JUSTIFICAREA ALEGERII TEMEI Deşi drojdiile au fost folosite din vremuri străvechi la prepararea alimentelor şi băuturilor, utilizarea lor în nutriţia umană sau pentru furajarea animalelor este de dată mult mai recentă. Deficitul de proteine din timpul primului război mondial a impulsionat cercetările pentru cultivarea drojdiilor în scopuri furajere. Microorganismele cele mai frecvent utilizate ca sursă de proteine în nutriţia omului şi animalelor sunt drojdiile. Datele experimentale atestă că proteina din drojdii poate înlocui proteinele vegetale şi animale tradiţionale. S-a constatat că drojdiile sunt capabile să sintetizeze vitaminele hidrosolubile din grupa B, dar şi să le înmagazineze în celulă în cantităţi la fel de mari sau chiar mai mari decât cele din ţesuturile animale recunoscute ca surse importante de vitamine. În condiţiile adâncirii crizei alimentare, fabricarea proteinelor de biosinteză reprezintă una dintre căile de perspectivă pentru asigurarea necesarului de proteine. Tehnologia obţinerii proteinelor de biosinteză 1
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
JUSTIFICAREA ALEGERII TEMEI
Deşi drojdiile au fost folosite din vremuri străvechi la prepararea alimentelor
şi băuturilor, utilizarea lor în nutriţia umană sau pentru furajarea animalelor este de
dată mult mai recentă. Deficitul de proteine din timpul primului război mondial a
impulsionat cercetările pentru cultivarea drojdiilor în scopuri furajere.
Microorganismele cele mai frecvent utilizate ca sursă de proteine în nutriţia
omului şi animalelor sunt drojdiile. Datele experimentale atestă că proteina din
drojdii poate înlocui proteinele vegetale şi animale tradiţionale. S-a constatat că
drojdiile sunt capabile să sintetizeze vitaminele hidrosolubile din grupa B, dar şi să le
înmagazineze în celulă în cantităţi la fel de mari sau chiar mai mari decât cele din
ţesuturile animale recunoscute ca surse importante de vitamine.
În condiţiile adâncirii crizei alimentare, fabricarea proteinelor de biosinteză
reprezintă una dintre căile de perspectivă pentru asigurarea necesarului de proteine.
Tehnologia obţinerii proteinelor de biosinteză prezintă următoarele avantaje:
- permite obţinerea de proteine cu valoare biologică ridicată din materii prime
disponibile în cantităţi mari, constituite în mare măsură din subproduse sau
deşeuri şi reziduuri industriale;
- oferă posibilitatea, în raport cu substratul folosit, obţinerii de proteine cu
randament mult mai mare în comparaţie cu cele de origine animală;
- prin utilizarea deşeurilor şi reziduurilor industriale se realizează şi o depoluare a
mediului.
Pentru utilizare in hrana Salmonidelor, drojdia trebuie sa fie producatoare de
astaxantina, compus carotenoidic care intensifica culoarea carnii acestor pesti.
Studiul intreprins a urmarit izolarea unei drojdii producatoare de astaxantina
si investigarea conditiilor de cultivare care sa permita obtinerea compusului
carotenoidic cu randament ridicat, astfel incat biomasa acestei drojdii sa se poata
utilize in alimentatia Salmonidelor.
1
CAPITOLUL I
MICROORGANISME IMPLICATE IN OBTINEREA DROJDIEI
FURAJERE
Microorganismele utilizate in procesul de multiplicare industriala a drojdiilor
trebuie sa indeplineasca o serie de conditii cum ar fi:
- timp de generatie cat mai scurt;
- randament de fabricatie si continut de proteine ridicat;
- vitalitate ridicata, mai ales in cazul multiplicarii continue;
- sensibilitate redusa la infectii, inhibitori si la variatiile calitative ale
mediului;
De obicei, tipurile de drojdii se aleg in functie de natura mediilor de cultura.
