UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y PECUARIAS ESCUELA DE CIENCIAS VETERINARIAS “EFECTO DEL BLOQUEO DE RECEPTORES BETA ADRENÉRGICOS EN LA POTENCIACIÓN SINÁPTICA INDUCIDA EN LA CORTEZA OCCIPITAL DE LA RATA ADULTA POR ESTIMULACIÓN DE FIBRAS CALLOSALES” OSVALDO ANDRES FLORES BASTIAS. Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. Departamento de Ciencias Biológicas Animales. PROFESOR GUIA: DR. ALEJANDRO HERNANDEZ KUNSTMANN. SANTIAGO, CHILE 2004
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UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y PECUARIAS ESCUELA DE CIENCIAS VETERINARIAS
“EFECTO DEL BLOQUEO DE RECEPTORES BETA ADRENÉRGICOS EN LA POTENCIACIÓN SINÁPTICA INDUCIDA EN LA CORTEZA OCCIPITAL DE LA
RATA ADULTA POR ESTIMULACIÓN DE FIBRAS CALLOSALES”
OSVALDO ANDRES FLORES BASTIAS.
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. Departamento de Ciencias Biológicas Animales.
PROFESOR GUIA: DR. ALEJANDRO HERNANDEZ KUNSTMANN.
SANTIAGO, CHILE 2004
UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y PECUARIAS ESCUELA DE CIENCIAS VETERINARIAS
“EFECTO DEL BLOQUEO DE RECEPTORES BETA ADRENÉRGICOS EN LA
POTENCIACIÓN SINÁPTICA INDUCIDA EN LA CORTEZA OCCIPITAL DE LA RATA ADULTA POR ESTIMULACIÓN DE FIBRAS CALLOSALES”
OSVALDO ANDRES FLORES BASTIAS
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. Departamento de Ciencias Biológicas Animales.
NOTA FINAL:………………
NOTA FIRMA
PROFESOR GUIA: DR. ALEJANDRO HERNANDEZ KUNSTMANN ………… …………
PROFESOR CONSEJERO: DR. RUBEN SOTO-MOYANO ………... ………....
PROFESOR CONSEJERO: DR. RICARDO OLIVARES PEREZ-MONTT ……….... ………...
SANTIAGO, CHILE 2004
INDICE
I. Introducción………………………………………………………………………………...1
II. Revisión Bibliográfica…………………………………………………………………….....3
1-. Memoria y aprendizaje...............................…………………………….............……...3
A partir de los trabajos de Bliss y Lomo (1973), la potenciación de largo plazo se ha
descrito en diferentes tipos de sinapsis. Ellos demostraron que un estímulo breve pero de
alta frecuencia sobre la vía perforante, entrada al giro dentado en el hipocampo, producía
un aumento duradero de los potenciales locales registrados extracelularmente en la región
CA3.
Dichos investigadores describieron el aumento de la eficiencia sináptica con la
estimulación eléctrica repetitiva. Así, aquellas sinapsis inicialmente débiles modifican su
arquitectura después de ser sometidas a estímulos de alta frecuencia, de tal forma que en
etapas subsiguientes transmiten los impulsos nerviosos en una forma más intensa. Dicho
fenómeno ha recibido el nombre de potenciación de largo plazo (LTP, siglas del inglés
Long Term Potentiation) y constituye un proceso compartido por toda la escala zoológica.
Esta propiedad sináptica se considera hoy como uno de los modelos más útiles de
plasticidad neuronal. En general, existe consenso en definir a la potenciación de largo plazo
como un incremento de larga duración en la eficacia sináptica, que puede ser inducida por
actividad sináptica repetitiva (Brown et al., 1988). Los mecanismos de transducción de
señales que conducen al desarrollo de la potenciación sináptica de largo plazo, han sido
descritos a nivel hipocampal por Malenka y Nicoll (1999) y en la corteza cerebral y otras
áreas del cerebro por Bennett (2000).
3.1. Mecanismo celular y molecular de la potenciación de largo plazo.
En estado basal, los canales iónicos de los receptores NMDA permanecen cerrados
y bloqueados por una molécula de magnesio y, para ser activados, debe ocurrir una
secuencia de fenómenos que se inicia con la despolarización neuronal dependiente de
otros receptores. El cambio de potencial eléctrico de la membrana hace que el magnesio
sea desplazado del sitio activo y así, las moléculas de glutamato procedentes de la terminal
presináptica estimulan al receptor NMDA y se abren los canales que permiten el ingreso
de calcio y sodio ( Kandel, 2001).
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Una vez dentro de la célula, el ión calcio actúa como segundo mensajero para la
activación de diversas enzimas tales como la proteína kinasa calcio/fosfolípido
dependiente (PKC), la proteína kinasa calcio/calmodulina dependiente (CaMKII) y una
tirosina kinasa calcio dependiente (TrK). El calcio también puede activar a la adenilciclasa,
enzima que cataliza la síntesis de AMPc, el que a su vez activa la proteína kinasa PKA.
