LUANA RISSI SILVA Produção experimental de inoculantes agrícolas á base de Azospirillum spp. para Fixação Biológica de Nitrogênio em gramíneas e Forrageiras Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/IPT/I.BUTANTAN para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Área de concentração Biotecnologia Orientador Dr. José Geraldo da Cruz Pradella São Paulo 2006
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Produção experimental de inoculantes a base de Azospirillum para FBN
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LUANA RISSI SILVA
Produção experimental de inoculantes agrícolas á
base de Azospirillum spp. para Fixação Biológica
de Nitrogênio em gramíneas e Forrageiras
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia
USP/IPT/I.BUTANTAN para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia
Área de concentração
Biotecnologia
Orientador Dr. José Geraldo da Cruz Pradella
São Paulo 2006
AGRADECIMENTOS
Ao professor Doutor José Geraldo da Cruz Pradella pela orientação, aprendizado e
amizade ao longo destes anos.
Á memória do Professor Luiz Carlos Urenha, pelo estímulo e críticas.
Aos pesquisadores do Centro de Biotecnologia Industrial pela assitência e amizade.
Aos funcionários do Laboratório de Fermentação Industrial (LFI) pelo auxílio e
colaboração, em especial, ao Régis Norberto de Carvalho e Walter de Oliveira.
Á mestre Marilda pelas sugestões e críticas que muito me influenciaram.
A professora Doutora Vera Lúcia Baldani pelo fornecimento das cepas de
Azospirillum e o insentivo para realização dos ensaios.
A ajuda paciente da minha mãe que agüentou folhas de rascunho espalhadas pela
casa, arengas sobre canetas que tinham sumido, e as numerosas vezes que me apossei
do computador.
Ao Bruno pelo carinho, amor e paciência nos momentos difíceis.
Em especial a Cristina, Vinícius, Marcelo, Cecília, Fernanda Matias e as colegas da
salinha, Tatiana Strelec, Sra, Caulkins e Cristiane Ottoni. pela amizade, carinho e
imprescindível colaboração para o desenvolvimento deste trabalho.
Ao Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo (IPT), pelo suporte
técnico e físico.
À Secretaria de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia
USP/IPT/I.BUTANTAN pelo auxílio prestado no decorrer do mestrado.
Ao Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo
auxílio concedido.
A Todos que, direta ou indiretamente, colaboraram para a realização deste trabalho.
SUMÁRIO
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Resumo
Abstract
1 Introdução 1
2 Revisão Bibliográfica 4
2.1 Bactérias associadas às plantas 4
2.2 Dinâmica do Nitrogênio em Sistemas Agrícolas 6
2.3 A Revolução Verde 9
2.4 Fixação Biológica de Nitrogênio 11
2.5 Diazotrofos associativos 14
2.5.1 Endofíticos facultativos 15
2.5.2 A associação do gênero Azospirillum com as gramíneas 16
2.5.3 Resposta da planta à inoculação de Azospirillum spp 18
2.6 Importância Econômica da Fixação Biológica de Nitrogênio 23
3 Produção de Inoculantes para a FBN à base de Azospirillum 37
3.1 Fontes de Carbono 28
3.2 Fontes de Nitrogênio 34
4 Objetivos 42
5 Materiais e métodos 43
5.1 Microrganismo 43
5.2 Meios de cultura 43
5.2.1 Soluções-estoque 43
5.2.2 Solução salina 44
5.2.3 Meio de cultura para conservação do Microrganismo 45
5.2.4 Meios de cultura sólidos para preparo do inóculo 46
5.2.5 Meios de cultura líquido 46
5.3 Ensaios em incubador rotativo 47
5.3.1 Equipamento 47
5.3.2 Preparo do Pré-inóculo 48
5.3.3 Preparo do inóculo 48
5.3.4 Inoculação dos frascos 48
5.3.5 Inoculação e amostras 48
5.3.6 Determinações efetuadas 49
5.4 Ensaios em fermentador, processo descontínuo 49
5.4.1 Equipamento 49
5.4.2 Preparo do inóculo 50
5.4.3 Inoculação do fermentador 50
5.4.4 Amostragens 50
5.4.5 Determinações efetuadas 50
5.5 Métodos de análises 51
5.5.1 Determinação de Absorbância (A) 51
5.5.2 Concentração Celular Mássica (X) 52
5.5.3 Concentração de Unidades Formadoras de Colônias em placas 52
5.5.4 Concentração de Frutose, Sacarose, Etanol, Glicerol e Lactato (S) 52
5.5.5 Avaliação da concentração de Nitrogênio Amoniacal 54
5.5.6 Avaliação da concentração de Fósforo 55
5.6 Cálculo dos Parâmetros Cinéticos 57
5.7 Experimentos realizados e nomenclatura dos ensaios 58
6 Resultados e discussão 60
6.1 Meios sólidos 60
6.2 Fontes de nitrogênio 60
6.3 Ensaios em incubador rotativo 61
6.3.1 Frutose 62
6.3.2 Glicerol 63
6.3.3 Sacarose 63
6.3.4 Lactato 64
6.3.5 Etanol 65
6.4 Observações gerais 71
6.5 Ensaios em biorreator 74
6.5.1 Glicerol 76
6.5.2 Frutose 79
6.5.3 Sacarose 81
6.5.4 Etanol 83
6.6 Comparação entre os ensaios (biorreator) 85
6.7 Cultivo em alta densidade celular (ADC) 89
6.7.1 Protocolo ADC com vazão constante de alimentação para A. lipoferum 91
6.7.2 Protocolo ADC com vazão constante de alimentação para A. brasilense 95
7 Conclusões 100
8 Referências Bibliográficas 104
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1 Ciclo do nitrogênio na natureza (modificado de Kerbauy, 2004) 7
Figura 2.2 Produção mundial de grãos em milhões de toneladas a partir de 1950 e
projeções do Banco Mumdial e da FAO
(modificado de Mann, 1997) 10
Figura 2.3 Esquema cinético do complexo nitrogenase (modificado de Nelson &
Cox, 2000) 13
Figura 3.1 Metabolismo central do carbono em Azospirillum 33
Figura 5.1 Esquema da metodologia analítica utilizada no tratamento das ams 51
Figura 6.1 Evolução das concentrações de Biomassa, Frutose, Nitrogênio
Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E1 (Azbr01a
(♦) e Azbr01b (■)) e E6 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitador
rotativo 66
Figura 6.2 Evolução das concentrações de Biomassa, Glicerol, Nitrogênio
Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E1 (Azbr01a
(♦) e Azbr01b (■)) e E6 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitador
rotativo 67
Figura 6.3 Evolução das concentrações de Biomassa, Sacarose, Nitrogênio
Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E1 (Azbr01a
(♦) e Azbr01b (■)) e E6 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitador
rotativo 68
Figura 6.4 Evolução das concentrações de Biomassa, Lactato, Nitrogênio
Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E1 (Azbr01a
(♦) e Azbr01b (■)) e E6 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitador
rotativo 69
Figura 6.5 Evolução das concentrações de Biomassa, Etanol, Nitrogênio Amoniacal
e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E1 (Azbr01a (♦) e
Azbr01b (■)) e E6 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitadorrotativo 70
Figura 6.6 Evolução das concentrações de biomassa (□); Glicerol (◊); Absorbância
( ); Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em
fermentador 78
Figura 6.7 Concentração celular LN(X) segundo o tempo de incubação para os
ensaios com Glicerol 79
Figura 6.8 Evolução das concentrações de biomassa (□); frutose (◊); Absorbância
( ); Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em
fermentador 80
Figura 6.9 Evolução das concentrações de biomassa (□); sacarose (◊); Absorbância
( ); Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em
fermentador 82
Figura 6.10 Evolução das concentrações de frutose, glicose e sacarose em
Azlp01 82
Figura 6.11 Evolução das concentrações de biomassa (□); etanol (◊); Absorbância
( ); Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em
fermentador 84
Figura 6.12 Correlação obtida entre os valores de concentração celular (X) e
absorbância para os ensaios em fermentador 87
Figura 6.13 Crescimento de A. lipoferum BR 17 em batelada, ensaio Azlp02 92
Figura 6.14 Resultados do protocolo a ADC para A lipoferum Br 17 94
Figura 6.15 Crescimento de A. brasilense em batelada, ensaio Azbr05 96 Figura 6.16 Resultados do protocolo de cultivo a ADC de A brasilense Sp 7 98
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1 Resposta de cereais à inoculação com Azospirillum spp –
experimentos desenvolvidos em diversos países 20
Tabela 2.2 Uso de fertilizante nitrogenado em diversos países 24
Tabela 2.4 Área plantada de culturas potencialmente usuárias de inoculantes para
fixação biológica de nitrogênio 26
Tabela 3.1 Fonte de Carbono utilizada para crescimento de Azospirillum spp 29
Tabela 3.2 Fatores de conversão para alguns microrganismos com diferentes
fontes de N 35
Tabela 5.1 Concentração de glicerol em g/L na amostras 53
Tabelas 5.2 Experimentos realizados para o estudo do crescimento de A.
brasilense Sp7 e A. lipoferum Br 17 e ensaios componentes de cada
experimento 59
Tabela 6.1 Crescimento das bactérias nos meios sólidos selecionados 60
Tabela 6.2 Concentração final de biomassa para as fontes de N testadas (120 h de
cultivo) 61
Tabela 6.3 Dados experimentais obtidos nos ensaios com A. brasilense Sp7 e A.
lipoferum Br 17 em incubador rotativo (200 rpm, 30ºC) 73
Tabela 6.4 Etapas preliminares dos ensaios em fermentador 75
Tabela 6.5 Tempo de crescimento, concentrações iniciais e finais de células (Xo,
Xf), Substrato (So, Sf), Nitrogênio (No, Nf) para os diferentes ensaios,
em função da composição do meio de cultura 85
Tabela 6.6 Comparação do custo de produção de biomassa de Azospirillin em
biorreator em relação ao custo do substrato 88
Tabela 6.7 Composição do meio de cultura alimentado durante a fase
descontínua-alimentada à vazão constante do protocolo de ADC para
cultivo de A. lipoferum BR 17 e A. brasilense Sp 7 91
Tabela 6.8 Concentração em UFC/mL para o protocolo a ADC de A lipoferum
BR 17 95
Tabela 6.9 Concentração em UFC/mL para o protocolo a ADC de A brasilense Sp
7 99
RESUMO
Este trabalho objetiva o estudo do cultivo de bactérias do gênero Azospirillum spp.
