PROGRAMA MITOGÊNICO DESENCADEADO PROGRAMA MITOGÊNICO DESENCADEADO DURANTE A INFECÇÃO CELULAR PELO DURANTE A INFECÇÃO CELULAR PELO VÍRUS VACCÍCIA VÍRUS VACCÍCIA Laboratório de Vírus Departamento de Microbiologia Instituto de Ciências Biológicas Universidade Federal de Minas Gerais Grupo de Transdução de Sinal Orientador: Cláudio Antônio Bonjardim Linha de Pesquisa
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PROGRAMA MITOGÊNICO DESENCADEADO DURANTE A INFECÇÃO CELULAR PELO VÍRUS VACCÍCIA Laboratório de Vírus Departamento de Microbiologia Instituto de Ciências.
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PROGRAMA MITOGÊNICO PROGRAMA MITOGÊNICO DESENCADEADO DURANTE A DESENCADEADO DURANTE A
INFECÇÃO CELULAR PELO VÍRUS INFECÇÃO CELULAR PELO VÍRUS VACCÍCIAVACCÍCIA
Laboratório de Vírus Departamento de Microbiologia Instituto de Ciências Biológicas
Universidade Federal de Minas Gerais
Grupo de Transdução de SinalOrientador: Cláudio Antônio Bonjardim
Linha de Pesquisa
INTRODUÇÃOINTRODUÇÃO
VíruVíruss
Agentes infecciosos
Constituídos basicamente de uma cápsula protéica que guarda o material genético – RNA ou DNA.
Parasitas intracelulares obrigatórios
Extremamente dependentes de toda maquinaria energética e biossintética de seus hospedeiros
Pertencente à mesma família do vírus causador da varíola
Utilizado para imunização contra a varíola (1967 – 1977)
Atualmente – vírus de laboratório
Década de 80 – grande interesse pelo VV como ferramenta de estudos em biologia molecular
Recentemente, verificou-se a emergência de zoonoses causadas pelo vírus vaccínia-like.
Erradicação da doença no mundo
Vírus VaccíniaVírus Vaccínia
Família: Poxviridae
Subfamília: Chordopoxvirinae
Gênero: Orthopoxvirus
Características:
Complexos vírus envelopados que medem em torno de 300 nm;
Genoma – DNA fita dupla linear;
Ciclo replicativo citoplasmático.
2 tipos de partículas infectivas: - IMV: 90% da progênie viral - EEV: principais formas de disseminação do VV
Genoma do Vírus VaccíniaGenoma do Vírus Vaccínia
Genes ConservadosITRs ITRs
191 Kpb / 263 genes
Genes essenciais – polipeptídeos estruturais e enzimas envolvidas no
metabolismo da DNA
Variáveis - Genes não-essenciais – interação com o
hospedeiro e virulência
Núcleo
Replicação doDNA
Transcrição de genes tardios
Desnudamentosecundário
Desnudamentoprimário
Ciclo de MultiplicaçãoCiclo de Multiplicação
VírionIMV
EEVIEV Morfogênese
IMV
Transcrição de genes imediatamente
precoces
Transcrição de genes imediatamente
precoces
Transcrição de genes
precoces
Poxvírus e Poxvírus e MitogêneseMitogênese
Fator de Crescimento do VV - VGF
Similaridades estruturais e funcionais ao EGF e TGF- ;
Liberado no sobrenadante das células infectadas;
Estimula o crescimento e/ou a atividade metabólica de células não infectadas adjacentes, favorecendo a expansão da infecção;
A atividade mitogênica de VGF é considerada benéfica para a replicação do VV.
Citoplasma
Núcleo
EGR-1
c - fos
MEK
ERK 1/2
Magalhães et al, 2001Elk-1
MEK
ERK 1/2
RSK 2A
ndra
de e
t al, 2
00
4
Citoplasma
Núcleo
EGR-1
Andra
de e
t al, 2
00
4
TyK
MEK
ERK
RSK-2
Elk-1
STK
?
?
?
c-jun
JNK
CREB/ATF-1
?
?
TESE DE DOUTORADO
Significado Funcional do Gene de Resposta Precoce ao Crescimento Significado Funcional do Gene de Resposta Precoce ao Crescimento – EGR-1 – para a Biologia do Orthopoxvirus Vaccinia– EGR-1 – para a Biologia do Orthopoxvirus Vaccinia
ENVOLVIMENTO DA PROTEÍNA ENVOLVIMENTO DA PROTEÍNA QUINASE - PAK1 - DURANTE A QUINASE - PAK1 - DURANTE A
INFECÇÃO CELULAR PELO VÍRUS INFECÇÃO CELULAR PELO VÍRUS VACCÍNIAVACCÍNIA
Luciana Garcia AndradeLuciana Garcia Andrade
Projeto de Pesquisa
GDP
PAK-1PAK-1
PAK-1 PAK-1 (p21-activated kinase - 1)
GTPRac / Cdc42
Serina-treonina kinase
Dinâmica do Citoesqueleto /
Motilidade Celular Proliferação/Sobrevivência
(MEK/ERK)
Pro-inflamatórios/Estresse
(JNK/SAPK)
PAK-1 PAK-1 (p21-activated kinase - 1)
Domínio Catalítico(aa 255 – 529)
PDB AI
Nck Grb2Rac
Cdc42
G
Domínio Autoinibitório
OBJETIVOSOBJETIVOS
GeralGeral
Analisar a contribuição da serina/treonina quinase PAK1 (p21- activated kinase) na
transmissão dos sinais mitogênicos desencadeados após a infecção de células
de fibroblasto murino A31 pelo vírus vaccínia.