Como resultado de la activación de estas diversas proteínas kinasas, se promueve la
fosforilación de numerosas proteínas intracelulares y algunas kinasas son translocadas al
interior de núcleo (Kandel, 2001). Una vez allí, modifican diversos sustratos, en particular
las moléculas de la familia de factores de transcripción CREB.
Existen dos variedades de tales factores: CREB2 que actúan como represor de la
transcripción y permanece activo en estado basal, y CREB1, con efecto estimulante y que
se encuentra inhibido en condiciones de reposo. Las kinasas bloquean la acción de CREB2
y activan el factor CREB1, lo que a su vez permite que los elementos de respuesta al AMP
cíclico promuevan la transcripción temprana de ciertos genes (Kandel , 2001).
Se ha comprobado que el oxido nítrico, un mediador que resulta de la activación de
CaMKII, se encuentra en neuronas de diversas zonas del encéfalo, como el hipocampo, y
que este mediador es fundamental para el desarrollo de potenciación de largo plazo.
En efecto, las drogas que bloquean a la enzima óxido nítrico sintasa, y por tanto la
formación de oxido nítrico, impiden el establecimiento de la potenciación de largo plazo
en rebanadas de hipocampo; de igual modo, la potenciación de largo plazo es bloqueada
por sustancias químicas que capturan el oxido nítrico presente en el fluido intersticial.
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Mecanismo de la potenciación de largo plazo.
1.Parte presináptica, 2.Vesículas glutamatérgicas, 3.Moléculas del neurotransmisor
glutamato, 4.Receptor metabotrópico, 5.Receptor a NMDA (canal de calcio), 6.Receptor no-
NMDA, 7.Retículo endoplásmico, 8.Sistema generador de 2º mensajero, 9.Espina dendrítica,
10.Canal de calcio regulado por voltaje, 11.Concentración de calcio en la espina dendrítica,
12.Quinasas dependientes de calcio, 13.Sistema de generación de mensajeros retrógrados
(NO,CO), 14. Terminal nervioso hipersecretor, 15.Frecuencia de potenciales de acción que
invaden el terminal (adaptado de www.uc.cl.)
Figura 1: Cuando se aumenta la intensidad del estímulo y la membrana sináptica es claramente despolarizada (condiciones de estimulación conducentes a potenciación de largo plazo) se anula el bloqueo del receptor NMDA que mantiene el ión magnesio. Esta situación permite mayor entrada de Na+ y de Ca+2 y salida de K+ por esos canales. El resultado neto de esos efectos es el aumento del Ca +2 en la parte dendrítica, lo cual activa a kinasas dependientes de Ca+2 como la proteína kinasa dependiente de Ca+2 y calmodulina y la proteína kinasa C. Una de esas kinasas, una isoforma de la proteína kinasa C, queda persistentemente activa. Así queda inducido el estado de potenciación de largo plazo, por despolarización, por entrada de Ca+2 y también por la activación por Ca+2 de la formación de segundos mensajeros retrógrados. En relación a este último factor se ha propuesto que al activarse la parte postsináptica, se generan en ella moléculas como el óxido nítrico o el monóxido de carbono los cuales fluyen a la parte presináptica, de ahí el nombre de mensajeros retrógrados. Estos mensajeros provocarían en la parte presináptica la activación de proteínas kinasas que mantendrían aumentada la liberación del neurotransmisor glutamato, estimulando y manteniendo la potenciación.
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4. Receptores, neurotransmisores que participan en la potenciación sináptica
de largo plazo.
Se ha comprobado que existen más de 50 sustancias químicas que funcionan como
transmisores sinápticos. Se describen dos grupos de estos neurotransmisores. Uno de estos
comprende los transmisores de molécula pequeña y acción rápida. El otro está integrado
por numerosos neuropéptidos cuya molécula es mucho mayor y su acción es mucho más
lenta (Guyton y Hall, 1997).
Los transmisores de moléculas pequeñas y acción rápida son los que originan la
mayoría de las respuestas inmediatas del sistema nervioso, como son la transmisión de las
señales sensoriales al cerebro y de las señales motoras a los músculos. Por otro lado, los
neuropéptidos, suelen producir efectos más prolongados, tales como cambios en el
número de iones y, posiblemente también, cambios a largo plazo en el número de sinapsis
y en el tamaño de éstas (Guyton y Hall, 1997).
Existen diversos elementos involucrados en la potenciación de largo plazo. Dentro
de estos destacan el receptor NMDA, los receptores no-NMDA, además de los receptores
-adrenérgicos, entre otros. Respecto a los neurotransmisores, se ha establecido que el
glutamato cumple un rol fundamental, aunque también la noradrenalina participa en este
fenómeno de plasticidad neuronal.