para o estabelecimento da produção de inoculantes para fixação biológica de nitrogênio em
gramíneas e forrageiras. Alternativas ao meio NFb usado em laboratório são necessárias para
processamento industrial, pois os constituintes ácido málico e vitaminas encareceriam
demasiadamente o custo de produção. Foi efetuado screening de fontes de carbono e
nitrogênio, de baixo custo, capazes de garantir altas concentrações celulares e de propiciar
formulação de meio de cultura reprodutível. A. brasilense Sp7 e A. lipoferum BR 17, cedidas
pela EMBRAPA-CNPAB, foram cultivadas em um meio básico composto de micronutrientes
(Mo, Mn, B, Cu, Zn) e extrato de levedura (1,0 g/L), variando-se as fontes de carbono frutose,
etanol, glicerol, sacarose e lactato (5g/L) e as fonte de Nitrogênio NH4Cl e (NH4)2HPO4
suplementado com K2HPO4. Os ensaios foram realizados em incubador rotativo (200 rpm;
30ºC; pH 6,8) durante 5 dias. Para A. brasilense Sp7 foram escolhidas as fontes de C frutose,
glicerol e etanol obtendo-se, respectivamente, 2,8; 2,1 e 1,8 g/L de biomassa ao final do
ensaio. Para A. lipoferum BR17 foram escolhidas as fontes de C sacarose e glicerol obtendo-
se, respectivamente, 2,2; e 1,4 g/L ao final do ensaio. (NH4)2HPO4 foi a fonte de N escolhida
para estas linhagens. A cinética do processo foi estudada em biorreator (pH = 6,8 e 30oC,
pO2>20%) obtendo-se os parâmetros descritos a seguir. A. brasilense: frutose (µm= 0,20 h-1;
de associações radiculares têm sido descritas: uma, ao nível de superfície, e outra,
interna. No primeiro caso, a bactéria coloniza indinstintamente toda a superfície
radicular, formando pequenos agregados, algumas vezes embebida no mucigel, e
raramente coloniza a superfície dos pêlos radiculares (Patriquin & Döbereiner, 1978;
Umali-Garcia et al., 1980). O modo de adesão do Azospirillum à planta se dá
mediante ataque apolar (raramente polar), onde podem estar envolvidas estruturas
fibrilares que realizam o ancoramento da bactéria á célula vegetal, estabelecendo
deste modo a ligação entre células (Levanony et al., 1989). A partir desse
conhecimento, diversos grupos mundiais de pesquisa se interessaram pela associação
gramíneas/bactérias diazotróficas, o que culminou com a identificação de seis
espécies de Azospirillum nos últimos vinte anos. Mas há no meio científico, muita
discussão quanto á classificação das bactérias do gênero Azospirillum como bactérias
endofíticas facultativas ou rizosféricas. As dúvidas emergem, em parte da capacidade
de algumas estirpes em colonizarem o interior das raízes, enquanto outras colonizam
apenas a superfície delas. Estudos, trabalhando em condições de campo com plantas
de trigo inoculadas com diferentes estirpes de Azospirillum e utilizando técnicas
diferentes, concluíram que a utilização de estirpe homóloga (refere-se à estirpe
isolada da espécie de planta à qual está sendo inoculada) Sp 245 colonizam o interior
de raízes de trigo enquanto que a estirpe heteróloga (refere-se à oriunda de outras
espécies) foi incapaz de colonizar o interior das mesmas raízes (Baldani et al., 1987;
Schloter et al., 1994, Assmus et al., 1995). Contudo, foram gerados conhecimentos
sobre ecologia, fisiologia e genética, assim como sobre o processo de infecção e
colonização de cereais, principalmente pelas espécies A. brasilense e A. lipoferum
(Baldani et al., 1997a).
A espécie Spirillum lipoferum foi redescoberta no Brasil como bactéria
diazotrófica associada à rizosfera e raízes de várias gramíneas (Döbereiner & Day,
2 Revisão Bibliográfica 18
1976) e, logo depois, reclassificada como gênero novo Azospirillum (Tarrand et al.,
1978).
Pouco se sabe, porém sobre sobrevivência do Azospirillum no solo na
ausência da planta hospedeira, mas tem sido demonstrado que a bactéria apresenta
vários mecanismos fisiológicos de proteção (formação de cistos, produção de
melanina, de poli-β-hidroxibutirato e de polissacarídeos), que podem facilitar a
sobrevivência em condições desfavoráveis (Del Gallo & Fendrik, 1994).
O padrão de colonização das raízes das gramíneas pelas espécies de
Azospirillum mostra uma tendência de especificidade entre grupos de plantas e as
bactérias: A. lipoferum ocorre preferencialmente no córtex de milho, sorgo e de
diversas outras gramíneas com a via fotossintética C4, mas foi também observada em
uma espécie ciperácea (Döbereiner, 1982a), enquanto A. brasilense ocorre
preferencialmente associado a trigo, cevada, aveia, arroz, centeio e gramíneas com
via C3 (Döbereiner & De-Polli, 1980; Rocha et al., 1981). A. halopraeferans é mais
específica, tendo sido isolada apenas de uma espécie de gramínea, o ‘kallargrass`
(Leptochloa fusca), planta nativa do Paquistão, altamente tolerante a solos salinos
(Reinhold et al., 1987). Já a espécie A. irakense, tem sido apenas isolada de raízes de
arroz (Khalmmas et al., 1989).
2.5.3 Resposta da planta á inoculação de Azospirillum spp
O uso de várias técnicas para a quantificação do N em culturas, como:
abundância natural de 15N, balanço de N total, diluição isotópica de 15N, uso do gás 15N2 e redução de acetileno em raízes, tem mostrado que 60% das necessidades de
nitrogênio da cana-de-açúcar são equacionadas pela FBN (Resende et al., 2003a). A
introdução da FBN nesta cultura torna-se ainda mais importante quando se avalia o
balanço energético da cultura. Dois terços desta cultura são utilizados para a
produção de álcool combustível no Brasil (Resende et al., 2003a). Conquistas como
2 Revisão Bibliográfica 19
esta fizeram com que o Brasil se tornasse o menor usuário de adubos nitrogenados do
mundo. Enquanto países como a Índia ainda seguem os paradigmas da Revolução
Verde (Döbereiner, 1997). Entre as leguminosas, um exemplo de cultura que pode
ser significativamente otimizada pela FBN é o feijoeiro (Vargas & Hungria, 1997).
Este grão corresponde entre 20 e 28% das proteínas ingeridas no Brasil. Apesar da
vasta área plantada, a produtividade ainda é muito baixa, com médias de 505 kg.ha-1,
muito limitada pelo fornecimento de N e P. O N necessário à cultura poderia ser
fornecido via FBN. Esta tecnologia de baixo custo reverteria a queda na
produtividade sem o uso de adubos nitrogenados, além de contribuir para a
preservação da fertilidade do solo. Entretanto, estimativas das taxas de FBN obtidas
em campos experimentais na América Latina e África não ultrapassam 40% de N
fixado no feijoeiro, o que pode ser otimizado com condições ambientais favoráveis,
ciclos culturais longos e uso de estirpes e cultivares selecionados, permitindo que o
feijoeiro nodulado alcance produtividade de até 2500 kg.ha-1 em solos pobres em N,
compatível às plantas que recebem N mineral (Vargas & Hungria, 1997).
Durante os últimos anos, tem-se perguntado muito sobre os benefícios da
inoculação com as bactérias fixadoras de nitrogênio do gênero Azospirillum. Nesse
processo, porém, existe o problema de transferência do N fixado para a planta que,
segundo Rao et al, (1986), ocorre muito lentamente e apenas pequena parte se torna
disponível para o vegetal. A alternativa para melhorar a transferência do nitrogênio
fixado para a planta seria o uso de mutantes excretores de NH4+ (Machado et al.,
1991) e cuja viabilidade foi demonstrada por Cristiansen-Weniger & Van Veen
(1991). Já a Tabela 2.1 enfatizam que a inoculação pôde ser otimizada através das
condições ambientais favoráveis quando comparados os diversos países que utilizam
a técnica de FBN. A utilização de ciclos culturais longos, como mostra os resultados
obtidos nos cultivos de milho e sorgo no Brasil e na França alcançaram 100% de
resposta no aumento de N na planta.
2 Revisão Bibliográfica 20
Tabela 2.1 Resposta de cereais à inoculação com Azospirillum spp – experimentos
desenvolvidos em diversos países (Baldani et al., 1999). Aumento
País
Duração dos experimentos Cultura Inóculo
N total na planta Referência
(Semana) (%) EUA 3 Sorgo A. brasilense Cd 11 - 24 Tien et al., 1979
inoculação de culturas jovens e daquelas mantidas sob crescimento por mais de dez
dias, visando aumentar a sobrevivência da bactéria no inoculante, já que as células
com maior acúmulo de PHB podem resistir por mais tempo a condições adversas.
Vale ressaltar que a competitividade com outras estirpes ou mesmo outros
componentes da microbiologia do solo pode prevenir a colonização radicular por
bactérias do gênero Azospirillum (Döbereiner & Pedrosa, 1987; Fallik et al., 1988b).
2 Revisão Bibliográfica 22
Outra possibilidade de uso da FBN é sua utilização indireta através de adubos
verdes. Este adubo é produzido por uma cultura que fixa nitrogênio anteriormente ou
concomitante à cultura de interesse. No primeiro caso, a cultura fixadora
corretamente manejada, serve de base para o plantio da outra cultura que se beneficia
com a mineralização do nitrogênio. Entretanto, em condições tropicais de alta
temperatura e pluviosidade a mineralização é acelerada produzindo perdas
significantes do adubo. Já o consórcio possibilita a utilização direta pela excreção de
compostos nitrogenados ou decomposição de nódulos radiculares, e ainda, pelo corte
da parte aérea do adubo que irá se decompor concomitante à assimilação pela cultura
de interesse. Adubos verdes podem contribuir com até 150 kg de N.ha-1.ano-1 para as
culturas (Resende et al., 2003b). A inoculação de Azospirillum na presença de
pequenas doses de fertilizantes nitrogenados tem mostrado maior eficiência para o
sistema planta-bactéria quando comparado com o uso isolado da bactéria (Tabela
2.1). Baldani et al., (1987) obtiveram uma incremento de 28% na produção de grãos
de trigo em relação à testemunha crescida com o equivalente a 100 kg/ha de N
quando inocularam a estirpe Sp 245 de A. brasilense e suplementaram as plantas com
15 kg/ha de N (Tabela 2.1). Já Didonet et al, (1996) observaram que a produção de
grãos de trigo inoculado com a estirpe JA04 de A. brasilense e complementada com
15 kg/ha de N, diferiu estatisticamente do tratamento-controle, que recebeu adubação
equivalente a 45 kg/ha e aumentou em até 53% de N em cobertura (Tabela 2.1).
Fages (1994) relata que os aumentos observados na produção de grãos de sete
experimentos de inoculação de milho na presença de pequenas doses de N, se devem
a um melhor desenvolvimento do sistema radicular da planta devido aos
fitohormônios produzidos.
O veículo de inoculação (sólido e líquido) é outro aspecto que se deve
considerar nos experimentos em gramíneas. O substrato sólido mais usado é a turfa
estéril neutralizada, dado o know how já adquirido com o inoculante desenvolvido
para rizóbio e também o seu baixo custo. Ela pode ser empregada pura, na forma de
pó ou granulada e em mistura com argilas (vermiculita) ou carvão. No caso dos
inoculantes líquidos, tem-se feito uso de óleo mineral e de polímero como, por
2 Revisão Bibliográfica 23
exemplo, o alginato e a goma xantana que promovem o encapsulamento das células e
só as liberam após a degradação do polímero e, assim, previnem as células de
estresses ambientais (Jung et al, 1982). Esse processo tem, como desvantagem, a
necessidade de mão-de-obra especializada e, conseqüentemente, o custo elevado.