EspecíficosEspecíficos
Gerar clones expressando de maneira estável mutação que confere dominância negativa para a proteína PAK-1;
Verificar se a infecção pelo VV induz a fosforilação de PAK-1, bem como sua cinética de ativação;
Verificar o significado funcional de PAK-1 na multiplicação do vírus vaccínia.
Materiais e Materiais e MétodosMétodos
Células:Células A31 – clone de Balb/3T3
- Obtenção dos clones de PAK-1- Infecção / Expressão protéica
Células VERO - Produção do estoque do VV- Titulação viral
Vírus:Vírus Vaccínia WR (Western Reserve)
- Purificados /Titulados
Vetores:
pcMV6m – WT PAK1
PAK1-WTBam HI
Eco RI
Amp
pcMV6m – DN PAK1
PAK1- K299
RBam HI
Eco RI
Amp
PAK – K299R
Dominante Negativo para PAK-1
Sub-clonagem:
PAK1 – WT KPAK1 – DN R
pcMV6m – WT -PAK1
PAK1-WTBam HI
Eco RI
Amp
pcMV6m – PAK1 – K299R
PAK1- K299
RBam HI
Eco RI
Amp
Transformação bacteriana:
E. coli – DH5
Transformação
LB Agar + AMP
LB Agar + AMP
Amplificação de cópias do plasmídio
LB + AMP
PurificaçãoPequena-escala
Média-escala
Eletroforese em gel de agarose
Purificação do Plasmídio
Transfecção de células A31
pcDNA 3– PAK-WT ou
pcDNA 3– PAK –K299R
Transfecção:
Células A31Células A31
Transfecção
G418
Seleção dos clones
resistentes
Caracterização dos clones resistentes
Células A31 ou ClonesCélulas A31 ou Clones
Carenciadas com 1% de SFB por 12 horas
Infectadas com o VV (MOI de 10,0) por tempos variáveis
Estratégia de TrabalhoEstratégia de Trabalho
Extração de proteínas totais
“Western blot”
Extração de mRNA total
“Northern blot”
Vírus
Titulação
Análise de Multiplicação
Viral
Fenótipo de Placa de Lise
Viral
Reação com o anticorpo primário
Transferência de “Western”
+
-
+-
Bloqueio
Reação com o anticorpo secundário conjugado com peroxidase
Filme Raio-X
Sistema Revelador
Revelação
Exposição
Pré hibridação
Hibridação com sonda marcada
Revelação
Lavagem
+
- Exposição
Transferência de “Northern”
P-JNK
1 3 4 5 6 7 8 9 102
KDa
4654
M VV M VV M VV M VV M VV
A31 NT WT 6 WT 7 WT 8 WT 9
KDa
46
54
1 3 4 5 62 7 8 9 10
P-JNK Mock VV Mock VV Mock VV Mock VV Mock VV
A31 NT DN 1 DN 5 DN 6 DN 10
Teste – caracterização dos clones Teste – caracterização dos clones de PAK-1 de PAK-1
Acumulação de EGR-1 induzida pelo VVAcumulação de EGR-1 induzida pelo VV
1 2 3 6 12 24 36 48 1 2 3 6 12 24 30 36 48
MOCK VV (WR) (m.o.i. 3,0)
Egr-1
Tempo (hpi)
ERK-1ERK-2
KDa
80
4442
1 2 3 4 5 6 7 8 10 11 12 13 14 15 16 17 18
VV (WR) (m.o.i. 3,0)
- 10 20 50 100C SFB
1 2 3 4 5 6 7
18S rRNA
egr-1
H7 (M)
Co-participação de diversas vias sinalizadoras Co-participação de diversas vias sinalizadoras associadas com a indução de EGR-1 após associadas com a indução de EGR-1 após
infecção pelo VV infecção pelo VV
MOCK EG
F
VV WR
MEK-DN 3
Egr-1
KDa
80
4442
1 2 3 4 5 6 7
ERK-1ERK-2
8 9 10 11 12 13 14
3 6 12 3 6 12 ½ 3 6 12 3 6 12 ½MOCK E
GF
VV WR
MEK-WT 11
Tempo (horas)
MEK – ERK – EGR-1MEK – ERK – EGR-1
MEK-DN 3MEK-WT10
VV 48 hpi
Controle
MEK/ERK 1/2 é necessária à multiplicação do VVMEK/ERK 1/2 é necessária à multiplicação do VV(Fenótipo da Placa de Lise Viral)
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
6 12 24 48
Horas pós-infecção
Tít
ulo
Vir
al (
Lo
g)
MEK-WT10
MEK-DN3
MEK/ERK 1/2 é necessária à multiplicação do VVMEK/ERK 1/2 é necessária à multiplicação do VV(Análise da Multiplicação Viral)