Propiedades químicas de aminoácidos, péptidos y proteínasufq.unq.edu.ar/Docencia-Virtual/BioquimicaI/Teorias/prop-quimicas.pdf · 6 Secuenciación de fragmentos (Edman, 1950)

Propiedades químicas de aminoácidos, péptidos y proteínas

Emil Fischer (1852-1919) Franz Hofmeister (1850-1922)

74th Meeting of the Society of German Scientists and Physicians. 1902, Karlsbad

R1R2

Enlace peptídico

∆G°= 10kJ/mol

ι1/2=7 años, pH=7 y 25°C

Secuencia: AlaGluGlyLys o AEGK

NH2

COO-

NH2NH2

COO-

COO-

• Reacciones del enlace peptídico

• Reacciones del grupo amino terminal

• Reacciones del grupo carboxilo terminal

Análisis químico

Composición? Detección? Secuencia?

Reacciones del enlace peptídico

• Hidrólisis ácida (ClH 6M a 100 C, 24hs). Hidrólisis alcalina.

• Reacción de Biuret ( SO4Cu/tartrato alcalino 540nm). Baja sensibilidad.

• Reacción de Lowry et al. (Reactivo de Folin-Ciocalteau = mezcla de óxidos de tungsteno y molibdeno) 720-750 nm

Reacciones del grupo amino (terminal)

• Ninhidrina (570 nm) Pro a 440nm

• Fluorescamina (producto fluorescente). Alta sensibilidad

• 1-Fluoro-2,4 dinitrobenceno(FDNB, reactivo de Sanger)

• Cloruro de dansilo

• o-ftalaldehído (en sn con mercaptoetanol, producto fluorescente). Alta sensibilidad

Reacciones del grupo Carboxilo

• Hidrazina (H2NNH2) (hidrazinolisis)

• Carboxipeptidasa (exopeptidasas)

Frederick Sanger (1918-..)

Premio Nobel 1958, 1980

Secuenciación

1. Purificación de la proteína o péptido

2. Determinación de la composición y PM

3. Determinación del número de cadenas (ruptura de los puentes disulfuro)

4. Determinación de los extremos amino-terminales y carboxilo-terminales

5. Corte específico de la secuencia principal en fragmentos menores, al menos en dos formas distintas

6. Purificación de cada segmento y secuenciación

7. Determinación de la secuencia total

3 Ruptura de –S-S-

DTNB ( ácido ditio-bis-nitrobenzoico)

nitrotiobenzoato

4 Determinación de extremos

Producto púrpura

5 Cortes y producción de fragmentosMétodos enzimáticos

5 Cortes y producción de fragmentosMétodos químicos

6 Secuenciación de fragmentos (Edman, 1950)

pH=9