PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTESbiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/uploads/2010/04/E4a...Características Importantes a Tener en Cuenta en la Producción de proteínas

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS

RECOMBINANTES

ELECCIÓN DEL SISTEMA DE EXPRESIÓN

Características Importantes a Tener en

Cuenta en la Producción de proteínas

recombinantes

Complejidad de la molécula: estructura

terciaria y cuaternaria, modificaciones

postraduccionales

Uso: investigación, diagnóstico, farmacéutico,

terapia

Cantidad de producto

Economía

Aspectos regulatorios

Convenientes para crecimiento en grandes

fermentadores.

Se obtienen altos rendimientos (0,1-5 g/L).

En general las proteínas tendrán metionina

N-terminal.

Es frecuente la producción en forma de

cuerpos de inclusión.

No produce eventos postraduccionales.

Endotoxinas

BACTERIAS

Conveniente para el crecimiento en

grandes fermentadores.

Buenos rendimientos (0.01-1 g/L).

Introduce modificaciones

postraduccionales.

La glicosilación es distinta de la de

mamíferos: “high manosas”

La proteólisis suele ser un problema.

LEVADURAS

CÉLULAS DE MAMÍFEROS

Los cultivos en grandes escalas son difíciles de

realizar y muy costosos.

Los rendimientos son generalmente bajos (0,001-0,1

g/L).

Se producen modificaciones postraduccionales.

Para ciertas proteínas puede ser el único sistema de

expresión posible.

PLANTAS

Se producen modificaciones postraduccionales

Expresión localizada en diferentes órganos

Expresión en estadíos específicos del crecimiento

Crecimiento en campo barato

La glicosilación es distinta que la de mamíferos

Eficiencias bajas de transformación y expresión

Seguridad controvertida

Hay tres factores importantes que influencian la

expresión de una proteína recombinante

Huésped

Condiciones de crecimiento

Vector

Por lo tanto la solución a los problemas de expresión estará a nivel del vector, de las cepas y de las

condiciones de inducción.

Hay cuatro factores importantes que

influencian la expresión de una proteína

recombinante

Vector Huésped

Condiciones de crecimiento

Secuencia del gen precursor

EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN

BACTERIAS

¿POR QUÉ BACTERIAS?

¿POR QUÉ BACTERIAS?

Simplicidad

Cultivo barato y de alta densidad en tiempos cortos

Genética bien conocida

Gran cantidad de herramientas disponibles para

biotecnología (plásmidos, cepas mutantes…)

¿POR QUÉ NO BACTERIAS?

No producen modificaciones postraduccionales:

glicosilación, puentes disulfuro (sólo en periplasma).

No secretan la proteína al medio de cultivo (E. coli)

Cuerpos de inclusión

Endotoxinas

Escherichia coli

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES

EN BACTERIAS

2 Estrategias:

sirve para purificar

Proteína de fusión generalmente es más estable

más soluble

Expresión directa

VECTORES DE EXPRESIÓN

PARA E. COLI

Secuencia Shine Dalgarno

Secuencia en el ARNm, complementaria a una secuencia

del ARNr 16S de la subunidad pequeña del ribosoma :

posiciona el ARNm en el ribosoma

AAGGAGGU

UUCCUCCA

AUG5’ 3’

ARNm

3’5’16S rRNA

Subunidad pequeña ribosomal

Efecto de una estructura secundaria en el

extremo 5’ del mRNA

Extremo 5’ del mRNA, en la

región del codón de inicio

AUG, NO debe ser

autocomplementaria, ya que

se podría bloquear el

movimiento del ribosoma e

impedir la traducción del

mensaje.

Inicio

TERMINADOR DE LA TRADUCCIÓN

Codón STOP + base siguiente

El más eficiente en E. coli: UAAU

Fuertes

simple químico

Inducibles: Inductor

barato térmico

Regulables: Baja o nula expresión basal

OPERÓN LACTOSA

Alolactosa : isómero de

lactosa. Isomerizado por

β galactosidasa

6-O-β-D-Galactopyranosyl-D-glucose;

β-D-Galactopyranosyl (1→6)-D-

glucose

galactosa-(β1-4)-glucosa

REGULACIÓN

Mecanismo dual de control

1- Regulación negativa: represor Lac, expresión constitutiva. Es secuestrado

por alolactosa e IPTG

2- Regulación positiva: por AMPc que se une a CAP: proteína activadora por

catabolito = CRP: proteína aceptora de AMPc, en respuesta a glucosa.

