PROJEKT Olga Kalinowska PRODUKCJA KWASU CYTRYNOWEGO PRZEZ ASPERGILLUSNIGER SZCZEP C-12 METODĄ WGŁĘBNĄ OKRESOWĄ Praca wykonana pod kierunkie m dr inż.Jadwigi Farbiszewskiej – Kiczmy UNIWERSYTET OPOLSKI Wydział Przyrodniczo – Techniczny Samodzielna Katedra Samodzielnej Katedry Biotechnologii i Biologii Molekula rnej
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Zawartość ogólnego azotu powinna wynosić nie niej niż 1,6 %. Z azotowych związków
organicznych melasa zawiera głównie betainę, kwas asparaginowy i glutaminowy.
Melasa zawiera składniki koloidowe, zarówno w postaci zawiesin, jak i cząstek rozpuszczonych. Mają one ładunek ujemny (wytrącają się przy odczynie kwaśnym, jaki jest
wymagany do hodowli Aspergillus niger ) jak i dodatni [2]. Zawartość składników koloidowych
waha się w granicach 0,2-6%. Wytrącają się głównie składniki barwne, humusowe, karmelowe
oraz melanoidy. Substancje barwne występujące w melasie to kompleksy pirokatechinowo –
żelazowe, pochodzące z buraków, melanoidy (nadające barwę melasie, powstają w procesie
kondensacji cukru, zwłaszcza inwertu z aminokwasami – głównie kwasem asparaginowym) i
melaniny (produkt utlenienia polifenoli buraków). Intensywność zabarwienia zależy od pH i
temperatury soku w cukrowni. Ogólna ilość składników mineralnych wyrażona jest jako popiół
węglanowy i waha się w granicach od 7 do 11,5%. W skład jego wchodzą K 2CO3, Na2CO3 i
CaCO3 . Melasy zawierają lotne i nie lotne kwasy organiczne. Głównym kwasem nielotnym jest
kwas mlekowy, a ponadto występują kwas cytrynowy, szczawiooctowy, szczawiowy oraz
kwasy huminowe. W melasie występują także związki biologicznie czynne, a wśród nich
ani doprowadzenie do pH powyżej 3. Skutkiem mogłoby być ograniczenie aktywności
Aspergillus, a zatem mniejsza wydajność.
Przygotowanie pożywki polega na zmieszaniu odpowiednich ilości podanych
składników. Istotnym etapem jest sterylizacja. Wykonuje się ją w temperaturze 121
o
C przez 30minut. Obecność innych mikroorganizmów, (szczególnie z rodzaju Saccharomyces) znacznie
obniża wydajność.
WĘZEŁ II
W drugim węźle, przygotowywanym równocześnie z węzłem I przygotowuje się
inokulum. Szczepem wykorzystywanym do produkcji jest szczep Aspergillus niger C12.Szczepy wyizolowane z naturalnego środowiska charakteryzują się najczęściej małą zdolnością
wytwarzania kwasu cytrynowego. Otrzymanie wysoko produktywnych szczepów jest możliwe
dzięki wieloetapowej mutacji, skriningu, a także metod inżynierii genetycznej. Szczepy
aktywnie syntetyzujące kwas cytrynowy w procesie hodowli wgłębnej, w pożywce
syntetycznej z sacharozą (cukrem białym, handlowym), nie mogą być stosowane w metodzie
powierzchniowej (LFS) na pożywce melasowej. Zbyt wysoka zawartość związków
mineralnych, aminokwasów i innych stymulatorów wzrostu w melasie powoduje nadmierna
produkcję biomasy grzybni, przy równocześnie osłabionej syntezie kwasu cytrynowego.
Szczepy przemysłowe wymagają właściwych metod przechowywania zapewniających
stabilność cech. Do powszechnie przyjętych dla Aspergillus niger należy liofilizacja bądź
przechowywanie suchych konidiów w temperaturze 4 oC, w mieszaninie ze sterylnym
piaskiem, węglem aktywnym bądź cytrynianem wapnia.
Rys. 3 Schemat węzła II
Szczepy do wgłębnego procesu biosyntezy kwasu cytrynowego w pożywkach syntetycznych
powinny być hodowane na agarze ziemniaczano-glukozowym o wartości pH 6,0-7,0, co
indukuje w konidiach aktywność podstawowych enzymów glikolizy.
Szczep zastosowany w technologii produkcji kwasu cytrynowego pochodzi z Kolekcji Czystych
Kultur Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno- Spożywczego w Warszawie.
Jako podłoże do wytworzenia szczepionki stosuje się podstawowe podłoże hodowlane o
składzie podanym w tabeli 4. W celu przygotowania inokulum, do kolb płaskodennych o
pojemności 750 cm3 wprowadza się 100 cm3 podstawowego podłoża i sterylizuje się wtemperaturze 121oC przez 30 minut. Po ochłodzeniu, wprowadza się konidia Aspergillus niger .