Data fiind marea viabilitate si adaptabilitate a drojdiilor la diversele conditii de
mediu, se pot cultiva cu rezultate bune diferite rase, tulpini, specii si chiar genuri de
drojdii sau ciuperci pe lesiile sulfitice reziduale si pe prehidrolizate.
Alte substraturi utilizate cu success la obtinerea drojdiilor furajere sunt
reprezentate de subproduse ale industriei alimentare: melasa, radicele da malt, ape de
inmuiere a porumbului (extract de porumb).
Dintre tulpinile de drojdii folosite in practica pentru formarea de biomasa, se
pot mentiona urmatoarele:
- Torula utilis (Candida utilis) este cea mai folosita la fabricarea drojdiei
furajere. Ea asimileaza diferite glucide (hexoze, pentoze) alcool etilic, alcooli
superiori, aldehide, glicerina si acizi organici.
- Micotorula se dezvlota bine pe medii de cultura care contin cantitati mari de
pentoze.
- Candida tropicalis se multiplica intens pe borhotul rezultat de la fabricarea
alcoolului. Ea asimileaza mult mai bine xiloza in comparatie cu Torula utilis.
De obicei, in linurile de multiplicare a drojdiei se gaseste un amestec de
Torula utilis si Candida tropicalis, chiar si atunci cand initial s-a efectuat numai
2
inocularea cu Torula utilis. Astfel la cultivarea drojdiei Torula utilis prin procedeul
continuu pe borhot de melasa, pot apare in scurt timp si alte drojdii printre care si
Candida mycoderma, a carei proportie poate creste pana la 90%. Aceste contaminari
nu sunt periculoase in masura in care nu conduc la micsorarea randamentului si a
continutului in proteine a produsului finit.
In fabricile de drojdie furajera se folosesc de obicei pentru inoculare
amestecuri de 3-4 tulpini de drojdii (Torula utilis, Candida tropicalis, Candida
lypolitica), proportia dintre ele modificandu-se esential in timpul fabricatiei.
La fabricarea drojdiilor furajere se pot utilize si amestecuri de
microorganisme din diferite genuri: genul Candida, genul Trichosporon, genul
Torulopsis etc.
- Candida tropicalis realizeaza o productivitate mica, desi utilizeaza in
proportie insemnata zaharurile din solutie (75-80%), pe care le consuma specific,
sintetizand cantitati mari de acid glutamic si tirozina. Amestecurile de Candida
tropicalis, Candida arboreea si T. utilis multiplicate in comun, se plaseaza sub
aspectul epuizarii zaharurilor in zona valorilor satisfacatoare (78%), reprezentand in
acelasi timp o compozitie aminoproteica de buna calitate.
- Candida scottii se prezinta, din punct de vedere morfologic, sub forma de
celule oval elipsoidale dispuse sub forma de lant, cate 5-7-12 celule cu inmugurire
multipolara. Coloniile dezvoltate pe agar de bere sunt de culoare alb-crem, cu
suprafata marunt ridata, cu granulatie fina. Aceste drojdii asimileaza bine atat
hexozele cat si pentozele, precum si acizii organici si uronici. Avand un mare
randament in biomasa si continut ridicat de proteine drojdia Candida scottii poate fi
introdusa in fabricatie industriala atat sub forma de cultura pura cat si sub forma de
cultura mixta, in combinatie cu celelate specii de drojdie Candida.
- Trichosporon cutaneum are o viteza de crestere comparativ redusa cu
celelalte tipuri de drojdii, insa asigura o asimilare mai profunda a substantelor
organice, in particular a acizilor organici.
- Candida mycoderma face parte din microflora epifita a fructelor si a unor
legume, in cazuri rare se intalneste in microflora semintelor oleaginoase si cerealiere.
3
Asimileaza glucoza, zaharoza, maltoza, lactoza si poate utiliza etanolul ca unica sursa
hidrocarbonata. Formeaza glucoza, fructoza, zaharoza. Nu formeaza rafinoza. Poate
consuma CH3COOH din mediu simultan cu etanolul si are sulfitorezistenta redusa.