4.1. Receptores.
4.1.1 El receptor NMDA
Probablemente existen más estudios sobre los receptores de tipo NMDA que
sobre cualquier otro receptor en el sistema nervioso. La razón es que los receptores
NMDA, además de ser muy abundantes en el sistema nervioso, están implicados en
numerosas funciones cerebrales, tales como el aprendizaje y la memoria, en los
mecanismos de muerte neuronal, y en enfermedades como la epilepsia.
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El receptor NMDA pertenece a una de las tres familias receptores ionotrópicos
para glutamato, junto al receptor AMPA y al receptor de kainato.
Estos receptores fueron primero descritos por sus características farmacológicas y
posteriormente por su biología molecular (Meldrum, 2000). Estas tres clases de receptores
ionotrópicos para el glutamato son complejos macromoleculares que contienen tres
dominios transmembranales denominados M1, M3 y M4 y una porción reentrante en la
membrana, el dominio M2, que confiere las distintas selectividades iónicas del canal (Bigge,
1999).
En lo que respecta al receptor de NMDA, este puede ser considerado como una
estructura heteromérica con dos tipos de subunidad, la denominada subunidad NR1 y una
de cuatro subunidades NR2 (NR2-A-NR2D) (Seeburg , 1993). La estimulación de los
receptores de NMDA es responsable del incremento el calcio intracelular (Castillo, 2000).
Se ha demostrado que la presencia del receptor NMDA en el espacio sináptico es un
prerrequisito para la plasticidad cerebral; como se ha señalado anteriormente, el canal del
receptor NMDA no solamente es permeable a sodio y a potasio, también es permeable a
calcio y bloqueado por magnesio (Seeburg et al, 2001; Czuczwar, 2000).
A los receptores de NMDA se los relaciona además con la mediación de reflejos
polisinápticos que participan en el incremento progresivo de la excitabilidad neuronal por
estimulación nociceptiva repetitiva de las vías aferentes (fibras C), fenómeno conocido
como "wind-up", el cual probablemente media diferentes estados hiperalgésicos asociados
con la inflamación y la neuropatía periférica (Sundstrom et al,1997).
Los antagonistas de los receptores NMDA y los bloqueadores del canal de este
receptor muestran una serie de efectos opuestos a los de los agonistas, la mayoría de los
cuales son predecibles para los roles fisiológicos de los receptores de NMDA: alteraciones
del aprendizaje, ataxia, miorelajación y sedación; también han sido reportados efectos
psicomiméticos. Los moduladores de los receptores NMDA tienen un potencial
terapéutico en entidades como la drogo-dependencia, epilepsia, enfermedad de Parkinson,
accidentes vasculares cerebrales, dolor.
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Recientemente se ha hipotetizado una posible alteración en la maduración de los
receptores de NMDA, la cual conduciría a los síntomas sicóticos de la esquizofrenia (Trist,
2000; Ruppin, 2000).
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Receptor NMDA.
1.Membrana plasmática, 2.Canal iónico bloqueado por mg2+ en el sitio de bloqueo (4) , 3.Sitio de bloqueo por mg2+ , 4.Sitio de unión a compuestos alucinógenos, 5.Sitio de unión al Zu2+, 6.Sitio de unión a ligandos agonistas (glutamato) y/o a ligandos antagonistas (APV), 7.Sitios de glicosilación, 8.Sitios de unión a protones, 9.Sitios de unión a glicina, Sitios de unión a poliaminas, 10.Espacio extracelular, 11.Espacio intracelular, 12.Subunidad del complejo. 13.Glutamato (neurotransmisor), 14.Sitios de fosforilación, 15.Electrodo extracelular, 16.Electrodo Intracelular (adaptado de www.uc.cl).
FIG 2: El receptor NMDA es el más estudiado por la importancia funcional que ha demostrado tener. Contiene un canal iónico para el ión calcio (Ca +2); presenta, además del sitio de unión al glutamato, otros sitios donde se unen el ión zinc (Zn+2), barbitúricos, esteroides, drogas como las benzodiazepinas y otros compuestos. Normalmente, cuando la célula esta en reposo, este receptor-canal se encuentra bloqueado por la presencia del ión magnesio (Mg+2). Cuando la célula se despolariza, ese ión sale del canal, haciéndole permeable principalmente al calcio.
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4.1.2 Los receptores AMPA y Kainato.
Las subunidades del receptor de AMPA, son derivadas de una familia de 4 genes
denominados GLUR1-GLUR4 (Healy y Meador-Woodruff , 2000). Se ha demostrado que
los receptores de AMPA en las sinapsis glutamatérgicas median la transmisión de baja
frecuencia, y están implicados en la expresión de la potenciación de largo plazo y la
depresión de largo plazo, fenómenos celulares que están en la base de la formación de la
memoria (Bliss y Collingridge , 1993).
