Prote on moscow

April 15, 2023

Система для анализа межмолекулярных взаимодействий ProteOn XPR36

Life Science Group

Методы исследования межмолекулярных взаимодействий

С использованием метки

Флуоресцентная

Радиоизотопная

Пр.

Без использования метки

В растворе Двух и более гибридные системы в

культурах дрожжевых клеток Изотермическая титрационная

калориметрия (ITC) Аналитическое

ультрацентрифугирование (AUC)

На поверхности (биосенсоры) Оптические

– Поверхностный плазмонный резонанас (SPR)*

– Эллипсометрия

– Поглощение/отражение Электрические (Амперометрия,

проводимость, емкость) Механические (Акустические,

микромеханические и пр)

Life Science Group

Использование меток

Традиционный биохимический анализ –

цветовое мечение продуктов реакции

ELISA: фермент-опосредованный иммуносорбционный анализ

ИФА – Иммунофлуоресцентный анализ

Традиционные методологии

(1) Мечение требует времени и может влиять на взаимодействие молекул между собой

(2) Низкая точность кинетических параметров

(3) Затруднения при работе с низкомолекулярными веществами

Life Science Group

Преимущества биосенсоров

Поглощение/испускание света

Полимерная поверхность

Металлизированная поверхность

Коэффициент преломления/световая интерференция

Вместо детектирования светового сигнала из области реакции, можно определять изменения коэффициента преломления подложки

SPR – наиболее широко применяемая технология для измерения биомолекулярных взаимодействий без применения меток

Таг-репортер испускает световой сигнал непосредственно из области реакции

Существует ли другой способ детекции?

Life Science Group

Поверхностный плазмонный резонанс….ППР – это возбуждение электронного газа (плазмона) вдоль поверхности металл/диэлектрик посредством света.

позволяет обходиться без меток обеспечивает измерения в режиме реального

времени возникает на поверхности чипа

Детекция SPR Измеряются изменения коэффициента преломления на слое золота

Эти изменения пропорциональны изменениям массы на поверхности

– Масса меняется при иммобилизации белка на чипе

– Масса еще раз меняется при пропускании потока аналита

– Масса меняется при диссоциации аналита На выходе = двухфазная кривая, сенсограмма, по которой можно судить о кинетике

взаимодействия (ka и kd)

Что такое SPR?

-200

20406080

100120140160180200

0 50 100 150 200 250 300

Life Science Group

Геометрия Кречманна

Призма

Поляризованный свет Отраженный свет

Слой золота Сенсорная поверхность

Проточный канал

Светоиспускающие диоды освещают призму под различными углами

CCD

Life Science Group

Базовая терминология SPR

На поверхности взаимодействуют 2 молекулы

• Поверхность: обычно это полимер с функциональными

карбоксильными группами

• Лиганд: один из партнеров взаимодействия,

иммобилизован на поверхности

• Аналит: один из партнеров взаимодействия, протекает

вдоль поверхности

Лиганд

Аналит

Поверхность

Life Science Group

Поверхность биосенсора

Иммобилизация лиганда Ток аналита

Присоединение аналита/взаимодействие

Этапы


Технология SPR

СЕНСОГРАММА


Life Science Group

ПотокПоток

Проточная ячейка

ДиссоциацияДиссоциация

СвязываниеСвязывание

Достижение равновесияДостижение равновесия

Технология SPR

Life Science Group

Преимущества безметочного подхода

Биомолекулярные взаимодействия

• Белок-Белок• Белок-Пептид• Антиген-Антитело• Белок-Низкомолекулярное соединение

• НК-Белок• НК-ДНК• Углеводы-Белок• Липиды – Низкомолекулярные соединения

• Насколько специфично взаимодействие?

• Насколько быстро происходит взаимодействие (ka)?

• Насколько стабилен комплекс (kd)?

• Насколько сильно взаимодействие (KD)?