Temperatura propice de inmultire este de: minim 6-16ºC, maxim 24-36ºC, iar cea de
crestere optima este de 18-22ºC. Coloniile pe mediu solidificat prezinta un perimetru
slab-lobat, neregulat cu diameter cuprinse intre 2,5-5,8mm. Suprafata coloniei are un
aspect mat, cutat, de culaoare alb-cenusiu sau alb-crem. In mediu lichid formeaza un
voal alb (pelicula) subtire, la suprafata mediilor slab-alcoolice. In timp voalul se
destrama si se depune in sediment pulverulent.
Rhodotorula glutinis formeaza pe MEA, dupa 3 zile de cultivare, colonii cu
diametrul de 1,5-3mm, convexe, cu perimetru circular, cu suprafata lucioasa sau
aspect mucos, de culaore rosu pastelat. Dupa 7 zile, coloniile ajung la diametrul de 5-
10mm dar isi mentin caracterele morfologice. Celulele dezvoltate pe MEA timp de 3
zile au forma elipsoidala si dimensiuni medii de 4-5,5µm reproducerea are loc prin
imugurire pe intreaga suprafata. Unele tulpini pot forma celule alungite.
Se pot dezvolta pe mediul Czapek, cand formeaza celule cu dimensiuni de
2,3-5µm sau 12-16µm si pseudomiceliu. Poate deci folosi azotati ca sursa de azot. Nu
se dezvolta pe MEA cu 0.5% acid acetic. Se dezvolta in domeniul de temperaturi de
la 25ºC la 35ºC in produse cu aw minim de la 0,92. Cresterea este oprita in medii cu
pH 2,2 sau in prezenta de conservanti. Acidul benzoic sau acidul sorbic ii inhiba
cresterea la concentratii mai mici de 100mg/kgsi pH4. Sunt drojdii termorezistente.
Sunt inactivate prin incalzire la 62,5ºC timp de 10 min. Asimileaza glucoza,
galactoza, zaharoza, maltoza, xiloza, celobioza, alcoolul etilic, glicerolul si acizi
organici (lactic, succinic si citric). Rhodotorula glutinis, ca si Rhodotorula rubra, este
larg raspandita pe suprafata fructelor si legumelor proaspat recoltate dar produce rar
alterari ale acestora. Se intalneste in microbiota epifita a frunzelor si tulpinilor, a
boabelor de cereale, a maslinilor. Poate produce alterari ale sucurilor de mere si
capsuni insuficient pasteurizate.
4
Fig. 1. Drojdii utilizate ca drojdii furajere
a - Rhodotorula glutinis; b - Trichosporon cutaneum; c - Candida tropicalis
5
CAPITOLUL II
MATERIALE SI METODE UTILIZATE IN EXPERIMENTARILE
DE OBTINERE A DROJDIEI FURAJERE
2.1. MATERIALE
2.1.1. Microorganisme utilizate in scopul produceri de drojdii furajere
pentru salmonide
Phaffia rhodozyma tulpina izolata de pe mere.
6
2.1.2. Medii de cultura
Compozitia mediilor de cultura si scopul in care acestea au fost folosite in
experimentari sunt prezentate in tabelul 1.
Tabel 1. Medii de cultura utilizate in cadrul experimentelor de laborator
Extractul de porumb prezinta aminoacizi ce au rol de biostimulatori si
vitamine, dintre care biotina este prezenta in cantitati apreciabile(150 – 200 mg/100g
produs)
Extractul de porumb este folosit la fabricarea drojdiei de panificaţie cu un consum de 60 kg/t melasă, poate creşte productivitatea cu 4÷6%, în schimb prezintă inconvenientul că este un produs deficitar şi este folosit preponderent în industria antibioticelor. Se constată de asemenea că proteinele din extract pot lega biotina într-o formă inaccesibilă pentru celula de drojdie.
Extractele de drojdie sunt folosite în principal ca potenţiatori de arome sau
chiar arome. Alte autolizate de drojdie pot masca gustul amar sau acru, pot mări
gradul de aromă şi pot servi ca agenţi de colorare sau antioxidanţi.