Fallik & Okon (1996), por exemplo, obtiveram um aumento de 15% na
produção de grãos de milho quando fizeram uso da turfa granulada em comparação
com a pulverização no sulco e semente peletizada, que aumentaram 11 e 3%
respectivamente. Já a pulverização pós-emergência das sementes teve um efeito
negativo de 2% na produção de grãos. Baldani et al., (1983) também obtiveram
maior aumento na produção grãos de trigo usando turfa granulada (35%) em
comparação com inoculante oleoso (19%).
Estudos de inoculação de cereais com bactérias diazotróficas têm mostrado
que as endofíticas têm um maior potencial de contribuição da FBN e que o genótipo
da planta influencia na associação da planta/bactéria. Os avanços alcançados
apontam para uma maior exploração e entendimento desta associação endofítica. Os
programas de sequenciamento do genoma: RIOGENE e GENOPAR mostram a
importância da FBN no Brasil e devem permitir que o país continue na fronteira do
conhecimento em relação ao processo de FBN em gramíneas (Baldani et al, 2005).
2.6 Importância Econômica da Fixação Biológica de Nitrogênio
A agricultura brasileira tradicionalmente usa menos nitrogênio mineral nas
aplicações de fertilizantes, quando comparada com a de outros países. A Tabela 2.2
dá um quadro da quantidade de nitrogênio aplicada como fertilizante em diversos
países:
2 Revisão Bibliográfica 24
Tabela 2.2 Uso de fertilizante nitrogenado em diversos países (Dobereiner, 1997)
País
N (kg/ha)
Países da Europa 172
China 87
USA 58
México 36
Índia 27
Brasil 10
O alto custo do fertilizante nitrogenado no Brasil leva a um processo de
seleção de genótipos de plantas que fornecem altos rendimentos com baixo uso deste
fertilizante. O baixo uso de N mineral faz a agricultura mais lucrativa e gera menor
poluição dos lençóis freáticos. A seleção de genótipos da soja plantada no país foi
feita levando-se em consideração a não aplicação de N mineral. Hoje, toda a soja
plantada no país é feita sem aplicação de N mineral. O rendimento médio desta
cultura é maior que 2 ton/ha. Com um conteúdo médio de 6% de N, praticamente
vindo totalmente da fixação biológica, isto corresponde a cerca de 120 kg/ha de N,
proveniente da ação bacteriana. Estima-se que a economia total pelo não uso de
fertilizantes nitrogenados na soja é de cerca de US$ 3,2 bilhões. No feijão, esta
economia poderia chegar a US$ 375 milhões com o uso de inoculação bacteriana e
seleção de melhores genótipos. Na última década ficou demonstrado que parte do
nitrogênio utilizado por cereais e forrageiras advém da associação destas plantas com
bactérias diazotróficas como Herbaspirillum spp, Burkholderia spp e Azospirillum
spp. Estas bactérias colonizam raízes, troncos e folhas de milho, arroz e trigo. Dentre
todas as não leguminosas, a cana-de-açúcar é provavelmente a que recebe maior
contribuição da fixação biológica de nitrogênio. Cerca de 150 kg N/ha são obtidos
por fixação biológica na cana-de-açúcar (Döbereiner, 1997).
2 Revisão Bibliográfica 25
2.7 O Mercado Brasileiro de Inoculantes para Fixação Biológica de Nitrogênio
Apesar de ter sido largamente demonstrada a fixação biológica de nitrogênio
pela associação entre Azospirillum spp. e gramíneas, não existe ainda um produto
comercial para tal fim.
Em contraste, existe um mercado completamente desenvolvido para a
produção e uso do inoculante para fixação biológica de nitrogênio em leguminosas.
Este mercado é regulado pelo Ministério da Agricultura e conta com associações de
produtores e de pesquisadores, como a Associação Nacional de Produtores e
Importadores de Inoculantes (ANPII) e a Rede de Laboratórios para Recomendação,
Padronização e Difusão de Tecnologia de Inoculantes Microbiológicos de Interesse
Agrícola (RELARE). A associação entre produtores, pesquisadores e agentes
governamentais gerou uma bem sucedida comunidade, que conta inclusive com um
fundo de pesquisas financiado pelas empresas, à razão de R$ 0,01 por dose de
inoculante vendida.
O mercado brasileiro de inoculantes para fixação biológica de nitrogênio em
leguminosas, fundamentalmente a soja, foi de cerca de 14 milhões de doses em 2001.
Destas, cerca de 10 milhões foram produzidas no país e o restante importado da
Argentina e, em escala bem menor, do Uruguai1. Os produtores estrangeiros são
igualmente membros participantes da RELARE e os importadores, da ANPII.
A dose de inoculante é vendida, em média, a US$ 0,60, o que permite estimar
o mercado em cerca de US$ 8,5 milhões1, totalmente suprido por indústrias de
pequeno e médio porte.
1 - Laura Machado Ramos. Relatório apresentado durante a XI-RELARE, reunião da Rede de Laboratórios para Recomendação, Padronização e Difusão de Tecnologia de Inoculantes Microbiológicos de Interesse Agrícola, ocorrida no Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo, entre 18 e 20 de junho de 2002.
2 Revisão Bibliográfica 26
Para as empresas, a abertura de um mercado de inoculantes para fixação
biológica de nitrogênio em não-leguminosas permitiria uma imensa ampliação de
escala de produção. A Tabela 2.3 mostra as áreas plantadas de soja, feijão, cana-de-
açúcar, milho, arroz e trigo no país (IBGE, 2005). A uma razão de aplicação de uma
dose por hectare, a mesma que é recomendada para leguminosas, apenas o mercado
potencial brasileiro total saltaria de 14 milhões para 42 milhões de doses. Com
redirecionamento de parte dos investimentos de marketing das empresas para os
países da América Latina, o mercado poderia ser ainda maior.
Tabela 2.3 Área plantada de culturas potencialmente usuárias de inoculantes para
fixação biológica de nitrogênio (IBGE, 2005).
ÁREA PLANTADA (ha) CULTURA
Brasil Argentina
Soja 16.314.162 10.280.000
Feijão 3.468.000 257.000
Cana-de-açúcar 5.623.422 265.000
Arroz 3.147.000 151.000
Milho 12.355.000 2.745.000
Trigo 1.702.000 7.000.000
TOTAL 42.009.162 20.698.000
Os benefícios econômicos, sociais e ambientais da abertura deste mercado são
evidentes: (1) menor uso de fertilizante nitrogenado mineral; (2) maior lucratividade
das culturas; (3) menor poluição ambiental; (4) economia da energia empregada na
fabricação de N mineral; (5) geração de empregos nas indústrias.
3 Fontes de Carbono 27
3. Produção de Inoculantes para Fixação Biológica de Nitrogênio à Base de
Azospirillum
A extensão da FBN para plantas não leguminosas, principalmente gramíneas
e cereais, se tornou um dos maiores desafios dos últimos 20 anos. Inicialmente,
pensava-se que havia somente bactérias diazotróficas na rizosfera, já que certas
gramíneas como a grama batatais (Paspalum notatum) crescem bem em solos ácidos,
sem adubo nitrogenado. Nos anos seguintes, foram isoladas de cana-de-açúcar e
cereais como milho, arroz e sorgo três novas espécies de Azospirillum que não
somente colonizam a rizosfera, como também contêm certas estirpes que são capazes
de infectar a planta, e, assim, fornecer o nitrogênio de forma mais eficiente. Baldani
& Döbereiner, em 1980, utilizaram o meio NFB líquido para o cultivo dependente da
fixação de nitrogênio de A. brasilense e A. lipoferum para o cultivo não dependente
da fixação de nitrogênio, o meio NFB era suplementado com 0,53g de NH4Cl
(Baldani & Döbereiner, 1980).
Pensando-se em termos industriais, entretanto, devem-se procurar alternativas
ao meio NFB, pois a sua principal fonte de carbono (ácido málico) é uma substância
de difícil obtenção somente possível de utilização em trabalhos de laboratório.
Também a formulação incluindo micronutrientes e vitaminas talvez não seja
adequada pelo alto custo e dificuldade de preparo.
Assim, procurou-se a seguir efetuar um levantamento das fontes de carbono,
nitrogênio e fósforo utilizáveis no processo de produção de A. brasilense e A.
lipoferum.
3 Fontes de Carbono 28
3.1 Fontes de Carbono
Existe uma importante relação em Azospirillum, entre a fixação de nitrogênio
e a escolha correta da fonte de carbono e o suprimento de açúcar na natureza por
hospedeiros em gramíneas (Westby and Vigil, 1983). Alguns compostos estimulam
a atividade da nitrogenase (Okon and Burris, 1976).
Tanto A. lipoferum como A. brasilense utilizam malato como fonte de
carbono, mas somente a primeira consegue utilizar glicose (Baldani et al., 1997a). O
gênero Azospirillum também tem a habilidade para produzir fitohormônios como
AIA (ácido indol acético) (Thuler et al, 2003). Os genes para a biossíntese desse
fitohormônio foram encontrados também em A. amazonense, mas não em A. irakense
(Vandebroek & Vanderleyden, 1995). O ótimo crescimento com relação à
temperatura, está entre 32 e 37ºC, sendo que A. halopraeferens tem um crescimento
ótimo a 41ºC e possui tolerância à condições salinas. A. irakense hidrolisa pectina e
também tolera altas concentrações de sais (Baldani et al., 1997).
Westby et al (1983) estudou o metabolismo do carbono em Azospirillum para
checar a resposta ao crescimento deste organismo usando diversas fontes de carbono
e energia. Utilizou-se A. brasilense e A. lipoferum, estirpes selvagens de Sp7, BR17 e
de dois mutantes, CW-1 e CW-2 nos experimentos de crescimento em meio sólido. A
Tabela 3.1 mostra que os resultados obtidos assemelham-se aos achados por Albrecht
& Okon, 1980; Okon et al., 1976; Tarrand et al., 1978 e confirma o crescimento de
Azospirillum utilizando açúcares ou ácidos orgânicos como fonte de carbono. (Tabela
3.1). Os resultados indicaram que essa fixadora de nitrogênio utiliza a via Entner-
Doudoroff para a dissimilação de gliconato (Figura 3.1). A partir da descoberta da
presença desta via metabólica, pôde-se traçar outras para a utilização de outras fontes
de carbono.
3 Fontes de Carbono 29
Tabela 3.1 Fonte de Carbono utilizada para crescimento de Azospirillum spp.