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec-20

4

28

52

76

100

-100 100 300 500 700 900

RU

Sec

RU

Sec

A1 22_LMW1_A2 21_LMW1_A2 22_LMW1_A3 21_LMW1_A3 22_LMW1_A4 21_LMW1_A4 22_LMW1_A5 21_LMW1_A5 22_LMW1_A6 21_LMW1_

A1 22_LMW1_A2 21_LMW1_A2 22_LMW1_A3 21_LMW1_A3 22_LMW1_A4 21_LMW1_A4 22_LMW1_A5 21_LMW1_A5 22_LMW1_A6 21_LMW1_

A + B A Bk a

k d

Life Science Group

Типы анализов, осуществляемых посредством SPR

• ДаДа//НетНет – являются ли молекулы партнерами взаимодействия

• КинетическийКинетический – ka и kd константы скоростей ассоциации и диссоциации, соответственно

• РавновесныйРавновесный – KD константа аффиности

• КонцентрационныйКонцентрационный – определение активной концентрации аналита

• Термодинамический Термодинамический – свободная энергия, энтальпия, энтропия. Объяснение значений кинетических констант связывания

Life Science Group

Одинаковая аффинность – различная кинетика

KD=1x10-6 [M]

-20

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0 50 100 150 200 250 300-2

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 50 100 150 200 250 300

ka=1x105 (1/Ms); kd=1x10-1 (1/s)ka=1x102 (1/Ms); kd=1x10-4 (1/s)

Полный спектр кинетических данных – преимущество SPR

Life Science Group

Области применения биосенсоров

Скрининг/ранжирование антител

Характеризация антител

Изотипирование антител

Картирование эпитопов

Скрининг лекарств/

низкомолекулярных соединений

Определение концентраций

Анализ мутантов

Картирование поверхности белка

Формирование белкового комплекса

Лиганд-рецепторное взаимодействие

Life Science Group

Ограничения существующих SPR систем

Biosensor Surface

Низкая производительность Последовательное пропускание образцов

– Иммобилизация

– Ввод аналита

– Регенерация

– Повтор шагов

Получение кинетических данных в полном объеме требует проведения серии экспериментов

Трудоемкость экспериментального дизайна Ограниченность автоматизации

Life Science Group

Системы с последовательным пропусканием образца

Ввод аналита

Принцип работы

1 канал - образец

2 канал – канал сравнения 2 канал – канал сравнения


2 канал – канал сравнения

Активация Иммобилизация лиганда


Life Science Group

Анализ белковых взаимодействий

ProteOn XPR36 Система анализа белковых

взаимодействий

Life Science Group

ProteOn XPR36 Система анализа белковых взаимодействий

Поверхностный плазмонный резонансСистема пересекающихся микроканалов

Измерьте 36 взаимодействий за один запуск Новое слово в SPR: одновременный анализ нескольких образцов

6 x 6 = 6 Лигандов x 6 Аналитов

Оптический биосенсор

Life Science Group

Шаг 1Иммобилизация (до 6 лигандов)• Активация• Иммобилизация• Деактивация

Шаг 2Инъекция до 6 аналитовв перпендикулярномнаправлении

Шаг 3Увеличенное изображение однойиз 36 областей взаимодействий

Особенности XPR подхода

6x6

Life Science Group

Параллельная проточная система

Одновременное протекание нескольких образцов в системе ProteOn XPR36реализовано при помощи системы пересекающихся микроканалов

Преимущества1. 6 x 6 инъекций в перпендикулярных направлениях2. Одновременный анализ 36 взаимодействий3. Снижение длительности эксперимента4. Высокая производительность при низкой себестоимости5. Различные варианты нормирования базовой линии