El estudio de los receptores de kainato ha sido complicado hasta el advenimiento
de nuevos agentes farmacológicos y la ayuda de técnicas de biología molecular que
permitieron demostrar su existencia. A pesar de estos avances, las propiedades de los
receptores de kainato continúan siendo poco conocidas (Huettner, 2001; Hume et al, 1991;
Genevieve et al, 1999). Por otra parte, los genes que codifican para el receptor de kainato
están expresados extensamente a través del sistema nervioso, incluyendo la corteza
cerebral, sistema límbico y cerebelo (Frerking y Nicoll , 2000). Hace algunos años se
propuso que los receptores de kainato pueden también ejercer efectos de carácter
metabotrópico, lo que a la luz del conocimiento sobre la fisiología molecular de los
receptores es algo sorprendente que abre un nuevo campo de investigación en el área, así
como también brinda nuevos caminos para la comprensión de las enfermedades
producidas por alteraciones de estos receptores, las cuales se han denominado canalopatías
(Rodriguez-Moreno y Lerma, 1998).
4.1.3 Metabotrópicos.
En adición a la activación de los receptores ionotrópicos, el glutamato también
actúa sobre receptores acoplados a proteína G modulando la producción de segundos
mensajeros intracelulares. Estos receptores metabotrópicos mediarían los efectos lentos
del glutamato (Frerking y Nicoll, 2000). Los estudios han revelado que existen al menos 8
subtipos de receptores metabotrópicos de glutamato, y estos a su vez han sido clasificados
en tres grupos distintos, basados en su homología de secuencia, farmacología y
acoplamiento a mecanismos de señalización intracelular.
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De esta manera, se puede señalar que el primer grupo esta integrado por el subtipo
mGluR1 y mGluR5, el cual activa a una fosfolipasa C, mientras que los miembros del
segundo (mGluR2 y GluR3) y tercer grupo (mGluR4, mGluR6, mGluR7 y mGluR8) están
acoplados negativamente a adenilciclasa; el receptor mGluR6 está también acoplado a la
activación de GMPc fosfodiesterasa .
Utilizando bloqueo farmacológico de los receptores metabotrópicos en diferentes
especies animales, se ha demostrado que estos juegan un papel vital para la inducción y el
mantenimiento de la potenciación de largo plazo, de modo que su bloqueo lleva a la
prevención de la inducción de potenciación de largo plazo y alteración del aprendizaje
(Holscher et al, 1999). Los receptores mGluR1 están localizados principalmente
postsinápticamente y sobre los límites de las densidades postsinápticas, desde donde
regulan la actividad de los receptores NMDA y AMPA, así como la excitabilidad de la
neurona postsináptica (Bessis et al, 2001).
4.1.4 Receptores -adrenérgicos.
Además de los receptores metabotrópicos para glutamato, existen otros receptores
que están ligados funcionalmente a un sistema de segundos mensajeros y que juegan un rol
importante en la potenciación de largo plazo y en los procesos de memoria. Por ejemplo,
el receptor -adrenérgico cuyo neurotransmisor es la noradrenalina, está asociado al
sistema proteína G-estimulante regulado por GDP (Guyton y Hall, 1997).
La activación de receptores -adrenérgicos en el área CA1 del hipocampo facilita in
vitro la potenciación de largo plazo en esta región; por el contrario, este efecto es obstruido
cuando se co-administra DL-propanolol. Comparadas con ratas controles, las tratadas con
DL-propranolol muestran un aprendizaje más lento en el laberinto de agua y una pobre
retención de memoria cuando la prueba se prolonga a 24 horas. Estos resultados sugieren
que los receptores -adrenérgicos en el área CA1 están involucrados en la plasticidad
sináptica de esta área y que ellos son importantes para el aprendizaje espacial (Jinzhao et al,
2003)
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Tanto la noradrenalina como la adrenalina actúan sobre los receptores y
adrenérgicos, pero el isoproterenol, un agonista sintético, actúa sólo sobre los receptores .
El antagonista del receptor -adrenérgico propanolol es esencialmente inactivo en los
receptores , mientras que el antagonista del receptor -adrenérgico fentolamina, es muy
débil en los receptores .
Entre los receptores -adrenérgicos, los 1 predominan en el corazón y en la
corteza cerebral, mientras que los receptores 2 predominan en pulmón y en cerebelo. Sin
embargo, en muchos casos los receptores 1 y 2-adrenérgicos coexisten en el mismo
tejido.
El cerebro contiene tanto receptores 1 como 2, a los que no se puede diferenciar
en virtud de sus funciones fisiológicas.
Se ha identificado un tercer tipo de receptor -adrenérgico, los receptores 3 en el
tejido adiposo marrón presente en roedores y en humanos neonatos. (Universidad
Autónoma de Madrid, 2000).
4.2 Neurotransmisores.
4.2.1 Glutamato.
Existen muchos mediadores químicos y transmisores involucrados en la
potenciación de largo plazo. Algunos se definen como excitatorios y otros como
inhibitorios, según sus características intrínsecas, el tipo de receptor activado y la dinámica
de transmisores participantes en eventos de transmisión de la potenciación de largo plazo.
Glutamato se considera como el principal neurotransmisor excitatorio del sistema
nervioso central y sus receptores están presente particularmente en el hipocampo y corteza
cerebral (Universidad Autónoma de Madrid, 2000).