Fontes de Carbono A. brasilense Sp7 A. lipoferum Br17
Sacarose - - - - - -
D-gliconato +++ +++
Arabinose ++ ++
Frutose +++ +++
Etanol ++ ++
Glicerol ++ ++
Fumarato ++/+++ ++/+++
Glicose - - - +++
Malato +++ +++
Lactato +++ +++
Ceto-gliconato +++ +++ As fontes de carbono utilizadas estão presentes no meio sólido Dobereiner-Day-NH4Cl (DDN) em
concentração de 5 g/L. Os ácidos estão incorporados nos sais de sódio ou potássio. As bactérias foram
incubadas a 32ºC por 3 ou 4 dias, obtendo-se os seguintes resultados de crescimento em agar:
Não se conhece ainda exatamente qual sistema enzimático (GDH ou GS-
GOGAT) seria o predominante em Azospirillum para a produção do glutamato, mas
Westby & Meeks, 1987, afirmam que a via pode ser determinado de acordo com a
concentração de amônia disponível, ou seja, quando baixa (como na fixação de
nitrogênio) o sistema principal em atuação seria o GS-GOGAT e quanto mais
elevada, passaria a predominar a catálise pela GDH. E essa questão é relevente do
ponto de vista bioenergético e de processo, pois quando GDH atua não há gasto de
ATP e pode-se obter, no máximo, 28,8 g cel/mol de ATP gerado pela fonte de
carbono e quando GS-GOGAT é o sistema atuante há um gasto de 1 mol de ATP por
mol de NH4+ incorporado e o valor máximo de YATP que se pode esperar é de 23,1 g
cel por mol de ATP (Stouthamer, 1978).
Em relação à produção de aminoácido a partir amônia como fonte de
nitrogênio, as etapas iniciais são melhor conhecidas: o metabolismo passa pela
formação de glutamato , quer pela degradação direta do aminoácido através das rotas
bioquímicas já conhecidas (Lehninger, 2004) ou por reações de transaminação, pela
adição de grupo amino ao ácido α - cetoglutarato, numa reação exatamente inversa à
de nº 4 da figura 3.2.
Quando os aminoácidos são usados não só como fonte de nitrogênio, mas
também como fonte de carbono e energia, há necessidade de formação ou ativação
de sistemas enzimáticos específicos que nem sempre estão presentes quando as
fontes de carbono e energia são açúcares ou ácidos orgânicos (Tyler, 1978; Castillo
and Mora, 2000) e isto pode atrasar o anabolismo, introduzindo “lags” no
crescimento celular.
Deve-se mencionar ainda que no caso de ocorrer suprimento de misturas de
aminoácidos, alguns deles poderão ser usados diretamente pelo anabolismo,
enquanto outros entrarão nas reações de transaminação para formação de glutamato
(e glutamina). Os aminoácidos que são usados diretamente dispensam a ativação dos
sistemas enzimáticos específicos e isto, além de acelerar o metabolismo, ainda
3 Fontes de Nitrogênio 40
aumenta o aproveitamento dos compostos e da energia disponível, o que torna
potencialmente interessante a utilização de extrato de levedura e outros suplementos
protéicos.
3 Cultivo descontínuo alimentado 41
3.3 Cultivo descontínuo alimentado
Os cultivos descontínuo-alimentado são empregados quando se pretende
obter determinadas concentrações celulares (ou de algum metabólito) que demandam
quantidades de substratos que provocariam inibição do crescimento num cultivo
descontínuo comum (“batch”).
O processo consiste em começar o cultivo no fermentador como se fosse um
processo descontínuo comum. A partir do momento em que um ou mais substratos
atinjam concentrações que limitem o crescimento celular (ou produção de um
metabólito), inicia-se a suplementação destes substratos (previamente preparados e
esterilizados) ao meio. A alimentação é feita através de uma ou mais bombas, que
podem ter vazão constante ou, preferencialmente, vazão variável que acompanhe a
velocidade de demanda dos substratos pelo microrganismo. O processo é
interrompido quando se atinge a capacidade volumétrica máxima do fermentador, ou
antes, se o resultado esperado foi alcançado (Schimidel et al, 2001).
Neste processo, a concentração dos subtratos limitantes no fermentador deve
ser mantida sempre num valor baixo, que não provoque limitação. É a adição
contínua que vai garantir o suprimento constante de substrato, necessário ao bom
desempenho microbiano (Yamane & Shimizu, 1984). Através deste processo,
podem-se atingir concentrações celulares elevadas, impossíveis de ser obtidas nos
cultivos descontínuos comuns.
4 Objetivos 42
4. Objetivos
Este trabalho tem por objetivo geral o estudo do cultivo de A. brasilense e A.
lipoferum no sentido de se contribuir para o estabelecimento das bases tecnológicas
para a produção industrial de inoculantes, através da escolha das fontes de carbono e
nitrogênio mais promissoras do ponto de vista industrial e fornecer subsídios para o
estabelecimento de protocolos de produção de biomassa destas bactérias a alta
densidade celular.
5 Materiais e métodos 43
5. Materiais e métodos
5.1 Microrganismo
Foram utilizadas as linhagens de Azospirillum brasilense Sp7 e Azospirillum
lipoferum Br 17 gentilmente cedidas pela Dra. Vera Lúcia Baldani do Centro
Nacional de Pesquisas em Agrobiologia, da Embrapa, em Seropédica, RJ. As
linhagens eram mantidas na coleção de microrganismos do IPT por liofilização e/ou
criopreservação em freezer a -80ºC e em meio sólido NFB que continha L-malato e
NH4Cl como fontes de carbono e nitrogênio, respectivamente.
5.2 Meios de Cultura
5.2.1 Soluções-estoque
Para o preparo de diferentes meios de cultura eram utilizadas as soluções-
estoque relacionadas a seguir (todas as porcentagens são em massa/volume):
II –– solução de MgSO4.7H2O a 10%;
IIII –– solução de NaCl a 10%;
IIIIII –– solução de CaCl2.2H2O a 1%;
IIVV –– solução de Fe EDTA a 1,64%;
VV –– solução de micronutrientes
VVII –– solução alcoólica de azul de bromotimol a 5%; (solução 0,5% em 0,2N KOH)
VVIIII –– solução de vitaminas.
A solução de Fe EDTA foi preparada misturando-se 16,0 g de Na2 EDTA (sal
di-sódico do ácido etileno diaminotetra-acético) com 11,95 g de FeSO4.7H2O e 950
5 Materiais e métodos 44
mL de água, aquecendo-se até dissolução e, após resfriamento, completando-se o
volume até 1,0 litro.
A - A solução de micronutrientes continha, por litro: (Döbereiner, 1995):
0,04 g CuSO4.5H2O;
1,20 g ZnSO4.7H2O;
1,40 g H3BO3;
1,00 g Na2MoO4.2H2O
1,175 g MnSO4.H2O.
B – A solução de vitaminas continha: (Döbereiner, 1995)
10 mg biotina
20 mg piridoxol-HCl
A solução era dissolvida em banho-maria e completada o volume para 100
mL com água destilada, em seguida era filtrada e mantida a solução em geladeira.
5.2.2 Solução salina
Para diluição do inóculo foi utilizada solução salina com a seguinte
composição, por litro: (Döbereiner, 1995)
3,4 g KH2PO4;
2,0 mL da solução de MgSO4.7H2O a 10%;
1,0 mL da solução de NaCl a 10%;
2,0 mL da solução de CaCl2.2H2O a 1%;
2,0 mL da solução de micronutrientes;
4,0 mL Fe EDTA (solução 1,64%);
4,5 g KOH
O pH desta solução foi ajustado para 7,0 com KOH.
5 Materiais e métodos 45
5.2.3 Meio de cultura para conservação do Microrganismo
A partir dos liófilos armazenados foram preparados tubos com meio de
cultura NFb sólido e incubação em estufa a 30ºC. A composição do meio é a
seguinte:
5 g de ácido málico;
0,5 g de K2HPO4;
1,0 g de Extrato de Levedura;
2,0 mL da solução de MgSO4.7H2O a 10%;
1,0 mL da solução de NaCl a 10%;
2,0 mL da solução de CaCl2.2H2O a 1%;
2,0 mL de solução de micronutrientes;
2,0 mL de solução alcoólica de azul de bromotimol a 5%;
4,0 mL de solução de Fe EDTA a 1,64%;
1,0 mL de solução de vitaminas;
4,5 g de KOH;
15 g de agar-agar.
No preparo do meio adicionavam-se as substâncias na ordem indicada e
ajustava o pH para 6,8 utilizando-se solução de NaOH e completava o volume para
1000 mL com água destilada.
A cultura foi transferida a erlenmeyer contendo o meio citado, com exceção
do agar, em agitador rotativo a 200 rpm e 30ºC por 72 horas. Após o cultivo foi
preparada uma solução a 50% de glicerol (p/v) para ser adicionada à cultura crescida.
Posteriormente, 0,5 mL da solução de glicerol 50% e 0,5 mL do meio NFb foram
dispostos em tubos Eppendorfs estéreis e levados ao freezer à -80ºC.
5 Materiais e métodos 46
5.2.4 Meios de cultura sólido para preparo do inóculo
Pré-inóculo: Um tubo Eppendorf contendo as cepas de Azospirillum spp
foram crescidas em meios sólido que consistiram de Agar nutriente (AN), Luria
Bertani (LB), Agar de Soja-Triptona (TSA), Agar Potato Dextrose (PDA) e NFb (já
descrito no item anterior) para averiguação da adaptação e crescimento por 5 dias em
estufa a 30ºC.
Inóculo: Baseado nos resultados da etapa anterior selecionou-se entre os
meios sólidos testados suas respectivas formulações líquidas para preparação dos
inóculos.
5.2.5 Meios de cultura líquidos
Foram utilizados meios de cultura nos ensaios em incubador rotativo e reator
com as fontes de carbono e nitrogênio selecionadas. A composição básica de todos
os meios, que será identificado como meio F, era composto de: (Dias, 1988).
2,64 g K2HPO4;
2,0 mL da solução de MgSO4.7H2O a 10%;
1,0 mL da solução de NaCl a 10%;
2,0 mL da solução de CaCl2.2H2O a 1%;
4,0 mL da solução solução de Fe EDTA a 1,64%;
5,0 Fonte de C selecionadas (frutose, sacarose, glicerol, lactato e etanol);
1,0g Extrato de Levedura;
1,32g (NH4)2HPO4/NH4Cl;
água filtrada ... qsp 1000 mL
5 Materiais e métodos 47
Todos os meios de cultura tiveram seu pH ajustado para 6,8 e foram
esterilizados a 121ºC por 30 minutos. A frutose, a sacarose, o glicerol e o lactato
foram esterilizados em separado, o etanol foi devidamente filtrado com filtro estéril e
posteriormente adicionadas ao meio no momento da inoculação.
Averiguação do crescimento aeróbio de Azospirillum brasilense e
Azospirilum lipoferum em meio mínimo que continha respectivamente por litro
(Martinez & Burris, 1983):
4,0 g KH2PO4;
6,0 g K2HPO4;
0,2 g MgSO4.7H2O;
0,1 g NaCl;
0,026 g CaCl2.2H2O;
1,0 g NH4Cl;
0,01 g FeCl3;
0,002 g Na2MoO4.2H2O;
0,001 g biotina;
9,72 g sacarose (pH 6,8)
5.3 Ensaios em incubador rotativo
5.3.1 Equipamento
Foram utilizados incubadores rotativos, com controle de temperatura por
circulação de ar aquecido e freqüência de agitação ajustável.