Life Science Group

Каналы иммобилизации лиганда

6 Каналов

Сенсорный чип

Life Science Group

Иммобилизация лигандов

Функциональные группы, по которым возможна иммобилизация NH2

COOH SH COH

Life Science Group

Каналы для протекания аналита

6 Каналов для аналита

Life Science Group

1.13.3

11

100 nM33

0.37

analyteanalyte

1.1

3.311

100 nM

33

0.37

ОтмывкаОтмывка

11

2233

4455

66

1122334455

66

Вся кинетика одним выстрелом

Life Science Group

Лиганды

Аналиты

L1 L2 L3 L4 L5 L6

A1

A2

A3

A4

A5A6

Интерспоты Канал

Life Science Group, Bulletin 3172

Уникальные возможности для установки базовой линии: интерспоты

Life Science Group

Во время ввода аналитов в 6 ряд подается буфер Корректировка в режиме реального времени

Life Science Group, Bulletin 3172

L1 L2 L3 L4 L5 L6

A1

A2

A3

A4

A5A6

Буфер

Уникальные возможности для установки базовой линии: вычитание сигнала ряда

Life Science Group

Дрейф базовой линии обусловлен подтеканием лиганда с захватывающей поверхности

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec-40

8

56

104

152

200

-60 112 284 456 628 800

RU

Sec

RU

Sec

A1 GLM IL-A2 GLM IL-A3 GLM IL-A4 GLM IL-A5 GLM IL-A6 GLM IL-

A1 GLM IL-A2 GLM IL-A3 GLM IL-A4 GLM IL-A5 GLM IL-A6 GLM IL-

sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec-40

8

56

104

152

200

-60 112 284 456 628 800

RU

Sec

RU

Sec

A1 GLM IL-A2 GLM IL-A3 GLM IL-A4 GLM IL-A5 GLM IL-

A1 GLM IL-A2 GLM IL-A3 GLM IL-A4 GLM IL-A5 GLM IL-

sec

Рабочий буфер

Подача буфера – пустой «впрыск» - в режиме реального времени полностью компенсирует наклон базовой линии

Дрейф базовой линии

Уникальные возможности для установки базовой линии: двойной контроль в режиме реального времени

Life Science Group

Возможности экспериментального дизайна

“1 к 1” (Оптимизация взаимодействия)

6 лигандовГрадиент 1 лиганда

“6 к 1” (Высокопроизводительная кинетика)

6 ра

звед

ений

1 а

нал

ита

6 ра

звед

ений

1 а

нал

ита

Life Science Group

“6 к 6” (мультиплексный скрининг)

1 ан

алит

36 лигандов6 лигандов

6 ан

алит

ов

“36 к 1” (высокопроизводительный скрининг)

Возможности экспериментального дизайна

Life Science Group

Эффективность эксперимента

A1

A2

A3

A4

A5

A6

L1 L2 L3 L4 L5 L6

Дизайн типичного эксперимента “1 к 1”(Набор «Низкомолекулярное соединение» )

L1

L1

L1

L1

L1

L1

L6

L6

L6

L6

L6

L6

L2

L2

L2

L2

L2

L2

L3

L3

L3

L3

L3

L3

L5

L5

L5

L5

L5

L5

L4

L4

L4

L4

L4

L4

L1: CA II

L2: CA II

L3: CA II

L4: CA II

L5: CA II

L6: CA II

Лиганд: CA II

A1: CBS 6.67 μM

A2: CBS 2.22 μM

A3: CBS 0.74 μM

A4: CBS 0.25 μM

A5: CBS 0.08 μM

A6: CBS 0.00 μM

Аналит: CBS в разведениях

High

Low

Градиен

Life Science Group

За 1 запуск:

(1) получены достоверные данные по кинетике

(2) подобраны оптимальные условия эксперимента без использования регенерации. Это и есть “Кинетика одним выстрелом”.