Po godzinnym wstrząsaniu oznacza się stężenia konidiów. Tak przygotowane zawiesiny
inkubuje się w temperaturze pokojowej około 6 godzin. Wymagane jest wstrząsanie co pewien
czas. W tym czasie następuje pęcznienie konidiów, którymi następnie szczepi się hodowle [1].
Stężenie konidiów w hodowli to 105/cm3. Dlatego też, pożywkę inokulacyjną po ocenie ilości,
rozcieńcza się płynem fizjologicznym, albo dokonuje się przeszczepienia na skosy
ziemniaczane i namnożenia grzybów do wymaganego stężenia konidiów.
W produkcji kwasu cytrynowego zastosowane zostały tradycyjne fermentory
zbiornikowe z mieszadłem o poj. 12,5 m3. Bioreaktory te zostały wykonane ze stali
kwasoodpornej oraz zostały wyposażone w oprzyrządowanie pomiarowe
Rys. 5 Schemat bioreaktora z mieszadłem mechanicznym do hodowli wgłębnej, wykonanego
ze stali nierdzewnej
Proces hodowli okresowej wgłębnej przebiega następująco. Do czystego bioreaktora
wprowadzane jest 1,2∙104 kg podstawowego podłoża hodowlanego. Kolejno zamykane są
wszystkie otwory i króćce, tak aby powietrze nie dostawało się do środka. Na króćcach, które
doprowadzają powietrze i odprowadzają gazy pofermentacyjne umieszczone są filtrymembranowe, które służą do wyjaławiania powietrza. Jeśli bioreaktor jest szczelnie zamknięty,
to należy poddać go sterylizacji w temperaturze 121 ºC przez 30 minut. Jednocześnie poddany
sterylizacji zostaje środek przeciwpianowy, podłoża zasilające oraz węże do pomp i inny sprzęt.
Następnie po sterylizacji włączane jest mieszanie, napowietrzanie oraz chłodzenie. W wyniku
przeprowadzonych zabiegów dochodzi do obniżenia temperatury do około 32 ºC, kontrola
temperatury jest możliwa dzięki zamontowanej elektrodzie pomiarowej, która wcześniej została
wyjałowiona z użyciem 70% wodnego roztworu alkoholu etylowego. Później następujeuruchomienie i kalibrowanie aparatury pomiarowo-regulacyjnej, która służy do pomiarów oraz
Kolejnym krokiem jest umieszczenie danej objętości inokulum do podłoża w bioreaktorze, tak
aby dane inokulum zawierało 105/cm3 stężenia konidiów. Po tym pobierana jest próba zerowa i
właśnie ten moment traktowany jest jako początek hodowli.
Hodowla prowadzona w temperaturze 32 ºC, przy czym dochodzi do ciągłego mieszania oraz
napowietrzania. Jeżeli dojdzie do dużego spadku aktywności oddechowej grzybni oraz braku przyrostu kwasowości ogólnej to świadczy to o doprowadzeniu hodowli do końca. Czas trwania
procesu biosyntezy, który liczony jest do chwili wyczerpania źródła węgla trwa od 120 do 180
godzin w temperaturze 30-32ºC, stosując kontrolowane napowietrzanie.
Z hodowli okresowych zostały pobrane na początku próby zerowe, czyli nastąpiło to zaraz po
wprowadzeniu inokulum do podłoża. Kolejne próby zostały pobrane po każdej czwartej dobie
hodowli. Objętość pobranych prób wynosiła 5 cm3.
Następnie próbki zostały poddane analizie laboratoryjnej. W próbie zerowej zostało oznaczone
pH, stężenie konidiów, stężenie sacharozy (S0). W próbach, które zostały pobrane w czasie
sacharozy (S), a także obserwacji poddana została morfologia grzybni. Gdy hodowla została
doprowadzona do końca zmierzona została końcowa objętość podłoża (Vk ), która znajdowała
się w kolbie, do której właśnie dodawano sumaryczną objętość prób pobranych w czasie
trwania hodowli (ΣV pr ). Dzięki temu uzyskano skorygowaną objętość końcową podłoża
hodowlanego (Vks), która posłuży w kolejnych obliczeniach końcowych wyników hodowli
okresowych. Dodatkowo produktem ubocznym była para wodna, która nie stanowi większych
problemów [1].
Tab. 5 Kształtowanie się podstawowych parametrów kinetycznych, które charakteryzują wzrost biomasy, zużywanie sacharozy i biosyntezę kwasu cytrynowego we wgłębnych hodowlach