5 Materiais e métodos 48
5.3.2 Preparo do Pré-inóculo
Foi retirado da cultura estoque mantida em freezer à -80ºC, inoculado em
meio CN (3g Extrato de carne e 5g de Peptona bacteriológica por litro) em frascos
erlenmeyer de 125 mL e colocado em agitador rotativo a 200 rpm e 30ºC, com os
seguintes tempos de incubação: A. brasilense, 40 horas; A. lipoferum, 18 horas.
5.3.3 Preparo do inóculo
Em seguida, cerca de 10% da suspensão foi transferida para Caldo Nutriente e
incubadas novamente por 24 horas. Em alguns experimentos em biorreator a segunda
passagem foi realizada com meio de cultura com a mesma composição do meio
utilizado no ensaio.
5.3.4 Inoculação dos frascos
Todos os ensaios em incubador rotativo foram feitos com frascos erlenmeyer
de 250 mL contendo 50 mL de meio de cultura (meioF). A inoculação de cada um
dos frascos era feita com 10% da suspensão bacteriana preparada e padronizada
como anteriormente descrito.
5.3.5 Incubação e amostragem
Os frascos eram incubados à temperatura constante de 30ºC, com velocidades
de 200 rpm. A amostragem era feita retirando-se, de tempos em tempos, um frasco
de erlenmeyer do incubador.
5 Materiais e métodos 49
5.3.6 Determinações efetuadas
Em cada amostra dos ensaios de incubador rotativo foram determinados;
- pH;
- absorbância celular;
- a concentração celular (massa seca e em termos de número de unidades f
ormadoras de colônias em placas/mL);
- consumo da fonte de carbono (frutose, sacarose, etanol, lactato e glicerol);
- consumo do nitrogênio inorgânico;
- consumo de fósforo.
5.4 Ensaios em fermentador, processo descontínuo
5.4.1 Equipamento
Foram utilizados biorreatores New Brunswick Scientific de 5 L de volume
para os ensaios em batelada e o Biostat Braun ED de 10 L de volume útil, que
permitia o controle da freqüência de agitação, de vazão de ar, temperatura e oxigênio
dissolvido e monitorava automaticamente o pH por adição de solução de HCl ou
NaOH 2N.
A esterilização do meio de cultura, do fermentador, e dos filtros de ar e frasco
com anti-espumante e soluções controladoras de pH era efetuada por autoclavação a
121ºC por 40 minutos. Para o cultivo em alta densidade celular foi utilizado
biorreator.
5 Materiais e métodos 50
5.4.2 Preparo do inóculo
O inoculo de um ensaio descontínuo constituía-se de microrganismos
cultivados em incubador rotativo, segundo a seqüência descrita no item 5.3.2 e 5.3.3,
utilizando-se erlenmeyers de 2 litros com 500 mL de meio utilizado no fermentador.
5.4.3 Inoculação do Fermentador
A inoculação do fermentador era feita com de 24 horas para A. brasilense e
de 18 horas para A. lipoferum.
O volume de inoculo era cerca de 10% do volume total no fermentador.
5.4.4 Amostragem
Para possibilitar a coleta de amostras de forma asséptica, foram utilizados
tubos de ensaios estéreis e auxílio do bico de Bunsen.
5.4.5 Determinações efetuadas
Durante o cultivo são retiradas, em periodicidade e volumes
previamente definidos, amostras assépticas e não-assépticas. As assépticas destinam-
se à avaliação da concentração de unidades formadoras de colônias e a amostra não
asséptica para outras determinações representado na Figura 5.1.
5 Materiais e métodos 51
Figura 5.1 - Esquema da metodologia analítica utilizada no tratamento das amostras.
5.5 Métodos de Análises Físicas, Químicas e Microbiológicas
5.5.1 Determinação da Absorbância (A)
Foi determinada diretamente no caldo fermentado dos cultivos em
incubador rotativo e em fermentador.
A leitura foi feita em espectrofotômetro Thermoelectric cell Holder (U-
2001) modelo 131-0307 no comprimento de onda de 540nm. Como “branco”,
utilizou-se água destilada. A leitura foi realizada na faixa de 0,01 a 0,7 de
absorbância. Quando superior, dilui-se a amostra o número de vezes necessárias.
5 Materiais e métodos 52
5.5.2 Concentração Celular Mássica (X)
Para efetuar a determinação da concentração celular centrifugava-se a 4ºC um
volume adequado do caldo a 9800 xg durante 10 minutos.
Separava-se o sobrenadante, ressuspendia-se o centrifugado em pequeno
volume de água destilada e filtrava-se a suspensão através da membrana Millipore
(diâmetro de poro de 0,45 ųm), previamente pesada.
O resíduo em conjunto com o filtro era colocado em estufa a 105ºC por 4
horas (tempo sulficiente para obter peso constante). Decorrido esse período,
transferia-se o conjunto para um dessecador e, quando frio (após aproximadamente
15 minutos), procedia-se a pesagem.
5.5.3 Concentração de Unidades Formadoras de Colônias em placas (UFC)
A contagem de unidades formadoras de colônias em placas foi realizada
segundo o método de Miles & Misra (1938). As amostras foram convenientemente
diluídas e gotas de 25 µL cada foram semeadas em meio AN (Agar nutriente). Após
incubação por 48 horas, em estufa a 30ºC, obteve-se a média da contagem de 9 gotas
para cada ponto obtido, exprimindo-se os resultados em UFC/mL de amostra.
5.5.4 Concentração de Frutose, Sacarose, Etanol, Glicerol e Lactato ((SS))
As concentrações de frutose, sacarose, lactato foram determinadas por
cromatografia de fase líquida (HPLC – Waters 510) equipado com uma coluna para
determinação de açúcares. Um volume de µL do sobrenadante da amostra era
injetado no equipamento. E para a determinação de etanol, foi utilizado
Cromatógrafo a gás (HP 5840-A) equipado com detector de ionização por chama de
5 Materiais e métodos 53
hidrogênio, injetor tipo split/splitless e forno com capacidade de realizar de
programação de temperatura. Para o preparo da curva de calibração foram preparadas
soluções padrões contendo diferentes concentrações (% em massa) utilizando o n-
butanol como solvente. As soluções preparadas devem estar numa faixa de
concentrações que normalmente são encontradas nas amostras. Identificados os picos
de etanol, de acordo com o cromatograma padrão anexo, obteve-se as respectivas
áreas. Criou-se uma curva de calibração, colocando no eixo das abscissas os valores
das relações de área e, no eixo das ordenadas os valores de concentração dos
respectivos componentes nas soluções.
Para determinação da concentração de glicerol, foi realizado conforme o
método IPT/DQEQ (1982), determinação de glicerol por oxidação de periodato de
sódio.
a - Pesava-se uma alíquota (filtrada da determinação da massa seca ou sobrenadante
da centrifugação) em pés-filtro ou béquer pequeno, segundo a tabela 5.2:
Tabela 5.2 Concentração de glicerol em g/L na amostras.
Concentração esperada de Glicerol na amostra (g/L) Peso da alíquota (g)
8 – 10 5
5 – 8 10
2 – 5 15
< 2 20
b – Transferia a amostra a um béquer de 300 mL, lavando-se algumas vezes com
água destilada o recipiente usado para a pesagem da amostra;
c – Diluia-se a amostra a 50 mL;
d – Adicionava-se H2SO4 0,2N até que o pH se tornasse iguala 3,0;
5 Materiais e métodos 54
e – Em seguida, adicionava-se NaOH 0,05 N até que o pH atingisse o valor 8,1 ± 0,1
(no final, usava NaOH 0,005 N para facilitar este acerto);
f – Preparava-se um branco contendo 50 mL de água destilada e procedia ao mesmo
ajuste de pH;
g – Adicionava-se 10 mL de solução de periodato de sódio (obtida dissolvendo-se 60
g de NaIO4 em água destilada contendo 120 N de H2SO4 0,1 N e diluído a 1 L),
agitava-se o conteúdo para homogenizar, cobria com vidro de relógio e deixava em
repouso por 30 minutos, no escuro, a temperatura inferior a 35ºC;
h – Adicionava 2 mL de solução de etilenoglicol 50% e deixava por 20 minutos;
i – Diluia a a proximadamente 100 mL e titulava com NaOH aproximadamente 0,125
N (normalidade perfeitamente conhecida), usando medidor de pH, até pH 6,5 para
branco e Ph 8,1 ± 0,1 para a amostra. Perto do ponto final, colocava-se 1 gota ou
fração de gota de cada vez;
j – Cálculo:
% glicerol = mNVbVa 20959,**)( −
onde: Va = volume de NaOH gasto na titulação da amostra (mL);
Vb = volume de NaOH gasto na titulação do branco (mL);
N = normalidade do NaOH;
m = massa da alíquota da amostra (g)
5.5.5 Avaliação da concentração de nitrogênio amoniacal
O método permite a determinação de nitrogênio na forma de amônio via
eletrodo específico (Orion ammonia gas-sensing electrod, Model 95-12) através da
conversão de amônio a amônia.
5 Materiais e métodos 55
Esse eletrodo é constituído por uma membrana hidrofóbica gás-permeável
que separa a solução de amostra da sua solução interna. A amônia dissolvida na
amostra difunde-se através da membrana até que as pressões parciais do lado interno
e externo à membrana se igualem. A pressão parcial de amônia será proporcional á
concentração presente na amostra.
Preparo das amostras:
Devem ser preparadas curvas de calibração com solução-padrão de sulfato de
amônio em diferentes concentrações a cada lote de amostras a serem analisadas.
Amostras e soluções-padrão devem ser analisadas sempre à mesma temperatura.
Procedimento analítico:
(1) Adiciona-se 0,2 mL de NaOH de solução 10 N em 2,0 mL de amostra
(sobrenadante do centrifugado) ou solução-padrão, no momento da leitura. Com esse
procedimento o amônio presente na solução passa a forma de amônia, sendo então
determinado;
(2) Amostras e padrões são agitados com agitador magnético;
(3) As leituras são realizadas no condutivímetro (Procyon Model AS 720), em
milivolt, a cada 30 segundos, até que a corrente se estabilize;
(4) O eletrodo deve ser lavado com água destilada entre as medidas de uma
amostra e outra e colocado em uma solução de descanso (solução-padrão 10 ppm);
(5) A concentração de amônio é calculada segundo a curva de calibração obtida
com as soluções-padrão.
5.5.6 Avaliação da concentração de fósforo
O método do ácido ascórbico determina o in fosfato (PO4) contido na amostra
por análise colorimétrica (Franson, 1998).
5 Materiais e métodos 56
Para efetuar o procedimento do método do ácido ascórbico é necessário
preparar os seguintes reagentes:
1. H2SO4 5 N – Diluir 70 mL de ácido sulfúrico concentrado em 500 mL de
água destilada;
2. Tartarato de antimônio e potássio – Dissolver 1,3715 g do sal em 400 mL de
água destilada, elevar o volume para 500 Ml. Acondicionar em frasco de vidro.
3. Molibdato de amônio – Dissolver 20 g do sal em 500 mL de água destilada.
(Acondicionar em frasco de vidro).
4. Ácido ascórbico 0,1 M – Dissolver 1,76 g de ácido ascórbico em 100 mL de
água destilada. (A solução fica estável por uma semana à 4ºC).