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Glutamato es el mediador en la mayoría de las transmisiones sinápticas excitatorias
del cerebro, y como se señaló, está involucrado en procesos tan diversos como la epilepsia,
las lesiones cerebrales isquémicas y el aprendizaje, influyendo en el desarrollo de las
conexiones sinápticas normales del cerebro.
El glutamato y el aspartato son aminoácidos no esenciales que no pueden cruzar la
barrera hematoencefálica; por lo tanto, no son accesibles al cerebro mediante la
circulación. En lugar de esto, son sintetizados a partir de la glucosa y de una gran variedad
de otros precursores. Se han localizado las enzimas sintéticas y metabolitos para el
glutamato y el aspartato en los dos principales compartimentos del cerebro: las neuronas y
las células gliales.
Las vesículas sinápticas acumulan activamente glutamato a través de procesos
dependientes de ATP y de Mg2+. La actuación de estos aminoácidos se produce sobre los
diversos tipos de receptores de la membrana postsináptica, aunque la mayoría de los
receptores de glutamato son ionotrópicos; es decir, los lugares de enlace de los agonistas y
el canal iónico asociado se hallan incorporados dentro del mismo complejo
macromolecular. En estos receptores, el efecto de los agonistas es incrementar la
probabilidad de que el canal se abra.
Las propiedades del glutamato como neuroexcitador se describieron por primera
vez hace mas de 40 años (Hayashi, 1952), lo que posteriormente ha permitido estudiar las
relaciones existentes entre los fenómenos excitotóxicos del glutamato con los procesos de
ontogenia, aprendizaje y memoria, formación de redes neuronales durante el desarrollo,
epilepsia, enfermedades neurodegenerativas, y muerte celular (Cheung et al, 1998; Fletcher
y Kalloniatis 1997; Houzan et al, 1998; Lerma et al, 1997). Como ya se ha señalado, la
participación del glutamato es crucial para el funcionamiento del sistema nervioso, en
particular en la plasticidad neuronal.
El glutamato es almacenado en vesículas sinápticas y liberado en la terminal
presináptica por un mecanismo calcio-dependiente que implica la participación de los
canales de calcio dependientes de voltaje.
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La liberación del contenido de glutamato de una vesícula sináptica genera un
potencial excitador postsináptico que corresponde principalmente a la activación de
receptores de AMPA (Meldrum, 2000).
La transmisión glutamatérgica ha sido descrita en diversas regiones del sistema
nervioso, que incluyen: conexiones córtico-corticales ipsilaterales y contralaterales,
proyecciones corticales hacia la amígdala, tubérculo olfatorio, el putamen, núcleo caudado,
tálamo, colículos superior e inferior, área tegmental, sustancia nigra, núcleo rojo y médula
espinal, participando en la neurobiología hipocampal y en conexiones que incluyen al
cuerpo mamilar e hipotálamo, así como también en la corteza visual, retina y cerebelo
(Michaelis, 1998). Es importante señalar que las fibras callosales utilizan principalmente
glutamato como neurotransmisor excitatorio, el cual actúa a nivel de receptores AMPA,
Kainato y NMDA (Conti, 1988; Herrman, 1996)
Por otro lado, además de su acción en la escala de milisegundos, la activación de
los receptores de glutamato juega un importante papel en los cambios duraderos que
involucran al fenotipo neuronal y el desarrollo; los patrones de actividad sináptica
excitadora son requeridos para el control fino de las conexiones sinápticas y la generación
de mapas topográficos en las redes neuronales (Kalb y Fox 1997). Al respecto, se ha
puesto en evidencia que las sinapsis glutamatérgicas de la corteza visual son modificadas
por la experiencia sensorial (Nathaniel et al, 1999).
4.2.2 Noradrenalina.
La noradrenalina se biosintetiza en las terminaciones sinápticas a partir del
aminoácido tirosina por acción de la tirosina hidroxilasa, produciéndose la dopa, la cual
mediante la dopa descarboxilasa se convierte en dopamina, la primera de las catecolaminas.
La dopamina, por hidroxilación con la -hidroxi-dopamina se transforma en
noradrenalina, que es la segunda de las catecolaminas. Finalmente, en una pequeña
población de neuronas del tronco cerebral, la noradrenalina puede convertirse en
adrenalina, por una metilación inducida por la feniletanolamina N-metiltransferasa.