Curva bifásica de crecimiento de

Monod: Diauxia

I: crecimiento por glucosa

II: crecimiento por lactosa

IPTGisopropil-β-D-tio-

galactósido

No metabolizado

por βgal. Y no usa

la permeasa

ONPGorto-nitrofenil-β-D-

galactopiranósido

Sustrato de βgal

produce o nitro fenol

(amarillo)

X-gal5-bromo-4-cloro-3-

indolil-β-D-

galactósido

Sustrato de βgal

produce indoxil

(azul)

SISTEMA DE EXPRESIÓN pET

• Promotor híbrido T7/lac sólo funciona con ARN

polimerasa del fago T7, no con la de E. coli

• Cepa bacteriana BL(DE3): E. coli lisogenizada con un

fragmento del fagoDE3 que codifica para la ARN

polimerasa T7

• Inductor: IPTG

• Los niveles basales de expresión pueden ser disminuídos

con lisozima T7, inhibidor de T7ARN pol. Plásmidos pLysS

y pLysE

• La glucosa en el medio aumenta la represión del

promotor lacUV5.

Lisogenizada con un fragmento de fago DE3 que codifica para la T7 RNA

polimerasa bajo el control del promotor lacUV5 inducible por IPTG.

También posee una copia del gen lacI.

Células huésped para expresión

IPTG

Genoma de E.coli

lacI monómero

LacI tetrámero

LacI tetrámero

Plásmido pET

Transcripción

pET

SISTEMA DE EXPRESIÓN pET (plasmid for expression by T7 RNA pol)

Promotor: T7 RNA polimerasa o

promotores híbridos (T7-lac)

Gen lacI o lacIq

Sitios de clonado

Péptidos de fusión (cola de poliHis)

Sitios de corte para proteasas

Gen βlactamasa

SISTEMA DE EXPRESIÓN pBAD

Expresión muy regulada

Arabinosa: niveles altos de expresión

Sin arabinosa + glucosa: no expresión

Inducción dosis dependiente (aumento lineal en la

expresión con el incremento del inductor)

Buen rendimiento proteico

Cepas de E. coli con genes ara mutados, alta expresión con

bajos niveles de arabinosa (no metabolizan la arabinosa)

OPERÓN ARABINOSA

O1 I

Para la máxima activación de la transcripción se requieren dos eventos

Unión de arabinosa a araC

Unión de AMPc a CRP que estimula la unión de araC a O1 (I1)

O1 I

La glucosa puede reprimir la expresión basal al disminuir el AMPc

Inducción con concentraciones crecientes de arabinosa

Sistema pBAD

Otros promotores

• Promotor tac:

Promotor híbrido: región -35 del promotor trp +

región -10 del promotor/operador lacUV5.

La expresión es reprimida por lacI (inactivado por

IPTG).

Más fuerte que promotor lac (5-10 x) y trp (3x)

• Promotores de fagos:

Promotor lambda PL regulado por el represor cI.

cI857: temperatura sensible 30ºC 42ºC

cI: bajo el control del promotor lac (regulado por

IPTG)

Regulación del promotor λpL

La temperatura induce genes de heat shock (proteasas)

Desnaturalización térmica de la proteína expresada Desventajas

Los niveles de expresión de un gen son

determinados fundamentalmente por:

La eficiencia de transcripción

La estabilidad del ARNm

La frecuencia de la traducción del ARNm

ESTABILIDAD DEL ARNm

RNasa II

exonucleasas

Los ARNm son degradados por PNPasa

RNasa E endonucleasa (cepa BL21 star)

La protección del ARN de las RNasas depende de:

Plegamiento del ARN

Protección por ribosomas: Imp. iniciación de la traducción eficiente, evitar estructuras 2as

inhibitorias en RBS

FRECUENCIA DE TRADUCCIÓN

Diferentes organismos pueden usar los

diferentes codones a una frecuencia

distinta.