Em seguida, prepara-se o reativo utilizando as soluções descritas acima:
Para obter 100 mL do reativo prepara-se: 50 mL do reagente 1;
5 mL do reagente 2;
15 mL do reagente 3;
30 mL do reagente 4.
Deve-se preparar o reativo à temperatura ambiente. (Esta mistura é estável
por um período de 4 horas).
Na solução padrão (0,15 a 1,30 mg/L de P) deverá dissolver 219,5 mg de
K2HPO4 anidro em 1000 mL de água destilada e assim prepara-se os padrões por
diluição (1:0; 1:2; 1:4; 1:6; 1:8 e 1:10).
Procedimento para análise colorimétrica:
(1) Prepara-se 200 µL de amostra ou padrão ou água destilada (branco);
(2) Adiciona-se 4,9 Ml de água destilada e deionizada no tubo contendo o item 1;
(3) Adiciona-se 800 µL do reativo;
(4) Incuba-se por 10 minutos;
5 Materiais e métodos 57
(5) Efetua-se as leituras a 880 nm em durante;
(6) Calcular a concentração de Fósforo em mg/L segundo a curva de calibração
obtida com as soluções-padrões.
5.6 Cálculo dos parâmetros cinéticos
Os parâmetros cinéticos µmax (velocidade específica máxima de crescimento) e
os fatores de conversão substrato a células, nitrogênio a células, respectivamente
YX/S, YX/N e produtividade de biomassa Px foram calculados conforme Hiss, (2001) e
Carvalho e Sato, (2001).
Determinou-se um tempo “final” (tf) em que a concentração celular mássica era
máxima ou que fonte de carbono estava esgotada, e em relação a esse tempo
calcularam-se os fatores de conversão e produtividade, pela equações a seguir:
Fator de conversão de substrato em células (YX/S)
(1)
onde: Xf = concentração celular final (g/L);
XO = concentração celular inicial (g/L);
So = concentração da fonte de carbono inicial (g/L);
Sf = concentração da fonte de carbono final (g/L).
Fator de conversão de nitrogênio em células (YX/N)
(2)
onde: NO = concentração de nitrogênio amoniacal inicial (g/L);
Nf = concentração de nitrogênio amoniacal final(g/L).
5 Materiais e métodos 58
Produtividade celular mássica
(3)
onde: tf = tempo para consumo da fonte de carbono (h).
A velocidade específica máxima de crescimento celular (µmax)
Para determinar a fase de crescimento exponencial, foram traçadas curvas de
ln(X) (logaritmo neperiano da massa de célula) em função do tempo. Após traçadas
as curvas, notou-se que os pontos podia, ser correlacionados por uma reta e com isso
foi possível obter o µmax (velocidade específica de crescimento), através de uma
regressão linear (o coeficiente angular da correlação linear era o valor utlizado),
segundo a equação (4):
lnX = µmax . t (4)
Xo
5.7 – Experimentos realizados e nomenclatura dos ensaios
Para estudar o crescimento de Azospirillum ssp em diversas fontes de carbono
e nitrogênio, em dois sistemas de cultivo, foram desenvolvidos 27 experimentos para
A. brasilense e 22 para A. lipoferum.
O nome de cada ensaio é composto por cinco letras e um número: as duas
primeiras letras (Az) indicam a abreviação da palavra Azospirillum e as duas
seguintes (br ou lp) o organismo que participa no ensaio e a última letra (S ou F)
demonstra o processo/equipamento utilizado; o número é seqüencial por tipo de
ensaio (Tabela 5.1).
5 Materiais e métodos 59
Tabelas 5.2 Experimentos realizados para o estudo do crescimento de A. brasilense Sp7 e A. lipoferum Br 17 e ensaios componentes de cada experimento.
Experimento Ensaios Fonte de Carbono Fonte de Nitrogênio Tempo de ensaio (h) Título
Azbr01 (S) (NH4)2HPO4
E1 Azbr02 (S) Frutose NH4Cl 120,0
Azbr03 (S) (NH4)2HPO4
E2 Azbr04 (S) Glicerol NH4Cl 120,0
Azbr05 (S) (NH4)2HPO4
E3 Azbr06 (S) Sacarose NH4Cl 120,0
Azbr07 (S) (NH4)2HPO4
E4 Azbr08 (S) Lactato NH4Cl 120,0
Azbr09 (S) (NH4)2HPO4
E5 Azbr10 (S) Etanol NH4Cl 120,0
Azlp01 (S) (NH4)2HPO4
E6 Azlp02 (S) Frutose NH4Cl 120,0
Azlp03 (S) (NH4)2HPO4
E7 Azlp04 (S) Glicerol NH4Cl 120,0
Azlp05 (S) (NH4)2HPO4
E8 Azlp 06 (S) Sacarose NH4Cl 120,0
Azlp07 (S) (NH4)2HPO4
E9 Azlp08 (S) Lactato NH4Cl 120,0
Azlp09 (S) (NH4)2HPO4
E10 Azlp10 (S) Etanol NH4Cl 120,0
Influ
ênci
a da
con
cent
raçã
o da
s fon
tes d
e Ca
rbon
o e
Nitr
ogên
io so
bre
o cr
esci
men
to m
icro
bian
o.
E11 Azlp01 (F) Sacarose (NH4)2HPO4 7,5
E12 Azlp02 (F) Glicerol (NH4)2HPO4 11,0
Azbr01(F) 15,0
Azbr02 (F) 13,0
E13 Azbr03 (F) Frutose (NH4)2HPO4 13,0
Azbr04 (F) 18,0
E14 Azbr05 (F) Glicerol (NH4)2HPO4 37,0
Azbr06 (F) 26,0
E15 Azbr07 (F) Etanol (NH4)2HPO4 12,0
Det
erm
inar
qua
is da
s fon
tes
de C
e N
é m
elho
r do
pon
to
de v
ista
de
proc
esso
e d
o
pont
o de
vis
ta e
conô
mic
o.
(S) = shaker e (F) = Fermentador Obs:. Todos os ensaios em incubador rotativo foram feitos em duplicata.
6 Resultados e Discussão
60
6. Resultados e Discussão
6.1 Meios sólidos
Os resultados obtidos após incubação por cinco dias, em meio sólido a 30ºC estão
resumidos na tabela 6.1. Dos meios de cultura testados: Agar nutriente (AN), Luria Bertani
(LB) e Agar de Soja-Triptona (TSA) demonstraram colônias bem caracterizadas quanto à
cor, diâmetro, consistência das colônias e excelente crescimento celular para ambas as
linhagens. Entretanto, o meio de cultura que atendeu tanto o critério de maior velocidade de
crescimento e maior quantidade de células quanto aos critérios de disponibilidade e preço,
evitando a utilização de matéria-prima que tenha apenas um único fabricante ou fornecedor
foi o Agar nutriente (AN).
Tabela 6.1 Crescimento das bactérias nos meios sólidos selecionados.
Meio de cultura A. brasilense Sp7 A. lipoferum BR 17
NA +++ +++
LB +++ +++
PDA + +++
TSA +++ +++
NFb ++ ++
Símbolos: +++, excelente crescimento; ++ bom crescimento; + pouco crescimento. Agar nutriente (AN), Luria Bertani (LB), Agar de Soja-Triptona (TSA), Agar Potato Dextrose (PDA) e Novo Fábio Pedrosa. (NFb)
6.2 Fonte de Nitrogênio
A princípio, poder-se-ia empregar amônia, aminoácidos, proteínas e até mesmo
nitrogênio gasoso como fontes desse elemento para o crescimento microbiano, mas deve-se
levar em consideração critérios que se referem à velocidade da produção, aos fatores de
6 Resultados e Discussão
61
conversão, e à facilidade de compatibilização da etapa de crescimento celular com as
demais etapas do processo. A tabela 6.2 apresenta os melhores resultados da seleção
realizada nos ensaios em duplicata em incubador rotativo e suas respectivas biomassas. Das
duas fontes suplementadas ao meio de cultura, NH4Cl, conforme citado por Döbereiner,
(1995) e (NH4)2HPO4 mencionada em Dias, (1988). Os resultados mostram que elas são
equivalentes em termos de crescimento e, por facilidade de preparação já que (NH4)2HPO4
é fornecedor de P ao sistema, este foi o escolhido.
Tabela 6.2 Concentração final de biomassa para as fontes de N testadas (120 h de cultivo)
Ensaios A. brasilense Sp7 A. lipoferum BR17
(NH4)2HPO4/frutose 2,82 g/L 1,58 g/L
NH4Cl/frutose 2,38 g/L 1,27 g/L
(NH4)2HPO4/glicerol 2,20 g/L 1,62 g/L
NH4Cl/glicerol 2,19 g/L 2,04 g/L
(NH4)2HPO4/sacarose 0,89 g/L 2,21 g/L
NH4Cl/sacarose 0,57 g/L 2,19 g/L
(NH4)2HPO4/lactato 2,01 g/L 1,82 g/L
NH4Cl/lactato 1,73 g/L 1,76 gL
(NH4)2HPO4/etanol 1,85 g/L 1,26 g/L
NH4Cl/etanol 1,57 g/L 1,06 g/L
* fontes testadas nos ensaios em incubador rotativo
6.3 Ensaios em incubador rotativo
São apresentados na tabela 6.3 o resumo de todos os resultados obtidos nos ensaios
em incubador rotativo e nas figuras 6.1 a 6.5 as curvas dos resultados destes ensaios, todos
realizados à temperatura de 30ºC e 200 rpm.
6 Resultados e Discussão
62
O principal objetivo destes ensaios foi avaliar a influência das fontes de carbono e
nitrogênio no crescimento de Azospirilla e nos correspondentes fatores de conversão e
produtividade.
6.3.1 Frutose
O desenvolvimento das bactérias do gênero Azospirillum utilizando frutose como
principal fonte de carbono, apresentaram-se bem caracterizado.
Nos ensaios em duplicata em Azbr01, Azbr02, Azlp01 e Azlp02, utilizando fontes
de nitrogênio diferentes (NH4)2HPO4 e NH4Cl) pôde-se observar que antes de completar 24
horas de ensaio, as células iniciavam uma fase de aumento da concentração celular que era
acompanhada pelo decréscimo da concentração de frutose e de nitrogênio. Esta fase de
crescimento terminou quando a concentração de C limitante. Nos ensaios utilizando
(NH4)2HPO4 com A. brasilense Sp7 observou-se um pequeno decréscimo no pH até o final
dos ensaios. Já para o NH4Cl usando o mesmo organismo, há aumento do pH a partir de
100 horas de ensaio, em resposta à liberação de íons fosfato (a parte não foi utilizada pelas
bactérias) pelo consumo de amônia e por conseqüência da lise celular, que libera N protéico
para o meio. Houve consumo de nitrogênio e frutose em ambas e não se percebe o
crescimento subseqüente a partir de aproximadamente 30 horas de ensaio (Figuras 6.1).
Deve-se salientar que foi observado a formação de flocos, sendo mais intensa quando maior
o tempo do ensaio.