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El neurotransmisor noradrenalina está extensamente distribuido en el cerebro de
los mamíferos, dónde se piensa que juega un papel en los mecanismos de atención
selectiva y regulación de vigilancia (Aston-Jones et al, 1991). Noradrenalina también ha sido
implicada en la facilitación de procesos de memoria y en la formación de recuerdos a largo
plazo para los eventos emocionales (Cahill et al, 1994). Una hipótesis, es que la
noradrenalina liberada durante la excitación conductual facilitaría la inducción de cambios
a largo plazo en la transmisión sináptica excitadora que se piensa es crítica para el
almacenamiento de información (Katy, 1972). Más recientemente se ha señalado que la
noradrenalina central puede influenciar críticamente la memoria y el aprendizaje, sobre la
base que los niveles centrales de noradrenalina modulan poderosamente el funcionamiento
de la corteza frontal (Arnsten, 1998) y la potenciación de largo plazo cortical (Nowicky et
al, 1992; Kamatsu, 1996). Así, se ha descrito que la administración de noradrenalina post-
entrenamiento induce facilitación de la memoria, la que es atenuada por antagonistas de
receptores adrenérgicos (Sternberg et al, 1986). Se ha visto que la administración de
noradrenalina exógena intracraneal, inmediatamente después de un entrenamiento, resulta
en la consolidación de la memoria desde un estado lábil a uno permanente, efecto que es
inhibido por antagonistas -adrenérgicos (Gibbs, 1991; Crowe et al, 1990).
La aplicación de noradrenalina en rebanadas de corteza cerebral de humanos y
ratas aumenta la respuesta excitatoria evocada por glutamato o por NMDA (Radisavljevic
et al, 1994). De igual manera la administración de noradrenalina en cortes de hipocampo de
rata adulta, incrementa significativamente la potenciación de largo plazo, indicando que
este neurotransmisor es un importante cofactor para promover plasticidad sináptica en el
sistema nervioso central adulto (Bramhan, et al, 1997; Hopkins y Johnston, 1988).
Estos efectos de la noradrenalina en la potenciación de largo plazo, críticos para el
establecimiento de procesos de memoria, se ejercerían vía receptores -adrenérgicos ya
que son revertidos por antagonistas de estos receptores (Bramhan, et al, 1997; Radisavljevic
et al, 1994).
Existen diversos subtipos de receptores adrenérgicos del tipo y ; estos ya han
sido identificados y clonados: 1a, 1b, 1d, 2a, 2b, 2c, 1, 2 y 3 (Gibbs y
Summers, 2000; Link, et al, 1992).
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Respecto a los receptores adrenérgicos del tipo beta, la existencia de agonista
específicos 1, 2 y 3 (RO363, Zinterol, y CL316243, respectivamente), ha permitido
realizar estudios que demuestran que la consolidación de la memoria es incrementada por
agonistas adrenérgicos 2 y 3, pero no por agonistas 1 (Gibbs y Summers, 2000).
Como se ha señalado anteriormente, existen bases suficientes para plantear que la
estimulación de receptores adrenérgicos 2 y 3 incrementa el aprendizaje y la memoria.
Por otra parte, se sabe que la estimulación de los receptores adrenérgicos de tipo alfa, en
particular los 2c, produciría un efecto opuesto. Esta noción muestra consistencia en la
literatura y es apoyada por la amplia distribución que presentan los receptores 2 y 2c en
la corteza cerebral e hipocampo (Gibbs y Summers, 2000; Lee et al, 1998). Por otra parte,
los receptores 3 están ausentes en la corteza frontal de la rata. (Nisoli et al, 1995).
5. Aspectos fisiológicos de propanolol.
El propranolol es un bloqueador no selectivo de los receptores -adrenérgicos.
Cuando el acceso a los sitios del receptor -adrenérgico es bloqueado por propanolol, el
cronotropismo e inotropismo cardíaco así como las respuestas vasculares -adrenérgicas,
disminuyen proporcionalmente. El propanolol se absorbe casi completamente en el tracto
gastrointestinal. El efecto máximo ocurre en 1 y 1,5 horas y la vida media biológica es
aproximadamente 4 horas
Junto a estos efectos periféricos de propanolol, observaciones experimentales en
que se utilizó este antagonista, sustentan la hipótesis que el refuerzo de la memoria
mediante experiencias emocionales involucraría la activación de receptores -adrenérgicos.
Investigadores de la Universidad de California, concluyeron que el refuerzo afectivo al
aprendizaje involucra algún tipo de vía receptor -adrenérgico susceptible de bloqueo
farmacológico con propanolol (Universidad de California, 1995)
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III. OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Determinar si la administración sistémica de propanolol en la rata es capaz de
deprimir “in vivo” la potenciación sináptica de largo plazo inducida en la corteza occipital
por estimulación de fibras callosales.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Conocer y analizar el curso temporal de los efectos de propanolol en la
potenciación sináptica de largo plazo inducida en la corteza occipital.
2. Conocer y analizar las curvas dosis-respuesta de los efectos de propanolol en la
potenciación sináptica de largo plazo cortical y determinar la DE50 (dosis efectiva que
modifica en 50% la potenciación de largo plazo en la corteza occipital).