2.2. METODE UTILIZATE IN EXPERIMENTARI
9
2.2.1. Metode de izolare
Metodele prin raspandire sunt larg raspandite deoarece sunt usor de executat,
avand ca principiul raspandirea celulelor aflate in populatii eterogene in medii
naturale, prin diluare in medii lichide sau raspandire pe suprafata mediilor sterile
solidificate.
Metoda Koch se bazeaza pe raspandirea microorganismelor recoltate din
medii naturale intr-un mediu nutritiv si fixarea distantata a celulelor in urma
solidificarii mediului cu formare prin multiplicare de colonii izolate intre ele.
Metoda este folosita in special pentru izolarea culturilor pure de drojdii. Mediul de
raspandire este mustul de malt cu gelatina, repartizat cate 20 cm³ in 3 eprubete,
fluidificat si mentinut la 35-40ºC. Din proba aleasa pentru izolare se recolteaza
celulele cu ajutorul unei anse, care apoi este trecuta succesiv in cele 3 eprubete. Dupa
inoculare si uniformizare, continutul fiecarei eprubete se repartizeaza in cate o placa
Petri, iar prin solidificarea mediului celulele care raman fixate in gel vor forma prin
multiplicare colonii izolate.
In functie de densitatea celulelor
recoltate initial, in placa a 2-a sau a 3-a
pot exista colonii izolate, iar dupa
studiul caracterelor microscopice ale
coloniilor reprezentative se face
repicarea in ebrubete cu slant agar,
obtinandu-se culturi pure.
Fig. 3.
10
Metoda in strii se aplica in cazul contaminarii cu microorganisme straine a
culturilor pure in timpul conservarii acestora. Este similara cu metoda scarificata, in
schimb drept mediu de raspandire se foloseste mediul inclinat din 2-3 eprubete, in care se
realizeaza transferul succesiv de celule, prin trasarea de striuri la suprafata mediului
2.2.2 Metode de numararea celulelor
Stabilirea numarului de celule de drojdii dintr-un produs sau cultura pura se
realizeaza prin diferite tehnici :
-numararea directa a celulelor de drojdii;
-numararea indirecta (metoda culturala-Koch);
Celulele de drojdii si sporii de mucegai se pot numara, prin examen microscopic
direct, cu ajutorul citometrelor ( camerelor de numarat ).
Un citometru este o lama de sticla groasa, prevazuta cu 3 platforme separate intre ele
prin rigole in sticla. Platforma centrala este denivelata fata de celelalte doua cu o inaltime
de 0,1- 0,2 mm (inscrisa pe fiecare camera ). Pe platforma centrala este gravata o retea de
linii perpendiculare, care delimiteaza o anumita suprafata divizata de catre linii
perpendiculare in microcelule de forma patratica (patratele elementare ).
Se cunosc mai multe tipuri de citometre: Thoma, Türk, Bürker, Rosenthal,
construite pe acelasi principiu. Diferentierea dintre tipurile de citometre consta in
marimea variabila a suprafetei unui patratel elementar.
Citometrul Thoma are suprafata de 1mm² divizata de catre linii in 400 de
patratele elementare cu latura de 1/20 mm ( suprafata unui patratel elementar = 1/400
mm³ ). Pentru numarare se plaseaza o picatura din suspensia de celule de analizat pe
platforma centrala, in dreptul suprafetei delimitate. Peste suspensie se plaseaza o lamela
care se sprijina pe cele doua platforme laterale si astfel intre lamela si citometru se
creeaza o pelicula de lichid cu inaltime egala cu denivelarea platformei centrale ( 0,1
mm ). Astfel, volumul de lichid plasat pe fiecare patratel elementar este .
Preparatul obtinut se studiaza la microscop cu obiectiv cu grosisment x 40, cand in
campul microscopic poate fi vizualizat un grup de 16 patratele elementare, din care se
numara celulele a caror suprafata se afla mai mult de jumatate in interiorul careului de
4x4 patratele elementare. Se fac numarari de celule din mai multe
campuri microscopice ( ) si se calculeaza numarul mediu de celule pe un
patratel elementar ( ).