6 Resultados e Discussão
63
6.3.2 Glicerol
Uma primeira característica de todos os cultivos com glicerol foi um período de
crescimento celular com baixo consumo de N presente no meio de cultura. Esse período foi
acompanhado por valores de pH constantes ou ligeiramente ascendentes. Quando se iniciou
o consumo de nitrogênio inorgânico, o pH decresceu. Não se verificou o aparecimento de
duas fases exponenciais de crescimento nos ensaios utilizando glicerol e extrato de
levedura. Mas também houve o consumo de nitrogênio e glicerol sem o crescimento
subseqüente. Foi observado o aparecimento de flocos (Figuras 6.2). Para o glicerol obteve-
se o dobro dos valores dos fatores de conversão e das produtividades de A. brasilense Sp7
em relação a A. lipoferum Br 17 (Tabela 6.4).
6.3.3 Sacarose
Para averiguar o crescimento de Azospirillum utilizando sacarose como fonte de
carbono, o meio de cultura (MM), descrito na página 46, foi preparado e inoculado com as
A. brasilense e A. lipoferum e concluíram que ambas as linhagens não crescem utilizando
sacarose como fonte de carbono.
Os resultados confirmaram que Azospirillum realmente não cresce no meio mínimo
proposto, por ser um meio pobre, não contêm os nutrientes necessários para a mesma
desenvolver-se adequadamente. Levando-se essas informações em consideração, foi
acrescentado ao meio mínimo (MM), extrato de levedura, numa concentração pré-
determinada (0,075 g/L). Observou-se que para o crescimento sem fixação de nitrogênio,
nas temperaturas de 30 ou 35ºC, há necessidade da adição de extrato de levedura ao meio
de cultura, sendo ele provavelmente um dos nutrientes essenciais que age em conjunto com
os outros componentes para o desenvolvimento da bactéria. Constatou-se que a introdução
do estrato de levedura no meio propiciou o crescimento apenas de A. lipoferum BR17.
6 Resultados e Discussão
64
Para os ensaios com sacarose, as linhagens crescidas em meio F, foram obtidos
resultados desfavoráveis para A. brasilense Sp7, pois a concentração celular encontrada foi
baixa (0,3 g/L) e em momento algum do ensaio as fontes de carbono e nitrogênio foram
consumidas, implicando, conseqüentemente, em uma baixa produtividade (0,006 g/L.h),
dado apresentado na tabela 6.3. Entretanto, para A. lipoferum Br 17, obteve-se um
excelente crescimento celular, acompanhada pelo decréscimo da concentração das mesmas
fontes. A concentração de sacarose, glicose e frutose determinada por cromatografia de fase
líquida (HPLC) (resultados não apresentados), mostraram o consumo total deste substrato
antes de atingir 24 horas de ensaio. Ao contrário, para A. brasilense, em todas as amostras
analisadas, a concentração de sacarose permeneceu constante, e a concentração de glicose e
frutose não aparecem. Por ser um carboidrato, o decréscimo do pH ao longo do cultivo
pode ter ocorrido pela mesma razão verificada em frutose (Figura 6.3). Notou-se ainda,
mudança de cor e formação de flocos.
6.3.4 Lactato
Na utilização de sais de ácidos orgânicos (lactato) como fonte de carbono, a
tendência do pH foi aumentar em decorrência à liberação de íons de sódio que libera N
protéico para o meio. Como demonstrado nos ensaios, alterou-se o pH de 6,8 para 9,0 não
prejudicando, aparentemente, o crescimento celular ou o consumo dos substratos (Figuras
6.4). Em A. brasilense, os ensaios suplementados com DAP (diamônio-fosfato), o lactato
foi consumido mais rapidamente quando comparada a A. lipoferum. Metabolicamente o
lactato é convertido em piruvato e são utilizados como fonte de energia, acelerando o
consumo do substrato nesta bactéria.
Nos ensaios observou-se a formação de flocos.
6 Resultados e Discussão
65
6.4.5 Etanol
É possível que as linhagens não tenham se adaptado ao meio de cultura que
continha etanol como única fonte de carbono. Pela análise da variação dos parâmetros
obtidos, pode-se observar que houve diferenças significativas para fatores de conversão,
produtividade e a diferença nos pHs apresentados na Tabela 6.3 para a interação entre os
fatores linhagens e substrato.
O crescimento de A. brasilense Sp7 foi superior à outra linhagem, obteve
concentração celular final de 2,0 g/L e pH 6,0. Já A. lipoferum BR 17, apresentou
comportamento diferente, onde o pH final foi 7,6 e concentração celular
consideravelmente baixa (1,030 g/L), e os devidos comportamentos durante os ensaios
estão representados nas figuras 6.5. Sabe-se que quanto maior o valor do pH, maior será a
degradação dos nutrientes contidos no meio, e nesses ensaios ocorre aumento do pH. O fato
dos ensaios durarem 120 horas, com agitação e temperatura definidas, também é um fator
que auxilia na degradação dos nutrientes, assim, soluções de DAP, nas mesmas condições
foram utilizadas como teste para averiguar o grau de degradação de N num período de 5
dias. E após análises de nitrogênio amoniacal, constatou-se que a solução inicial continha
0,5 g/L de Nitrogênio inorgânico enquanto que a solução final tinha apenas 0,2 g/L, sem
que se tenha consumo pelas bactérias. Observou-se em A. brasilense, o consumo de
carbono associado ao crescimento celular quando utilizado DAP na composição do meio de
cultura, sendo que ocorre limitação desta fonte a partir das 40 horas de ensaio. E o consumo
de nitrogênio não associado ao crescimento celular para ambas as linhagens.
6 Resultados e Discussão
66
(NH4)2HPO4 NH4Cl
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
g/L
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
g/L
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
g/L
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
g/L
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
g/L
0,001,002,003,004,005,006,007,008,00
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
pH
0,001,002,003,004,005,006,007,008,00
0 20 40 60 80 100 120 140t empo ( h)
p H
Figura 6.1 Evolução das concentrações de Biomassa, Frutose, Nitrogênio Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E1 (Azbr01a (♦) e Azbr01b (■)) e E6 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitador rotativo.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
g/L
Frutose
Nitrogênio Amoniacal
Biomassa
6 Resultados e Discussão
67
(NH4)2HPO4 NH4Cl
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
(g/L)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
(g/L)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
g/L
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
g/L
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
g/L
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
g/L
0,001,002,003,004,005,006,007,008,00
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
pH
0,001,002,003,004,005,006,007,008,00
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
pH
Figura 6.2 Evolução das concentrações de Biomassa, Glicerol, Nitrogênio Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E2 (Azbr01a (♦) e Azbr01b (■)) e E7 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitador rotativo.
Biomassa
Glicerol
Nitrogênio Amoniacal
6 Resultados e Discussão
68
(NH4)2HPO4 NH4Cl
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
(g/L)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
(g/L)
0,01,02,03,04,05,06,0
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
(g/L)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
(g/L)
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
(g/L)
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
(g/L)
0,001,002,003,004,005,006,007,008,00
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
pH
0,001,002,003,004,005,006,007,008,00
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
pH
Figura 6.3 Evolução das concentrações de Biomassa, Sacarose, Nitrogênio Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E2 (Azbr01a (♦) e Azbr01b (■)) e E7 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitador rotativo.
Biomassa
Sacarose
Nitrogênio Amoniacal
6 Resultados e Discussão
69
(NH4)2HPO4 NH4Cl
0,00,51,01,52,02,53,0
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
(g/L)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
(g/L)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
(g/L)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
(g/L)
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
(g/L)
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
(g/L)
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
pH
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
pH
Figura 6.4 Evolução das concentrações de Biomassa, Lactato, Nitrogênio Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E2 (Azbr01a (♦) e Azbr01b (■)) e E7 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitador rotativo.
Biomassa
Lactato
Nitrogênio Amoniacal
6 Resultados e Discussão
70
(NH4)2HPO4 NH4Cl
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
(g/L)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
(g/L)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
(g/L)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
(g/L)
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
(g/L)
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
(g/L)
0,01,02,03,04,05,06,07,08,0
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
(g/L)
0,01,02,03,04,05,06,07,08,0
0 20 40 60 80 100 120 140tempo (h)
pH
Figura 6.5 Evolução das concentrações de Biomassa, Etanol, Nitrogênio Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E2 (Azbr01a (♦) e Azbr01b (■)) e E7 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitador rotativo.
Biomassa
Etanol
Nitrogênio Amoniacal
6 Resultados e Discussão
71
6.4 Observações gerais
Os flocos formados nestes ensaios eram aproximadamente esféricos e decantavam
quando em repouso. Os flocos tornaram-se visíveis a partir das 6h de cultivo.
Nos ensaios em que houve floculação notou-se também que os meios de cultura e as
células retidas nos filtros apresentavam-se rosadas, denotando a formação de carotenóides.
Esses dois eventos (floculação e formação de carotenóides) foram observados para A.
brasilense cd (Nur & Henis, 1981). Deve-se ressaltar que a hipótese de produção de alguma
substância extracelular poderia explicar a ocorrência de floculação. Em relação aos valores
obtidos nas análises de fósforo, não se observa coerência nos resultados, devido à presença
de carotenóides.
A formação de subprodutos durante o crescimento de Azospirillum não chega a
preocupar. Goebel & Krieg, (1984), demonstraram que os produtos finais do cultivo deste
microrganismo além de CO2 e H2O são apenas alguns ácidos orgânicos, principalmente
acético, lático, glioxálico, málico, 2-oxoglutárico e β-hidroxibutírico; estes ácidos eram
formados em quantidades reduzidas, que consequentemente decrescem o pH e não
apresentavam efeito inibidor no metabolismo bacteriano.
Quase todos os ensaios com residual de substrato superior a 1 g/L indicavam que
possivelmente outro componente do meio de cultura era o limitante, quando não se
observou crescimento celular satisfatório. Esse limitante, entretanto, não era o nitrogênio
inorgânico, como pode ser visto nos resultados apresentados. Pois quando ocorria o
consumo total de substrato consequentemente ocorreu o aumento da concentração celular
final.
Para facilitar as comparações entre os resultados obtidos com substratos diferentes,
diversas grandezas, a tabela 6.3 reúne os valores iniciais e finais de pH, X, S, UFC (unidade
6 Resultados e Discussão
72
formadora de colônias), N, P, os fatores de conversão e a produtividade, para os ensaios em
incubador rotativo com A. brasilense Sp7 e A. lipoferum Br 17.
Para A. brasilense Sp7, foram avaliadas como mais eficientes as seguintes fontes de
carbono: frutose, glicerol, lactato e etanol.
As concentrações celulares e as produtividades nos cultivos com frutose foram
quase sempre superiores às obtidas com as demais fontes de carbono. Os fatores de
conversão de substrato e de nitrogênio em células apresentaram comportamentos distintos
para cada fonte de carbono. Considerando o mesmo tempo de ensaio para as linhagens, os
valores de pH, como pode ser visto na tabela 6.3, apresentam comportamento diferenciado,
ambas decresceram, pois com etanol as variações foram pequenas e suaves, mas com
glicerol e frutose foram bem mais abruptas. Com sacarose, observou-se o não consumo do
substrato, e consequentemente o retardamento do crescimento celular.