Uso de codones en E. coli y humanos

Uso de codones poco frecuentes

errores traduccionales

Sustitución de aminoácidos Terminación de la traducción prematura

Uso de Codones: Estrategias de

Optimización

Uso de cepas que sobreexpresan tRNAs de baja

abundancia (ej cepas Rossetta de Invitrogen).

Co- transformación del huésped con plásmidos que

expresen tRNAs de los codones problemáticos

Síntesis química de un nuevo gen.

Mutagénesis.

Destino de la proteína recombinante

Citoplasma

Periplasma

Medio extracelular

¿Por qué citoplasma?

Mayor producción

CUERPOS DE INCLUSIÓN

Agregados proteicos amorfos

Se generan como respuesta al estrés debido a la alta

expresión de proteínas recombinantes

Figure 2. Transmission electron microscopic photographs of (a) R.

sphaeroides ES16; (b) R. sphaeroides N20; and (c) R. sphaeroides U7 in

GM medium containing malate as a carbon source at the stationary

phase (72 hrs). Bacterial cells packed with poly-β-hydroxybutyrate inclusion

bodies. Bar = 2.0 μm.

Mecanismo de generación ¿?

Alta velocidad de síntesis impide el plegamiento

apropiado ?.

Ambiente citoplasmático en E. coli más reductor que

oxidante, lo que desfavorece la formación de puentes

disulfuro apropiados?

LA AGREGACIÓN PUEDE MINIMIZARSE

Temperatura….20-25ºC

Velocidad de expresión

Metabolismo del huésped

Ingeniería de la proteína recombinante………proteínas

de fusión

Co- expresión de chaperonas

Uso de cepas huésped deficientes en tiorredoxina y/o

tiorredoxina reductasa para mantener un potencial redox

favorable (cepas de E. coli “Origami”).

Sorensen, Mortensen. J. Biotechnol. 115 (2005) 113-128

Ventajas de los cuerpos de inclusión

Se acumulan en el citoplasma en mayor nivel (> del 25%) que la proteína en su forma soluble.

Son purificados por un procedimiento de centrifugación.

No tienen actividad biológica. En la producción de proteínas tóxicas en E. coli, ésta puede ser la única estrategia posible.

Son agregados amorfos resistentes a proteasas de E. coli.

Activador de plasminógeno en E. coli

Desnaturalización: 6 M clorhidrato de

guanidinio/urea

Remoción de los agentes desnaturalizantes:

diálisis, dilución, cromatografía

Separación de restos celulares por

Filtración del flujo tangencial o

normal

¿Por qué periplasma?

Disminución de proteínas contaminantes en el material a purificar

Mayor probabilidad de tener la PR con N terminal auténtico

Menor proteólisis

Fácil liberación de la proteína por shock osmótico

Disminución de efectos negativos de proteínas tóxicas sobre el

crecimiento celular.

Proteínas solubles, activas: por formación de puentes S-S facilitada

por ambiente menos reductor.

Secuencia de exportación o secuencia

señal de exportación

Secuencia de un péptido Señal en la PR, para ir a la

membrana plasmática y pasar a través de ella. Se

agrega al extremo NH2 de la proteína (extremo 5’ del

gen).

signal protein of interestNH2 COOH

Secuencias señal de genes ompA , pelB,

βlactamasa, malE…

Signal sequences Amino acid sequences

PelB (pectate lyase B) from Erwinia carotovora MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA

OmpA (outer-membrane protein A) MKKTAIAIAVALAGFATVAQA

StII (heat-stable enterotoxin 2) MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA

Endoxylanase from Bacillus sp. MFKFKKKFLVGLTAAFMSISMFSATASA

PhoA (alkaline phosphatase) MKQSTIALALLPLLFTPVTKA

OmpF (outer-membrane protein F) MMKRNILAVIVPALLVAGTANA

PhoE (outer-membrane pore protein E) MKKSTLALVVMGIVASASVQA

MalE (maltose-binding protein) MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA

OmpC (outer-membrane protein C) MKVKVLSLLVPALLVAGAANA

Lpp (murein lipoprotein) MKATKLVLGAVILGSTLLAG

LamB (λ receptor protein) MMITLRKLPLAVAVAAGVMSAQAMA

OmpT (protease VII) MRAKLLGIVLTTPIAISSFA

LTB (heat-labile enterotoxin subunit B) MNKVKCYVLFTALLSSLYAHG

Appl Microbiol Biotechnol. 2004 Jun;64(5):625-35. Epub 2004 Feb 14.

