Productos biotecnológicos

DNA recombinante

El DNA contiene la información

biológica de los seres vivos

Célula procariota Célula eucariota

access.mmhs.ca

Productos biotecnológicos

• Productos de ADN recombinante

• Ejemplos. – Enzimas recombinantes (Insulina, activador tisular de plasminógeno)

– Anticuerpos monoclonales o recombinantes (Antivenenos)

– Hormonas recombinantes (Hormona de crecimiento)

– Citoquinas recombinantes (Interferon alfa, IL-11)

– Receptores solubles recombinantes (Receptor de TNF)

– Vacunas recombinantes (Anti hepatitis B)

– Factores de coagulación recombinantes (Factor VIII)

Requerimientos para Producir

Proteínas Recombinantes

1) Gen de interés

2) Vector

3) Célula para clonación del gen de interés

4) Célula para expresión de la proteína codificada por el gen de interés

Vector

• DNA pequeño (proveniente de virus,

bacterias, levaduras) que puede ser

introducido y mantenido en una célula

(procariota o eucariota) y en el que se

puede injertar un fragmento de DNA con

el fin de ser clonado.

• Células anfitrionas:

– Eucariotas, procariotas

Tipos de Vectores

• Plásmidos

http://products.invitrogen.com/ivgn/product/K30001

Plásmidos Recombinantes

http://www.freepatentsonline.com/6803225-0-large.jpg

Tipos de Vectores

• Virus, bacteriófagos

• Cósmidos – Sitios cos ʎ + plásmido

• Cromosomas artificiales de levaduras (YACs)

• Cromosomas artificiales de bacterias – BAC

• Plásmido F

– PAC • Plásmido P1

Producción de Vector

Recombinante

2. Secuenciamiento 1. Aislamiento gen de interés

3. Recombinación

Clonación

1) Aislamiento y purificación del DNA de interés

2) Escogencia de la célula hospedera y del vector de clonación.

3) Obtención del vector recombinante

4) Trasformación, transfección del vector recombinante en célula hospedera

5) Selección de células que contienen DNA recombinante

6) Detección de los clones que contienen el DNA de interés

4.Transformación/transfección

6. Selección del clon 5. Crecimiento celular, expanción clonal

Algunas figuras tomadas de Lodish, 5th Ed

Clonación

Purificación plásmidos recombinantes

Células Anfitrionas

• Bacterias

– Escherichia coli (E. coli)

• Eucariotas – Levaduras

• Saccharomyces cerevisiae(S. cerevisiae), Pichia pastoris (P. pastoris)

– Células de insectos

– Líneas celulares mamíferas • Células derivadas de ovario de hámster chino

(CHO)

Traducción Introducción de

secuencias que permitan

el reconocimiento del

mRNA por los ribosomas

Optimización de la

traducción

(Utilización preferencial

de codones)

Introducción de señales

que garanticen

estabilidad de la

proteína

Introducción de señales

que garanticen la

secreción de la proteína

http://palaeos.info/bacteria/glossary/glossary1.html

Sistemas de Expresión

• Procariotes

E. coli

• Cuerpos de inclusión

• Eucariotes

–Levaduras

• S. cerevisiae

• P. pastoris

–Células de insectos

Secretan

17

Expresión de P.R. en E. coli

Glargina

Adaptado de Vajo Z et al. Endocr Rev 2001 22: 706-717

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

24 25 28 26 29 27 30

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly

Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala

Gly

Arg Arg

• By-product profile influenced by folding and cleavage

Insulin biosimilars

S S

SS S

S

E.coli cell

Inclusion body

Fusion protein

Preproinsulin

Insulin

Folding

conditions

influence

by-product

pattern

Cleavage

enzyme:

specificity &

selectivity

Typical

operations for

inclusion body

processes

5. Isolation of cells

6. Cell disruption via

homogeniser

7. Isolation and purification

of fusion protein

8. Folding

9. Enzymatic cleavage

10. Prepurification and

concentration via adsorption

S S

SS S

S

S S

SS S

S

Cortesía sanofi

Insulin biosimilars

• Purity is determined by chromatography steps

Insulin

Chromatography

defines purity

Fibrillation

tendency

11. Ion-exchange

chromatography

12. Reversed-phase

chromatography

13. Crystallisation

and lyophilisation

14. Blending / filling

S S

SS S

S

S S

SS S

S

Cortesía sanofi

Traducción en Eucariotes

Síntesis de Insulina en Célula Eucariota

Pichia pastoris (P. pastoris)

Atractivos

1) Rápido crecimiento

2) Altas densidades

3) Puede crecer en medios simples

4) Crece en metanol

5) Tiene promotores inducibles activados por metanol y reprimidos por glucosa

6) Modifica proteínas

Puentes disulfuro, proteolisis

1) Secreta proteínas

2) Altos rendimientos