Эффективность эксперимента

Life Science Group

Выбор чипа

GLC/GLM/GLH LCP HTG/HTE NLC MNT

Чипы для Конъюгациичерез аминогруппуразличной емкости

Поверхность для иммобилизациилипосом

Поверхность для захвата белков с His- тагами (3-NTA-комплекс),Различная емкость

Нейтравидиноваяповерхностьдля захватаБиотинилированных

молекул

Чип для обслуживания

Виды сенсорных чипов

Life Science Group

Изучение свойств рецептора IL-1 человека

Рецептор IL-1 иммобилизовали в буферах с различными значениями

pH для поиска оптимальных условий, при которых: достигается достаточная плотность лиганда лиганд остается активным

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec-2000

2000

6000

10000

14000

18000

-100 160 420 680 940 1200

RU

Sec

RU

Sec

L1 A1 GL LiL2 A3 GL LiL3 A2 GL LiL4 A4 GL LiL5 A5 GL Li


RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec1114.09

1614.09

2114.09

2614.09

3114.09

3614.09

982.79 1032.79 1082.79 1132.79 1182.79

RU

Sec

RU

Sec



4.04.55.05.56.0

pH

4.04.55.05.56.0

pH

Пример 1:Оптимизация экспериментальных условий за 1 запуск

Life Science Group

Результаты взаимодействия рецептора с IL-1 и его антагонистом

1500

2000

2500

3000

3500

3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5pH

Lig

an

d d

en

sit

y (

RU

)

0

100

200

300

400

500

Rm

ax

(R

U)

Ligand density Rmax IL-1 Rmax IL-1 ra

• Максимальную плотность лиганда наблюдали при pH 5.0 • Наибольшая активность - при pH 5.5

Life Science Group

Интерлейкин-1 человека и его антагонист

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec-50

30

110

190

270

350

-50 120 290 460 630 800

RU

Sec

RU

Sec

A1 GLC IL-A1 GLC IL-A2 GLC IL-A2 GLC IL-A3 GLC IL-A3 GLC IL-A4 GLC IL-A4 GLC IL-A5 GLC IL-A5 GLC IL-A6 GLC IL-A6 GLC IL-


RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec-50

30

110

190

270

350

-50 120 290 460 630 800

RU

Sec

RU

Sec



RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec-50

30

110

190

270

350

-50 120 290 460 630 800

RU

Sec

RU

Sec



RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec-50

30

110

190

270

350

-50 120 290 460 630 800

RU

Sec

RU

Sec



RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec-50

30

110

190

270

350

-50 120 290 460 630 800

RU

Sec

RU

Sec



ka (1/Ms) kd (1/s) KD [M]

3.42E+06 8.81E-03 2.57E-9

ka (1/Ms) kd (1/s) KD [M]

5.13E+05 5.21E-05 1.02E-10

Антагонист IL-1

IL-1

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec-50

40

130

220

310

400

-50 120 290 460 630 800

RU

Sec

RU

Sec



RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec-50

40

130

220

310

400

-50 120 290 460 630 800

RU

Sec

RU

Sec



RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec-50

40

130

220

310

400

-50 120 290 460 630 800

RU

Sec

RU

Sec



RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec-50

40

130

220

310

400

-50 120 290 460 630 800

RU

Sec

RU

Sec



RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec

RU

Sec-50

40

130

220

310

400

-50 120 290 460 630 800

RU

Sec

RU

Sec



Life Science Group

С помощью одного экспериментального протокола на одном чипе:

1. Рецептор IL-1 человека был иммобилизован на поверхности в буфере при пяти различных значениях pH (pH 4 - 6)

2. Наивысшая плотность лиганда - при pH 5.0

3. Инъекция IL-1 и его антагониста показывает, что оптимальная активность (по Rmax) – при pH 5.5

4. Более высокиое значение KD антагониста обусловлено более медленной диссоциацией

Рецептор IL-1 человека: резюме

Life Science Group

Быстрый отбор супернатантов Быстрый отбор супернатантов высокоаффинных антителвысокоаффинных антител

Быстрый отбор супернатантов Быстрый отбор супернатантов высокоаффинных антителвысокоаффинных антител

ЦельЦель:: скрининг и определение кинетических констант и скрининг и определение кинетических констант и равновесной константы 250 супернатантовравновесной константы 250 супернатантов