Secreción de la proteína al medio extracelular

Post cosecha: shock osmótico

congelamieto/descongelamiento

lisozima

shock con cloroformo

Durante el crecimiento: agregar glicina o tritón X100 al medio

fusión a proteína transportadora como hemolisina

o de membrana como OmpF

uso de cepas deficientes en pared

Estrés en E coli recombinantes

Causas

•Mantenimiento del plásmido:

Nº de copias……..genes constitutivos (R a ATB)

•Expresión elevada de la proteína recombinante

gasto E x sint. Proteína rec.

vel. de crecimiento biomasa. Sint. de proteínas de estrés

respiración

RESPUESTA AL ESTRÉS

•“Stringent response”: reprogramación en el patrón

de expresión de genes y disminución en la expresión

de genes de transcripción, traducción y síntesis de

aa. como consecuencia de la disminución en la

disponibilidad de nutrientes, fundamentalmente aa.

Adición de aminoácidos

RESPUESTA AL ESTRÉS

•Proteólisis de la proteína recombinante

cepas deficientes en proteasas

Ingeniería cepas deficientes en proteínas heat shock

del huésped coexpresión de chaperonas

coexpresión de inhibidores de proteasas

síntesis de proteína de fusión

Ingeniería mutagénesis dirigida al sitio de corte de proteasa

del producto redireccionamiento por péptido señal

Los sistemas de chaperonas son cooperativos y las

estrategias más favorables involucran la co expresión

de combinaciones de chaperonas pertenecientes a

las familias de GroEl, DnaK, ClpB y del factor

disparador asociado a ribosoma (trigger factor)

Reducción de estrés: x adaptación de las células

¿Cómo?

gradual del inductor

lento del Nº de copias del plásmido durante el cultivo

La formación de los puentes disulfuro en E. coli es

catalizada activamente en el periplasma por el sistema

Dsb

La mutación de los genes trx y gor en E coli permite la

formación de puentes disulfuro en citoplama

Cepa trxB - AD494 Novagen

Cepa trxB-/gor- Origami Novagen

Proteínas de Fusión y purificación de PR

Fusión a fragmentos polipeptídicos o “tags” (etiquetas)

que confieren a la PR una cierta marca.

La unión incluye el sitio de reconocimiento específico

para una proteasa

¿Para qué?

Purificación por afinidad

Protección de proteólisis

Aumento de solubilidad

Detección de expresión

ETIQUETAS = TAGs

Secuencias de antígenos, reconocidas por

anticuerpos específicos.

Moléculas con afinidad a resinas cromatográficas:

His, GST (glutatión transferasa), MBP (maltosa

binding protein)

Proteínas que aumentan la solubilidad: MBP, NusA,

IF2 (www.biotech.ou.edu)

“Colas” de 6 histidinas, fusionadas a la proteína,

ya sea en el extremo amino o carboxilo

H-H-H-H-H-HH2N

IMAC: Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography

H-H-H-H-H-H COO-

Elución

Imidazol

Bajo pH

EDTA

Metal

Ni

Co

Cu

Proteasas

Factor Xa IEGR/X (X cualquier aa menos P o R)

Trombina LVPR/G

Enteroquinasa DDDDK/X (cualquier aa menos P)

HSPP (Amersham) LEVLFQ/GP

TEV ENLYFQ/G

Corte con Factor Xa

Es la cepa de Escherichia coli más comunmente

usada para la producción de proteínas

recombinantes

BL21

Produce mayor biomasa que que E.coli K12 con menor

producción de acetato

Deficiente en proteasas Lon y OmpT

E. coli B F- dcm ompT lon hsdS(rB- mB-) gal

Estrategias para

reducir la

formación de

acetato en E. coli

Biochemistry, Genetics

and Molecular Biology

"Advances in Applied

Biotechnology", 2012

Genotype Description Benefit

lacIq

This mutated version of LacI

gives high levels of lac repressor

expression. This allows tighter

regulation of gene expression

from the lac promoter

Tightly regulated gene

expression from lac

promoter

DE3

Lysogen that encodes T7 RNA

polymerase. Used to induce

expression in T7-driven

expression systems

Required for expression

from the T7 promoter in

E.coli

pLysS

pLysS is normally plasmid borne.

