazione è legata alla pO2 e alla Kdiss

secondo la seguente relazione:

n

n n

pO2

Y=p50 + pO2

n

n n

pO2

Y=p50 + pO2

Equazione di HILL

[Hb] [O2][Hb(O2)4]

Kdiss =

pO24

Y = Kdiss+ pO2

4

pO24

Y = Kdiss+ pO2

pO2

Y = Kdiss+ pO2

4

pO24

Y = Kdiss+ pO2

4

pO2

Y = Kdiss+ pO2

n

pO2n

Y = Kdiss+ pO2

1,00

0.75

0.50

0.25

0.0

Y

20,0 40,0 60,0 80,0

pO2 (mmHg)

Graficamente la relazione esistente fra Y e pO2 è rappresentato da una CURVA DI OSSIGENAZIONE SIGMOIDALE, infatti il legame Hb/O2 è di tipo COOPERATIVO.

a) L’AFFINITA’ DELL’Hb PER L’OSSIGENO AUMENTA MANO A MANO CHE LE MOLECOLE DI O2

OCCUPANO I GRUPPI EME.

b) Esiste una cooperativitàpositiva fra i siti di legame dell’ossigeno (fra i gruppi EME)

c) Il legame di 1 molecola di O2 ad un gruppo EME facilita il legame di altre molecole di O2 agli altri gruppi EME

p50 ~ 26 mm Hg, valore di pO2

che satura il 50% dei siti dilegame dell’Hb

STATO R

Hb a bassa affinità, poco ossigenata

STATO T

Hb semisatura, con minimevariazioni di pO2 sideossigena e si ossigenaquasi completamente

Hb ad alta affinità, raggiunge la saturazione

Qual’è il vantaggio per un organismo vivente nel possedere una proteina respiratoria che lega l’O2 in modo cooperativo?

Hbrilascia e lega

efficientemente l’ossigeno

HbMb

1,00

0.75

0.50

0.25

0.0

Y

pO2 (mmHg)20,0 40,0 60,0 80,0 100,0

pO2 presente nei capillari tissutali

pO2 presente nei capillari polmonari

“n” o nH = Coefficiente di Hill = indica il grado di cooperatività dei sitidi legame per l’O2.

Se l’Hb avesse nH = 4, vorrebbe dire che tutte le molecole di Hb sono o completamente legate o completamente dissociate e il legame con l’O2

avviene contemporaneamente in tutti i siti. QUESTO NON AVVIENE.

Cos’è n?

• Per la Mb n = 1 (NON COOPERATIVA) • Per l’Hb n > 1 ma MAI uguale al numero dei siti per l’O2, • Le diverse emoproteine (per es. le diverse varianti di Hb prodotte a causa di

mutazioni) possono avere un grado di cooperatività (nH) differente

In realtà in condizioni fisiologiche nH dell’Hb è ~ 31< nH <N° siti >> la proteina è Cooperativa e grazie alla cooperatività dei siti dilegame subisce una transizione fra stato a bassa affinità (T) e stato ad alta affinità(R).Ciò vuol dire che, in uno stesso momento, avremmo una miscela di molecole di Hbcompletamente ossigenate, altre non ossigenate e altre parzialmente ossigenate.

nH = 1 >> Non cooperativa (Mioglobina)

nH < 0 >> Cooperatività negativa

La cooperatività di legame dell’emoglobina è possibile perché lo stato di ossigenazione di un sito può essere comunicato agli altri

siti (SONO COOPERATIVI) attraverso un cambiamento della struttura dell’Hb.

La transizione fra stato T e stato R è possibile perché quando l’Hb si ossigena cambia struttura in funzione del legame con le molecole del

suo ligando (O2) e quindi della sua concentrazione (pO2).

Infatti, Hb è una proteina ALLOSTERICA e l’ O2 è il suo effettore allosterico omotropico

1) Ha più siti di legame per il suo ligando2) Il ligando è un effettore omoallosterico: occupando uno dei siti di legame

della proteina influisce sull’affinità degli altri siti liberi3) Il legame proteina/ligando causa sempre una modificazione della struttura

3aria e anche della struttura 4aria della proteina che modifica la sua affinità nei confronti del ligando stesso.