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IV. MATERIALES Y MÉTODOS
1. Materiales.
1.1. Animales.
Para la fase experimental se utilizaron ratas adultas (Rattus norvegicus), de la cepa
Sprague-Dawley, de ambos sexos, cuyas edades fluctuaron entre 55 y 62 días. Las ratas
permanecieron en el Bioterio del Instituto de Nutrición y Tecnología de los Alimentos
(INTA), Universidad de Chile. Las manipulaciones experimentales se rigieron por las
orientaciones éticas conforme las normas estipuladas por el National Research Council
(1985), así como por las normas aprobadas por el Comité de Bioética del INTA,
Universidad de Chile. Una vez terminado cada experimento, las ratas fueron eutanasiadas
empleando una sobredosis de anestésico general (5 g/kg de uretano i.p.).
Los experimentos se realizaron en ratas anestesiadas con uretano (1,5 g/kg i.p. en
una solución de 0,1 g/ml de suero fisiológico). Este anestésico se caracteriza por producir
un efecto sedante/hipnótico de larga duración y una acción selectiva sobre la musculatura
voluntaria; por lo tanto, no interfiere con el desarrollo de los experimentos al usar la
electrofisiología como metodología.
Previa administración de uretano, se inoculó en las ratas el relajante muscular D-
tubocurarina (1,5 mg/kg i.m.). Este relajante muscular es de uso rutinario en experimentos
electrofisiológicos en animales anestesiados y bajo respiración artificial, dado que por una
parte deprime la respiración propia del animal y por otra parte relaja los músculos del
cráneo donde normalmente se ubica el electrodo de referencia, evitando así la
contaminación del registro con actividad electromiográfica.
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1.2. Cirugía y procedimientos de estimulación y registro.
Las ratas fueron traqueostomizadas e intubadas para su posterior conexión a una
bomba respiratoria, previa administración del relajante muscular D-tubocurarina (1,5
mg/Kg i.p.). Las ratas fueron instaladas en un aparato estereotáxico (Foto 1), y mediante
craneostomía bilateral se expusieron sitios homólogos de cada corteza occipital.
Se utilizó un electrodo bipolar de tungsteno para la estimulación, y un electrodo
monopolar de bola de plata para el registro. El electrodo de estimulación fue situado en el
cuerpo calloso, a 0 mm de anterioridad respecto del conducto auditivo, a 3 mm de
lateralidad respecto de la línea media, y a 2 mm de profundidad respecto de la superficie
cortical (Pellegrino y Cushman, 1967) (Foto 2).
El electrodo de registro fue ubicado en el sitio homólogo contralateral, sobre la
superficie cortical (Foto 2), y el electrodo de referencia fue situado sobre el hueso craneano
expuesto. Las respuestas fueron amplificadas mediante un amplificador Grass P-5. Para
cada animal, la estimulación consistió en pulsos simples de onda cuadrada de 100 s de
duración, 0.2 Hz y de intensidad creciente (entre 50 y 200 A), con el objeto de determinar
la máxima amplitud asintótica de las respuestas evocadas contralaterales. En cada
experimento se ajustó la intensidad del estímulo para obtener respuestas evocadas de
amplitud cercana al 50% de la amplitud máxima. A estas respuestas se les denominó
respuestas basales.
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FOTO 1
FOTO 2
Rata concraneostomía bilateral, sobre aparato
estereotáxico un electrodo bipolar de tungsteno para la
estimulación (izquierda), y un electrodo monopolar de
bola de plata para el registro (derecha).
Aparato estereotáxico
1.3. Fármacos
Propanolol, Laboratorio SIGMA .
Uretano, Laboratorio SIGMA .
Cloruro de sodio 0,9%, Laboratorio Baxter S.A.
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1.4. Instrumentos de inoculación
Jeringas de vidrio Dove Brand para dilución e inoculación intraperitoneal (i.p.).
2. Métodos
2.1. Inducción y evaluación de la potenciación de largo plazo.
Como se señaló, la estimulación consistió en pulsos simples de onda rectangular de
100 s de duración, 0.2 Hz y de intensidad creciente (entre 50 y 200 A). Después de la
obtención de las respuestas basales, se aplicó un estímulo tetánico potenciador consistente
en un tren de ondas rectangulares monofásicas de 500 ms de duración, 312 Hz, y una
intensidad 50% mayor que la necesaria para obtener respuestas basales. Después de la
administración del tren tetanizante, se retomó el protocolo de estimulación simple descrito
anteriormente y se registraron las respuestas hasta el minuto 30 después de la tetanización,
para evaluarlas posteriormente por análisis de la amplitud del potencial evocado en la
corteza occipital de acuerdo al método propuesto por Racine et al. (1994); estos autores
definen operacionalmente a la potenciaciòn de largo plazo como un aumento de más de un
10% en la amplitud de la respuesta cortical, 10 minutos después de la tetanización
(respuesta potenciada), al ser comparada con la respuesta obtenida antes de la tetanización
(respuesta basal).
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Bajo esta definición, se evaluó el establecimiento de la potenciación de largo plazo en
términos de amplitud de la respuesta y se dividió el curso de tiempo posterior a la
tetanización en bloques de 5 minutos, considerando que el promedio de los valores de
amplitud de la respuesta potenciada a los 10-15 minutos después de la aplicación del tren
tetanizante constituye un buen parámetro para evaluar el establecimiento de la
potenciación de largo plazo. La respuesta potenciada fue expresada como porcentaje de
variación respecto a la respuesta basal, que constituye el 100%.