It harbors T7 lysozyme, which

destroys T7 polymerase

produced from DE3. Used to

reduce basal expression in T7-

driven expression systems by

inhibiting basal levels of T7 RNA

polymerase

Tightly regulated gene

expression from T7

promoter

CEPAS BACTERIANAS PARA EXPRESIÓN PROTEICA

lon

Defficiency in the Lon ATPase-

dependent protease. Decreases

the degradation of recombinant

proteins; all B strains carry this

mutation

Reduced degradation of

recombinant proteins

ompTDefficiency in an outer membrane

protease.

Reduced degradation of

recombinant proteins

araD/ara

-14Cannot metabolize arabinose

Enhances expression from

araB promoter

dnaJ dnaJ encoded chaparonin is

inactivated

Improves folding of some

heterologous proteins

gorMutation in glutathione reductase,

which enhances disulphide bond

formation

Improves folding of

heterologous proteins

requiring disulphide bonds

No sólo Escherichia coli

Bacilli: bacterias Gram positivas

Secretan proteínas directamente al

medio

No tienen LPS en la membrana

externa no ENDOTOXINAS

Expresión en cepas de Bacilli

No / Low Protein Production

Growth ConditionsHost StrainVectorReason

•Start induction at higher

OD

•Shorten induction time

•Add Glucose to suppress

leaky expression

•Use BL21AI or

BL21(DE3)pLysS/E

•Use T7 promoter-based

vectors (also arabinose)

•Tightly regulate induction

with lac operator

Toxic protein

•Re-clone with more A

residues at 5’

•Shorten distance between

RBS and first ATG (2-8 nt)

Initiation

problems

Slow translation by

reducing temperature or

grow in poor media

Use stains

supplementing rare

codons (Rosetta,

Codon +)

Mutate gene for codon

optimization

Rare codons

•Start from freshly

transformed bacteria

•Add Glucose to suppress

leaky expression

•Use recA- strains

(HMS174; BLR)

•Tightly suppress gene

expression prior to

induction

•Use low-copy origin of

replication plasmid

Your gene

induces

rearrangement

and loss of the

DE3 lysogen

Use RNAse deficient

strain (BL21Star)

Change vector to

structured RNA vector

RNA

degradation

Growth ConditionsHost StrainVectorReason

Lowaring induction

temperature usually helps

Use Trx(-)/gor(-)

strains (e.g.

Origami) for

creating oxidative

conditions in

cytosol

Use thioredoxin, DsbA, DsbC

fusion partners

Clone in a vector containing

secretion signal to the

periplasm (pelB, OmpA)

Protein is

misfolded due to

lack of correct

disulfide bond

formation

Slow expression rate (low

temp; low [inducer]; short

induction time; poor media)

Heat shock with

chemical chaperones

Membrane rich

strains

(C41/C43)

Solubility enhancing fusion

proteins (MBP, NusA, GST,

etc.)

Hydrophobic

protein

Heat shock with

chemical chaperones

Screen various

expressing

strains

Add vectors for various

chaperone co-expression

No appropriate

chaperones

Induce at low temp. Membrane rich

(C41/C43)

Replace with bacterial

signals (secretion) or omit

signals

Sub-cellular

localization

signals

Membrane rich

(C41/C43)

Use mistic fusion protein.

Generate truncated forms of

protein (soluble domains)

Membrane

proteins

Heat shock with

chemical chaperones

Transform with a partner :

combination of 2-4 vectors

for max 8 proteins

Protein is part of

a complex

Aggregation

Truncated protein

Growth ConditionsHost StrainVectorReason

Slow elongation by low

temp.; low inducer;

poor media

Use rare codon

strains (rosetta ,

codonPlus)

Optimize codon

usage

Rare codons

Slow expression rate

with low temp.; low

inducer; short harvest;

poor media

Sub-clone with

another fusion

partner or avoid N-

terminus fusion

protein

Faster,

uncoordinated-

translation of

fusion protein

Grow and induce at low

temp, use

protease

inhibitors when

breaking the cells

on ice

Induce at higher OD

and reduce

induction time

Low protease

strains (BL21

derivatives, M15)

Detect and replace

specific protease

sites

Degradation