4) Ha siti di legame per altri ligandi che agiscono come molecole regolatrici (effettori eteroallosterici) che influenzano l’affinità della proteina verso il suo

ligando5) La modulazione e il legame proteina/effettori è sempre

REVERSIBILE

7 | 23J. M. Berg et al., BIOCHIMICA, 7/E, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2012

Modello simmetrico o MWC (Monod-Wyman-Changeaux):Una proteina allosterica è un oligomero che può esistere in due stati conformazionali (T e R) in equilibrio tra loro.

Poiché il ligando si lega con maggiore affinità all’oligomero in conformazione R,l’equilibrio si sposta verso quest’ultima: gli oligomeri con conformazione T sonocostretti ad assumere quella R, dopo aver legato l’ossigeno.

Cambiamenti conformazionali contemporanei in tutte le subunità

7 | 24J. M. Berg et al., BIOCHIMICA, 7/E, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2012

Modello sequenziale (Koshland):

Una proteina allosterica è un oligomero in cui il legame con il ligando induce lamodificazione conformazionale della subunità a cui si lega. Grazie alla cooperatività ealle interazione fra le subunità, la transizione conformazionale è trasmessa anchealle atre subunità.

Cambiamenti conformazionali sequenziali man mano che viene legato l’ossigeno

In realtà nell’Hb la transizione conformazionale rispetta entrambi i modelli: - le variazioni nella struttura terziaria (T > R) causate nel primo sito di legame allo

stato T quando vi si lega la prima molecola di ossigeno è sequenziale, - la variazione strutturale quaternaria da T a R avviene di concerto

α1

β1 α2

β2

STATO THb a bassa affinità

+ O2

Legame con la molecola di O2 >> cambia la struttura 3aria della subunità legata

CON LA PARZIALE OSSIGENAZIONE (almeno un sitooccupato dall’O2 in ciascuno dei 2 dimeri αβ) l’interaproteina modifica la sua struttura 4aria assumendouna struttura piu’ disponibile ad accettare altremolecole di O2 .

α1

β1 α2

β2

α1

β1 α2

β2

α1

β1 α2

β2

α1

β1 α2

β2

α1

β1 α2

β2

α1

β1 α2

β2

α1

β1 α2

β2

+ O2

+ O2

α1

β1 α2

β2

+ O2

α1

β1 α2

β2

STATO RALTA AFFINITA’

La Transizione idealmente si completa: quando sono occupati gli ultimi siti e tutte le molecole di

Hb sono nella forma ad alta affinità

α1

β1 α2

β2

α1

β1 α2

β2

α1

β1 α2

β2

LA DEOSSI-Hb (STATO T) ÈSTABILIZZATA DA UNARETE DI LEGAMIIDROGENO E INTERAZIONIIONICHE INTRA- E INTER-CATENA.

COSA SUCCEDE ALLA STRUTTURA DELLA EMOGLOBINA QUANDO AVVIENE LA TRANSIZIONE T↔ R?

Nell’interfaccia α1/β2 e α2/β1 si stabiliscono dei ponti salini fra l’Asp94 e

l’His146 delle catene β e la Lys40 delle catene α

C-term.

Lys C5 o 40 His HC3

o 146

Asp FG1 o 94

Il legame fra l’EME e l’O2 produce il cambiamento strutturale nella proteina e il passaggio dallo stato T allo stato R.

EME convesso

Deossi-Hb:Il legame con l’His prossimale trascina il Fe2+ al di sotto del

piano dell’EME.

Stato T

Stato R

Ossi-Hb: Il Fe2+, trascinato all’interno dell’EMEdopo il legame con l’O2, si tira dietro l’Hisprossimale, tutta l’elica F e i segmenti adiacentirompendo le interazioni che stabilizzavano lostato T.

EME appiattito

(146)

(146)

Quando l’Hb inizia a ossigenarsi, il legame EME/O2 provoca un CAMBIAMENTO sia DELLA STRUTTURA TERZIARIA sia DELLA QUATERNARIA: un dimero α/β ruota e

scivola rispetto all’altro dimero α/β , questo movimento distorce e indebolisce la rete di legami H e ponti salini che stabilizza lo stato T, le catene beta si avvicinano e si

restringe la cavità centrale

(146)

Nello stato R l’estremità C-terminale (His-146, HC3) delle catene β è ruotato verso la cavità centrale e non può più formare ponti salini

https://www.youtube.com/watch?v=H3DHvJ_MEtk

Effettori eteroallosterici dell’emoglobina

H+ (pH)CO2

2,3-bisfosfoglicerato

Regolano la transizione allosterica tra statoad alta affinità e bassa affinità,aumentando l’efficienza dell’Hb nelrilasciare ossigeno ai tessuti.