Numarul de celule prezente intr-un cm³ de suspensie de analizat se determina cu
formula:
N= n · 4 ·
In care: n- numarul mediu de celule pe un patratel elementar;
k- coefficient de dilutie;
Fig. 4. Profilul si reteaua citometrului Thoma
2.2.3. Metode de selectionare a drojdiei producatoare de pigmenti
carotenoidici
Metodele de selectie a microorganismelor in general , in cazul nostru al drojdiilor
urmeaza niste etape prestabilite:
A. Izolarea care presupune parcurgerea mai multor etape:
1.Recoltarea probelor biologice presupune recoltarea unor mostre in cantitati
mici din care sa se izoleze drojdiile cautate.
Probele biologice pot consta in resturi alimentare, resturi vegetale, medii specifice (apa
de mare, saramura, nisip, plante acvatice, fructe, etc).
La stabilirea sursei de izolare se au in vedere urmatoarele criterii:
a)o asociere intre microorganism si substrat (amidon-tarate, faina, paine,
suprafata fructelor etc);
b)densitatea microorganismului in mediul din care se face izolarea;
c)variatia densitatii celulelor in functie de conditiile de mediu (pentru a crea acest
fenomen numarul de tulpini izolate in aceasta etapa trebuie sa fie de ordinul sutelor si de
obicei mai mult de 500).
Pentru a facilita izolarea de tulpini variate se aplica metode selective de izolare.
Aceste metode se bazeaza pe prop biologice si de termorezistenta a sporilor. Tulpinile
izolate nu au identitate si poarta denum de izolat. Fiecare tulpina izolata se pastreaza in 2
exemplare si pentru a evita degenerarea acestora se pastreaza in stare liofilizata.
2.Controlul puritatii culturii care se realizeaza prin examen macroscopic si
microscopic si se studiaza caracterele culturale prin cultivare pe medii specifice cu agar
rezultand colonii la care se urmaresc caracterele macroscopice:
- pigmentatia,
- aspectul,
- diametrul coloniei
si caracterele microscopice:
- forma
- dimensiunea celulelor,
- prezenta sporilor,
- unele particularitati privind reproducerea, etc
In urma acestui studiu fiecare tulpina este asociata unei specii si unui gen. Lucrul acesta
poate sa ofere date privind puritatea izolatelor si stabilitatea genetica.
B. Selectia propriu-zisa (screening-ul) urmareste identificarea tulpinilor
active, care corespund cerintelor noastre. Prin selectie se elimina din competitie tulpinile
inactive si slab active si se evidentiaza tulpinile inalt active. Selectia se realiz in 2 etape:
1.Preselectia (selectia calitativa) se aplica tuturor tulpinilor izolate si urmareste
eliminarea tulpinilor inactive. De obicei se aplica cultivarea in placi Petri pe medii de
cultura cu agar iar drept criterii de selectie se utilizeaza urmatoarele:
-dezvoltarea coloniala exprimata prin diametrul coloniei, acesta se exprima in mm
sau viteza de dezvoltare coloniala care se masoara in mm/h;
-consumul de substrat se exprima semicantitativ printr-un raport consum/ colonie;
.2.Selectia cantitativa se aplica tulpinilor selectionate in etapa anterioara iar drept
criteriu de selectie este randam de biosinteza.
Daca este vorba de un compus extracelular randamentul se masoara in g/dm3
mediu de cultura.
Daca ne referim la o enzima – UA/dm3 mediu de cultura.
Daca ne referim la compusi mintracelulari unitatea de masura este g/g s.u.
biomasa. Si cantitatea de enzime intracelulare se masoara deasemeni in UA/g s.u
biomasa.
In aceasta etapa cultivarea se realizeaza pe mediu lichid in culturi pe agitator sau
in bioreactoare de mica capacit aceasta insemnand de la 1-3 litri. In urma selectiei se
mentin in competitie 1-5 tulpini inalt active.
In urma selectiei tulpinii de drojdie, am observat urmatoarele: