Propiedades antivirales de las proteínas y péptidos de la leche RAVINDER NAGPAL 1, CHAITANYA. S 1, MONICA PUNIYA 2, AARTI BHARDWAJ 3, SHALINI JAIN 4 AND.

Propiedades antivirales Propiedades antivirales de las proteínas y de las proteínas y

péptidos de la lechepéptidos de la lecheRAVINDER NAGPAL1, CHAITANYA. S1, MONICA PUNIYA2, AARTI

BHARDWAJ3, SHALINI JAIN4 AND HARIOM YADAV4*

1Microbiología láctea, 2Nutrición de ganado de lácteos, 4Bioquímica animal,Instituto Nacionald e Investigación Láctea, Karnal 132001,

Haryana, Instituto Meerut de Ingeniería y Tecnología, Meerut-250002, U.P., India.*Email: [email protected]

Introducción

• Las proteínas y péptidos de la leche poseen propiedades biológicas más allá de su significancia nutriológica.

• En 1987, lactoferrina (LF) - Virus asociado a leucemia (FLV)

• Proteínas y péptidos de la leche modificadas químicamente.

• Proteínas con actividad

antiviral:

Lactoferrina (LF)

Lactadherina

Glicoproteína

Inmunoglobulina (Ig)

Lactoferrina (LF)Lactoferrina (LF)

• Hierro multifuncional unido a glicoproteína

• Liberada en el estómago por pepsin cleavage a pH ácido

• LF - Actividad antiviral para virus DNA y RNA

ACCIÓN DE VIRUS ENVUELTOS POR LF:

Virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) Citomegalovirus humano (CMV)

Virus del herpes simplex tipo 1 y 2 (HSV)

Virus de la hepatitis B, C y G

Papilomavirus humano (HPV) y

Alfavirus

- Virus no cubiertos:

Rotavirus

Enterovirus

Poliovirus

Adenovirus y

Calicivirus felinos

Efectos antivirales de las proteínasEfectos antivirales de las proteínasVirus

(Cubierto)

Proteína Comentarios/acción propuesta

HIV LF

Leche

bLF & hLF bloquea la absorción de HIV-1 por células objetivos

Inhibe la unión de HIV-1 a receptor en CD4

HSV-1 y 2 LF bLF y hLF se une a las partículas virales y efecto sinérgico con acyclovir

HCMV LF o Interfiere con virus en células objetivo

o Regulación de células asesinas

o Efecto antiviral sinérgico con cidofovir

HCV LF o Une a proteínas de cubierta viral E1 y E2

o bLF administrado oralmente puede ser efectivo en combinación con interferón

Alfavirus LF hLF inhibe interacción de virus con receptores sulfato heparan

Hantavirus LF o Efecto sinérgico con ribavirina sobre la replicación viral

o bLF administrado oralmente puede ser efectivo en combinación con interferón

HPV LF Interfiere con la interiorización del virus en la células del huésped

Virus(No envuelto)

Proteína Comentarios/acción propuesta

Rotavirus

Lactoadhesina

Glicoproteína de alto peso molecular; leche de vaca

Concentrado de Ig

Lactoadhesina protege a los alimentados al seno de la infección

Efectiva in vitro; el modo de acción no se conoce

Un efecto in vivo; 100 veces más alto que el obtenido con leche humana

PV LF Se une a células objetivo

Virus humano de la influenza

LF Inhibe la hemoaglutinación por los virus

FCV LF bLF interfiere con la absorción de virus por las células objetivo

Adenovirus LF bLF y hLF compiten con virus por receptores comunes de membrana

Mecanismos antivirales de LF

Mecanismo de Mecanismo de acciónacción

• Primero, LF parece interactuar con los receptores de la superficie celular, tales como los glicosaminoglicanos los cuales son sitios de unión para muchos virus.

• Segundo, LF se une directamente a partículas virales e inhibe la adsorción viral a células objetivo.

• Efectividad antiviral: Las diferencias en secuencia de

aminoácidos de región antiviralCadenas de Glycan y el número de

puente disulfuro entre hLF y bLF

• HIV, HSV, CMV y adenovirus, reconocen proteoglicanos de la superficie celular (heparina y sulfato de heparina) como receptores.

Entrada de HIV-1 en las Entrada de HIV-1 en las células objetivocélulas objetivo

Mediada por glicoproteina gp-120 y gp-41

Receptor CD4 y co-receptores CCRS, CXCR4

Fusión de membranas celulares y virales

Interacción entre el curva V3 y heparan sulfato adhiere

el virus a la superficie celular

Componentes positivamente cargados (AMD3100 y

ALX40-4C) bloquean la replicación de VIH-1,

interactúan con co-receptores cargados negativamente.

Cont…

Purificación de las proteínas y péptidos de la Purificación de las proteínas y péptidos de la leche de vacaleche de vaca

α-S2 Caseína, LFcina-B bovina y k-caseína bovina

Hidrólisis con pepsina

Cromatografía de intercambio de cationes

Fragmentos obtenidos caracterizados por HPLC y ESI-MS

• β-caseína bovina y β lactoglobulina son modificadas por ácido maleico

(Ikura et al., 1984)

• As2-caseína es modificada con 3-hidroxiftalico anhídrido

• El grado de modificación checado con orto-ftaldialdeído. (Berkhout et al., 1997)

Cont…

Métodos para checar Métodos para checar propiedades antiviralespropiedades antivirales

• ELISA

• Ensayo MTT

• Método de radioisótopos

1. ELISA1. ELISAAdicione proteína de leche(1-10 µM ),antes de

adicionar el virus VIH-1

Supresor T1 del crecimiento de la línea celular en medio RPMI con 10% FCS a 37 ºC en 5% CO2

Virus sembrado en un pico de producción y almacenado a - 70 ºc

Cuantificado en antígeno CA-P24 ELISA

2. Ensayo MTT2. Ensayo MTT

Línea celular MT2 T infectada con VIH-1 - aumentó la concentración de proteínas de la leche.

Después de 5 días de post-infección

Células vivas convierten el MTT {3-(4,5-dimethylethiazole-2-ly)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)

Producto azul (formazina)

3. Método de radioisótopo3. Método de radioisótopo

Vaso de cultivo celular (Nunclon de 24 placas)

Inhibidores de proteínas no específicas

Adiciones aupresor de células T1 en un medio completo (RPMI)

Etiquete radiactivamente con 125 I-bLF e incube las placas de 4 ºc a 37 ºc por 1 hora

Cantidad de radioactividad recuperada fue determinada por contador Gamma.

Resistencia a lactoferrinaResistencia a lactoferrina

1. Aislamiento HIV-1 LA1 cultivado en presencia de 10µM bLF

2. Células libres de virus son pasadas a células supresoras T1 no infectadas.

3. Observe la formación masiva de sincitio en el cultivo

4. Muestra del virus es tomada después de varios días.

5. Prueba para infección paralela con y sin LF

6. Células infectadas congeladas a -80 ºc para análisis subsecuente de DNA

7. PCR amplificada , Gel purificada y clonada en una vector clonador.

8. Múltiples clones son insertados como fragmento Bam H1 en el clono moclecular PLA I

9. Pruebe su capacidad de replicación con y sin bLF

Cont…

Proteínas purificadas de la leche y su efecto en la Proteínas purificadas de la leche y su efecto en la replicación de VIH-1replicación de VIH-1

Sin actividad antiviral los péptiodos cargados negativamente

b-caseína 1-28 kcaseína 1-10 y CMP-A y CMP- B a 10 mM

Inhibición viral completa - proteína de la leche cargada negativamente modificada químicamente 3HP-CN

Péptidos cargados positivamente nisina y lactoferricina

10 µM - moderadamente inhiben VIH-1 100 µM - completa inhibición pero se observa

citotoxicidad

bLF significativamente inhibe a concentración de 0.1-1.0 µM

LF humana - proteína nativa y recombinante moderadamente actúan como inhibidores a concentración de 3.1 µM

Cont…

Inhibición de lactoferrina de CXCR4 y CCR5-Inhibición de lactoferrina de CXCR4 y CCR5-usando virususando virus

Lactoferrina tiene cargas positivas y negativas a pH fisiológico

Eso interfiere con la interacción virus-co-

receptor

Estos VIH-1 usados para infectar línea celular U87CD4 que fueron transfectadas con CXCR4/CCR5

bLF es un componente superior anti- VIH-1

comparado con LF humana y LF murina, en cualquier forma, nativa o recombinante

bLF es 69% y 64% identica a hLF y mLF respectivamente

Plasma bovino y proteínas de la leche están ampliamente disponibles

Estas proteínas industriales son producidas a gran escala, a través de simples modificaciones químicas