SONO EFFETTORI ALLOSTERICI NEGATIVI: diminuiscono l’affinità dell’Hbper l’ossigeno

SITI REGOLATORI:

H+ SI LEGANO SU CATENE LATERALI IONIZZABILI E SUI GRUPPI N-TERMINALI

DELLE GLOBINE ALFA

CO2 SI LEGA SUI GRUPPI N-TERMINALI LIBERI DELLE GLOBINE BETA

2,3-bisfosfoglicerato SI LEGA NELLA CAVITA’ CENTRALE DEL TETRAMERO DI Hb

Effetto del pH: EFFETO BOHR

La diminuzione di pH nei capillari abbassa l’affinità dell’Hb verso l’O2

rendendone più efficiente il rilascio.La p50 sale da 26 a ~ 40 mm Hg

TESSUTI

POLMONI

Hb · 4O2 + nH+ Hb · nH+ + 4O2Hb · 4O2 + nH+ Hb · nH+ + 4O2

COME SPIEGARE IL MECCANISMO DELL’EFFETTO BOHR?

+-

-

+

COO- terminale delle catene β

La DEOSSI-Hb ha una maggiore tendenza a protonarsi della OSSI-Hb, ha un pI più alto. L’Hb ha vari siti di legame per gli ioni H+ come:

1) ammino-gruppi N-terminali delle catene alfa 2) His 146, residuo C-terminale, delle catene β3) altri……..

DEOSSI-HbSTATO T

Nei capillari tissutali, quando l’Hbinzia a deossigenarsi, l’His-146

delle catene β diventa più basica, il suo pKR aumenta (> 7.2)

α-2 Lys40

β-1 His146 β-1 Asp94

Nei capillari tissutali il pH è ~6.8

L’His-146, acquista un H+ e forma un ponte salino intra-catena con l’Asp 94, che stabilizza la forma

deossi-Hb (stato T)

Questo contribuisce al cambiamento strutturale

che favorisce l’ossigenazione completa

della Hb.

A livello polmonare l’Hb inizia a legare O2: inizia la transizione

allosterica (T > R), l’His-146 delle catene β diventa più acida, il suo

pKR diminuisce (~6.5 )

Nei capillari polmonari il pH è ~7.6, nel torrente circolatorio è ~7.2 (maggiore rispetto al pKR

dell’His-146).

L’His-146 si trova nella sua forma DEPROTONATA e

NON può formare il ponte salino con l’Asp 94

Hl94

―C ―lCH

2lC=OlO-

Hl94

―C ―lCH

2lC=OlO-

Hl146

¯ OOC―C ―

lCH2

l H

C―N

CH

C―N

H H

+

Hl146

¯ OOC―C ―

lCH2

l H

C―N

CH

C―N

H H

+

ANIDRIDE CARBONICA (CO2)La CO2 viene liberata nel circolo sanguigno alivello periferico durante i processi metabolicicellulari. È trasportata nel sangue in tre forme:

1) Parte della CO2 si lega all’Hb nelle estremità N-terminali libere delle catene globiniche β formando CARBAMMATI = gruppi carichi negativamente che stabiliscono interazioni elettrostatiche con i residui di Arg-141 delle catene α stabilizzando la forma T

CO2 + H2O HCO3- + H+ (reazione catalizzata dall’ANIDRASI

CARBONICA)

2) disciolta: obbedisce alla Legge di Henry come l'O2 ma è 20 volte piùsolubile di questo. In questa forma costituisce il 10% del gas liberato dalsangue venoso nel polmone.

Gli ioni H+ si legano alla DEOSSI-Hb (che più basica della forma

OSSI-Hb ed è quindi un accettore di protoni migliore)

il bicarbonato, quando aumenta di concentrazione, diffonde dal

globulo rosso al plasma scambiandosi con ioni Cl-

Contribuisce all’effetto BOHR e quindi al rilascio di O2

3) Diffonde all’interno degli eritrociti dove è convertita in bicarbonato:

CO2Effettore allosterico negativo per l’Hb

1,00

0.75

0.50

0.25

0.0

Y

20,0 40,0 60,0 80,0 100,0

pO2 (mmHg)

Se la pCO2 diminuiscel’affinità aumenta(p50 + bassa) Se la pCO2 aumenta

l’affinità diminuisce(p50 + alta)