2.3. Grupos experimentales
Para conocer el curso temporal y la curva dosis respuesta de los posibles efectos de
propanolol, se utilizaron 4 grupos compuestos por 7 ratas cada uno. Todas las ratas fueron
inoculadas vía intraperitoneal con las siguientes dosis:
Grupo control: Administración de solución salina i.p. (grupo control).
Grupo 1: 1,25 mg/kg de propanolol i.p.
Grupo 2: 2, 5 mg/kg de propanolol i.p.
Grupo 3: 5 mg/kg de propanolol i.p.
2.5. Expresión de Resultados
Los resultados del cambio inducidos por propanolol, se expresaron como
porcentaje de inhibición de la potenciación de largo plazo respecto de su propio control
(medido antes de la administración de los fármacos), el cual se ajustó a un 100% en cada
experimento. Los resultados fueron registrados en el programa Microcal Origin versión
6.0, y representan la media aritmética error estándar de la media (SEM) de los valores de
la potenciación de largo plazo expresados en porcentaje.
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Se analizó el curso temporal del efecto de las distintas dosis de propanolol, en
términos del porcentaje de cambio de la potenciación de largo plazo integrada durante 30
minutos de registro (área bajo la curva). A partir de estos datos se obtuvo la curva dosis-
respuesta, donde se expresan los efectos integrados durante los 30 minutos de registro en
los diferentes grupos versus el logaritmo decimal de las dosis, y de ella se obtuvo la DE50
por interpolación en la recta de regresión, trazada por el método de los mínimos cuadrados
en el gráfico dosis-respuesta. El error de la DE50 se estimó a través del error del intercepto
en la abscisa, mediante el programa Microcal Origin, versión 6.0.
2.6. Análisis Estadístico Utilizado.
Para las comparaciones estadísticas de los resultados obtenidos se utilizó un
análisis de varianza (ANOVA) de una vía, seguido de un test a posteriori para
comparaciones múltiples entre los distintos grupos y el control salino, (test de Dunnett;
programa Graphpad Instat 3.0). Para los resultados, se estableció un nivel de significancia
de *p<0.05, **p<0.01.
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V. RESULTADOS.
1. Curso temporal de la administración de propanolol
Puede observarse que no existieron diferencias significativas entre el basal pre-
inoculación y las medias post-inoculación, tanto para el control con salino como para las
tres diferentes dosis de propanolol utilizadas, antes de la aplicación del tren tetanizante
(Gráfico Nº1).
Los resultados obtenidos (Gráfico Nº1) muestran que, después de la aplicación del
tren tetanizante, propanolol indujo una inhibición de la potenciación de largo plazo en los
tres grupos de ratas que recibieron las diferentes dosis de propanolol (1,25 mg/kg,
2,5mg/kg y 5 mg/kg). El curso temporal para las tres dosis aplicadas, muestra una
disminución de la potenciación de largo plazo que se mantiene constante a partir de los 10
minutos post-tren tetanizante. La inhibición más marcada se observó con la dosis mayor, 5
mg/kg, la cual a partir del bloque 25-30 minutos (10 minutos después de ser aplicado el
tren tetanizante), produjo una inhibición total de la potenciación de largo plazo, llegando a
niveles basales que se mantuvieron en el tiempo. Las dosis de 1, 25 mg/kg y 2, 5 mg /kg,
también establecieron una disminución en la potenciación de largo plazo a partir de los 10,
existiendo diferencias significativas con el grupo control (salino), sin lograr inhibir
completamente la potenciación de largo plazo a niveles basales.
2. Obtención de la DE50 de propanolol
El Gráfico Nº2 presenta el efecto global que produjo la administración
intraperitoneal de tres dosis distintas de propanolol, obtenido a través del área bajo la
curva de los efectos temporales durante todo el período de observación (30 minutos)
(efecto temporal integrado).
Puede observarse que propanolol indujo una inhibición dosis-dependiente de la
potenciación de largo plazo, puesta en
evidencia por el diferente grado de inhibición que generaron las distintas dosis de
propanolol. Tanto la dosis mayor (5 mg/kg) como la intermedia (2,5 mg/kg) fueron
capaces de inhibir significativamente la potenciación de largo plazo con respecto al
control, mientras que la dosis más baja (1,25 mg/kg) no indujo un cambio significativo.
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La curva dosis-respuesta (Gráfico Nº3) muestra que durante los 60 minutos de
registro propanolol inhibió la potenciación de largo plazo cortical en forma dosis-
dependiente, con una DE50 de 1,67 mg/kg i.p. (intervalo de confianza 95% = 1,35 – 2,22
mg/kg i.p.).
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Efecto temporal de la administración intraperitoneal de propanolol en la