Cont…

Provee antivirales relativamente baratos para administración local o sistémica

Uso sistémico de proteínas de la leche químicamente modificadas en el humano puede ocasionar mayor toxicidad y problemas de inmunogenicidad

Excepto la suc-HAS & 3HP-LA que muestra bajo nivel de toxicidad e inmunogenicidad

Cont…

Propiedades antivirales de otras Propiedades antivirales de otras proteínas de la lecheproteínas de la leche

Lactadhesina

Glicoproteina

Inmunoglobulina (Ig)

• Lactoadhesina :

Receptor que se une a virusÁcido siálico juega un papel importante en

su acción antiviral Lactoadhesina humana protege a los

lactantes alimentados al seno contra infección sintomática por rotavirus

• Glicoproteína: Fracción de alto peso molecular de la

leche de bovinosEfectiva contra rotavirus humano in

vitro

• Inmunoglobulina láctea: Hiperinmunizada con rotavirus humano

durante la gestación de vacas.100 veces- leche humana10 veces – IG comercial

Péptidos antivirales Péptidos antivirales derivados de las derivados de las

proteínas de la lecheproteínas de la leche Lactoferricina

GMP

Complejo mucina

Virus Péptido Comentarios/modo de acción propuesto

HSV-1 y 2 LFcina Un efecto in vitro; más débil que LF: produce un efecto sinérgico con acyclovir

HCMV, FCV, Adenovirus

LFcina Un efecto in vitro; más débil que LF

Efecto antiviral de péptidosEfecto antiviral de péptidos

Virus

(Cubierto)

Péptido Comentarios

Virus Epstein–Barr

GMP Previene cambios morfológicos en linfocitos de sangre periférica

Virus (No cubierto)

Péptido Comentarios

Rotavirus Complejo mucina; leche humana

Inhibe replicación de rotavirus in vitro y previene gastroenteritis in vivo

Fomento de actividad Fomento de actividad antiviral por modificación antiviral por modificación

químicaquímica• Modificaciones químicas dan lugar a cambios en

las cargas sobre las proteínas de la leche lo cual puede fomentar sus propiedades antivirales

(Swart, Harmsen, et al., 1999; Waarts et al., 2005)

• Dos principales formas:Acilación para aumentar cargas negativasAminación para aumentar cargas positivas

Succinilación y aconitilación de LF tienen efectos más fuertes anti- VIH-1 (2-4 veces más activos que la LF original)

(Swart, Harmsen, et al.,1999)

• Algunas otras proteínas - b-Lg, a-La y HSA, también han incrementado el efecto contra VIH-1 y VIH-2

(Jiang, Lin, Strick, Li, & Neurath, 1996)

• Cargas negativas adicionales fueron introducidas a través de modificaciones de residuos de lisina.

Cont…

• b-Lg modificada con ácido 3- hydroxyphthaloyl (3HP) interfirió con la infección por HIV-1, HSV-1 y 2, y HCMV

(Berkhout et al., 2002; Swart, Kuipers, et al., 1996)

• También se encontró que 3HP-a-La y 3HP-as2-caseína fueron también efectivos contra HIV-1

Cont…

• 3-HP-b-Lg podría ser un agente eficaz para prevenir transmisión vaginal de infecciones por el virus herpes virus.

• Aumento de carga positiva neta sobre LF

Aminación deroga su efecto anti-VIH pero incrementa el efecto anti-HCMV

Acilación inhibe propiedades anti-HCMV de LF pero es efectiva contra el virus de la influenza.

Cont…

ConclusiónConclusión

• Proteínas de la leche mejoran la salud de pacientes afectyados por infecciones virales.

• LF bovina mostró considerable acción inhibitoria contra la mayoría de los virus.

• Resultados de investigación emprendidas a la fecha, primariamente bajo condiciones in vitro.

• En años recientes, efectos in vivo han sido reportados en modelos de ratones y ratas.

• A corto plazo, para prevención y terapia de infecciones virales en animales y humanos.

• Beneficios de algunas de las modificaciones químicas observadas in vitro podrían explorarse.

• Para aplicaciones específicas en atención en salud de humanos y animales.

Cont…