Пример 2:скрининговые работы с применением техники захвата

Life Science Group

Анти-

мыш

ины

е

Анти-

мыш

ины

е Ig

G Ig

G

1 2 3 4 5 61 2 3 4 5 6

Захват мышиных АТ к антителам человекаЗахват мышиных АТ к антителам человека;; номер супернатантаномер супернатанта

5 ра

звед

ений

челове

ческ

ого

5 ра

звед

ений

чел

овече

ског

о

анти

гена

анти

гена

БуферБуфер

-10

15

40

65

90

115

-50 50 150 250 350

sec

RU

-10

15

40

65

90

115

-50 50 150 250 350

sec

-10

10

30

50

70

90

-50 50 150 250 350

sec

-10

30

70

110

-50 50 150 250 350

sec

-10

15

40

65

90

115

-50 50 150 250 350

sec

-10

15

40

65

90

115

-50 50 150 250 350

sec

Базовая линия по Базовая линия по интерспотаминтерспотам

11

22

33

Скрининг и ранжирование супернатантов: схема работы

РегенерацияРегенерацияРегенерацияРегенерация

44

Life Science Group

-10

40

90

140

190

240

290

-50 150 350 550 750

sec

RU

-10

40

90

140

190

240

290

-50 150 350 550 750

secR

U

-10

30

70

110

150

190

-50 150 350 550 750

sec

RU

-101030507090

110130150170190

-50 150 350 550 750

sec

RU

-10

15

40

65

90

115

140

165

190

-50 50 150 250 350 450 550 650 750

sec

RU

-10

15

40

65

90

115

140

165

190

-50 50 150 250 350 450 550 650 750

sec

RU

11 супернатант в 1 канале супернатант в 1 канале 2 супернатант во 2 канале2 супернатант во 2 канале 3 супернатант в 3 канале3 супернатант в 3 канале

4 супернатант в 4 канале4 супернатант в 4 канале 5 супернатант в 5 канале5 супернатант в 5 канале 6 супернатант в 6 канале6 супернатант в 6 канале

Используемые концентрации: 50 (красный), 25 (розовый), 12.25 (желтый), 6.25 (голубой) и 3.12 (зеленый) nM

Данные одного из запусков: 6 супернатантов

Life Science Group

1.0E-06

1.0E-05

1.0E-04

1.0E-03

1.0E-02

1.0E+04 1.0E+05 1.0E+06

ka [1/Msec]

kd [

1/se

c]

Скрининг и ранжирование супернатантов:результаты

Высокоаффинное Высокоаффинное взаимодействиевзаимодействие

Низкоаффинное Низкоаффинное взаимодействиевзаимодействие

100100 nMnM

1010 nMnM

11 nMnM

0.10.1 nMnM

0.010.01 nMnM

Линии изоаффинностиЛинии изоаффинности

Life Science Group

Скрининг и ранжирование супернатантов: итоги

НаНа 1 1 ЦиклЦикл::• Супернатант: 5 минут на 6 супернатантов.• Антиген: ассоциация 2 минуты + диссоциация 10 минут.• Регенерация: 1 минута.

Полное время 1 цикла: 18 минут на 6 супернатантов

НаНа 1 1 ЦиклЦикл::• Супернатант: 5 минут на 6 супернатантов.• Антиген: ассоциация 2 минуты + диссоциация 10 минут.• Регенерация: 1 минута.

Полное время 1 цикла: 18 минут на 6 супернатантов

Всего для 250 супернатантовВсего для 250 супернатантов: 250/6*18 = : 250/6*18 = 12.512.5 часовчасов длядля 250250 супернатантовсупернатантов

Полная кинетикаПолная кинетика!!!!!!

Всего для 250 супернатантовВсего для 250 супернатантов: 250/6*18 = : 250/6*18 = 12.512.5 часовчасов длядля 250250 супернатантовсупернатантов

Полная кинетикаПолная кинетика!!!!!!

Life Science Group

Спасибо за внимание!Спасибо за внимание!

ProteOn XPR36

Life Science Group

Prote on moscow

Health & Medicine