Já para A. lipoferum Br 17, foram avaliadas como melhores fontes de carbono em
ordem decrescente, de acordo com os valores numéricos da concentração celular e dos
fatores YX/S, os seguintes substratos: sacarose e glicerol. As demais fontes de C
conduziram os experimentos com resultados insatisfatórios.
Alguns comportamentos foram semelhantes para as fontes de carbono estudadas,
como por exemplo, o consumo de nitrogênio e substrato sem efetuar o crescimento celular.
Provavelmente, o oxigênio atuou como fator limitante, pois os nutrientes (nitrogênio e
substrato), que são consumidos após a velocidade específica de crescimento terem tendido
a zero, devem ter sido utilizadas somente para manutenção celular.
Nos ensaios em incubador rotativo, foram obtidas nas contagens de UFC valores
acima de 109 para ambas as linhagens, diferenciando-se segundo as fontes de carbono
utilizadas. Para A. brasilense utilizou-se frutose (3,22x109), glicerol (2,25x109) e etanol
(2,00x109) e para A. lipoferum, utilizou-se sacarose (3,21x109) e glicerol (1,02x109).
6 Resultados e Discussão
73
Tabela 6.3 - Dados experimentais obtidos nos ensaios com A. brasilense Sp7 e A. lipoferum Br 17 em
1 - Frutose / (NH4)2HPO4; 2 - Frutose / NH4Cl; 3 - Glicerol / (NH4)2HPO4; 4 - Glicerol /NH4Cl; 5 - Sacarose / (NH4)2HPO4; 6 - Sacarose / NH4Cl; 7 - Lactato / (NH4)2HPO4; 8 - Lactato / NH4Cl; 9 - Etanol / (NH4)2HPO4; 10 - Etanol / NH4Cl. Tempo de crescimento, concentrações iniciais e finais de Células (Xo, Xf), Substrato (So, Sf), Nitrogênio (No, Nf), Fósforo (Po, Pf), pH e U.F.C; e Fatores de conversão do substrato (YX/S), de nitrogênio (YX/N) em células e produtividade (PX) para todos os ensaios realizados.
6 Resultados e Discussão
74
6.5 Ensaios em biorreator
Os experimentos foram realizados com o intuito de se estabelecer melhores
condições para a produção de A. brasilense Sp7 e A. lipoferum Br 17 em processo
descontínuo, a partir dos resultados já obtidos em incubador rotativo. Para o processo
industrial deve-se utilizar a concentração inicial de nutrientes que proporcione os maiores
fatores de conversão (que estão associados aos custos dos reagentes e matérias-primas) e
produtividade (que é inversamente proporcional ao tamanho dos equipamentos e aos custos
operacionais) e, no caso dos inoculantes, as maiores concentrações de células viáveis.
Todos os ensaios foram realizados segundo a metodologia descrita no item 9.4, à
temperatura de 30ºC e a uma vazão de ar entre 0,5 e 1,0 L/min de O2 (oxigênio dissolvido),
e aumento da agitação conforme necessidade das bactérias durante o cultivo. Dias (1988),
estudou diferentes concentrações de substrato e concluiu que os meios de cultura com 1,0
g/L de extrato de Levedura, concentrações iniciais de substratos maiores que 11,5 g/L não
seriam vantajosas, pois não aumentariam os fatores de conversão nem a produtividade
celular. Concentrações iniciais de substrato inferiores a 5,2 g/L trariam acentuados
decréscimos na concentração celular final e na produtividade, embora pudessem conduzir a
fatores YX/S bastante elevados. Assim, para programar os ensaios em processo descontínuo,
em fermentador, pôde-se restringir a faixa de experimentação para 5,2 < So < 11,5 g/L para
frutose.
O controle de pH, não foi realizado. Foi adotado esse procedimento levando-se em
consideração que o crescimento bacteriano não é muito sensível à variação de pH, como
pôde ser verificado nos cultivos em agitador rotativo, em que houve crescimento
exponencial para variações de pH bem pronunciadas.
6 Resultados e Discussão
75
A tabela 6.4, resume as condições preliminares dos ensaios realizados em
fermentador.
Tabela 6.4 - Etapas preliminares dos ensaios em fermentador.
Ensaios Pré-inóculo Fonte de Carbono (5 g/L) Inóculo
Azlp01 CN Sacarose MEIO F
Azlp02 CN Glicerol MEIO F
Azbr01 CN Frutose CN
Azbr02 CN Frutose MEIO F
Azbr03 CN Frutose MEIO F
Azbr04 CN Glicerol MEIO F
Azbr05 CN Glicerol CN
Azbr06 CN Etanol CN
Azbr07 CN Etanol MEIO F Meio F: Meio de fermentador CN: Caldo nutriente
Observando-se as variações de oxigênio dissolvido, notou-se um mesmo padrão de
comportamento, ou seja, ao longo dos ensaios a concentração de oxigênio tendia a
decrescer de 10% até 40% de saturação e ao término da fonte de carbono, as bactérias não
tinha o que oxidar e a mesma concentração subia de forma acentuada (dados não
apresentados).
Esse parâmetro poderá, então, ser de grande utilidade no controle do processo
descontínuo, indicando rapidamente o término do crescimento e evitando que o reator fique
em operação com células em estado estacionário ou de declínio.
Tendo em vista que a taxa de respiração para adequar ao fermentador seja
suficiente para atender às necessidades do crescimento da cultura microbiana, faz-se
necessário conhecer a concentração crítica de O2 dissolvido para Azospirilla em cultivo
submerso. Tal & Okon, (1985) concluíram que as bactérias do gênero Azospirillum
6 Resultados e Discussão
76
desenvolvem-se em uma ampla faixa de oxigênio dissolvido (OD). Mas em concentrações
de 0,5 a 0,9 g/L de NH4+
contida no meio de cultura, o crescimento de Azospirillum
lipoferum ficou restringido quando a OD era de 30 µM (cerca de 10% de saturação)
(Tsagou and Aggelis, 2003).
6.5.1 Glicerol
Provavelmente, uma primeira característica muito interessante dos ensaios com A.
brasilense, foi o aumento de NH4+ devido o consumo do extrato de levedura presente no
meio de cultura. No caso do A. lipoferum, no ensaio Azlp02, pode-se afirmar que em todos
os ensaios com glicerol houve um período de crescimento celular (e de consumo de
glicerol) sem que houvesse o decréscimo de N (Figura 6.6).
No ensaio Azbr04 o inóculo utilizado foi preparado com meio F e no ensaio Azbr05
utilizou-se CN (Tabela 6.5). Supõe-se que em Azbr05, o cultivo vindo de caldo nutriente
carreou algum nutriente para o meio fermentador, aparentando uma pequena diferença na
velocidade de crescimento entre um ensaio e outro, pois ao alcançar 18 horas de cultivo, no
ensaio Azbr05 obteve-se 2 g/L de biomassa, enquanto que para Azbr04, o valor obtido foi
de 1,33 g/L.
Verificou-se na figura 6.6 que em Azlp02, A. lipoferum pára de crescer, com 9
horas de cultivo, quando utilizou inóculo crescido em meio F, e quando ocorre decréscimo
do pH juntamente com a queda do Nitrogênio.
Apesar de serem linhagens diferentes, as curvas mostram alguns comportamentos
semelhantes, como a utilização total da fonte de carbono e nitrogênio, o aumento da
absorbância em conseqüência do acúmulo da biomassa, maior variação do pH e menor
tamponamento das soluções.
6 Resultados e Discussão
77
Esses períodos foram acompanhados por valores de pH constantes, ou ligeiramente
ascendentes e quando se iniciava o consumo de nitrogênio o pH decrescia.
É provável que nesse período de concentração constante de nitrogênio inorgânico, o
microrganismo tenha utilizado nitrogênio orgânico presente no extrato de levedura através
das reações da assimilação de aminoácidos e proteínas.
Mais uma vez a floculação pôde ser associada, ainda que de forma qualitativa à
formação de carotenóides, pois os ensaios com maior densidade de flocos eram também os
mais rosados. Entretanto, a floculação não afetou o crescimento celular, embora tenha
interferido nas leituras de absorbância (Tabela 6.6).
Na figura 6.7 foram calculadas as velocidades específicas máximas de crescimento
celular e como se observa não foi obtida duas fases de crescimento exponencial, pois há
consumo simultâneo de ambas as fontes, diferenciando do resultado observado por Dias,
(1988). Este autor concluiu que o aparecimento de duas fases de crescimento nos cultivos
de A. brasilense Sp 245 em glicerol e extrato de levedura não era devido a diauxia, devia-se
ao consumo preferencial de compostos nitrogenados presentes no extrato de levedura.
Uma observação final a respeito dos ensaios com glicerol é que as pequenas
diferenças entre eles parecem provir do uso de inóculo com diferentes concentrações da
composição do meio utilizado no preparo do mesmo.
6 Resultados e Discussão
78
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0 5 10 15 20tempo (h)
Variáveis
0,00,10,10,20,20,30,30,40,40,50,5 N (g/L)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
tempo (h)
Variáveis
0,000,050,100,150,200,250,300,350,400,450,50 N (g/L)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0 5 10 15tempo (h)
Variáveis
0,000,050,100,150,200,250,300,350,400,450,50 N (g/L)
FiGURA 6.6 Evolução das concentrações de biomassa (□); Glicerol (◊); Absorbância ( );
Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em fermentador.
Azbr04 (inóculo = Meio F)
Azbr05 (inóculo = CN)
Azlp02 (inóculo = Meio F)
6 Resultados e Discussão
79
Figura 6.7 Concentração celular LN(X) segundo o tempo de incubação para os ensaios
com Glicerol.
6.5.2 Frutose
Nos ensaios com A. brasilense, o meio de cultura diferenciado no preparo do pré-
inóculo pode ter sido um fator representativo para o crescimento da bactéria em
fermentador, pois os ensaios foram efetuados em condições semelhantes. Para o ensaio
Azbr01, utilizou-se caldo nutriente, em cultivo de 15 horas, resultando a concentração
celular final em 4,01 g/L e consumo total do substrato, diferenciando-se dos resultados
obtidos em Azbr02 e 03 com concentrações finais de 0,6 g/L e 0,69 g/L, houve decréscimo
de N semelhante entre os três ensaios. Comparando-se os valores de pH, nota-se que há
decréscimo no ensaio Azbr01 nos outros dois ensaios, o pH permance praticamente
constante (Figura 6.8).
-2,50-2,00-1,50-1,00-0,500,000,501,001,50
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
tempo (h)
LN(X
)
Azlp02 Azbr05Azbr04
6 Resultados e Discussão
80
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0 5 10 15 20 25 30tempo (h)
Variáveis
0,000,050,100,150,200,250,300,350,400,450,50 N (g/L)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0 5 10 15
tempo (h)
Variáveis
0,000,050,100,150,200,250,300,350,400,450,50 N (g/L)
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
0 5 10 15 20
tempo (h)
Variáveis
0,000,050,100,150,200,250,300,350,400,450,50 N (g/L)
Figura 6.8 Evolução das concentrações de biomassa (□); frutose (◊); Absorbância ( ); Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em fermentador.
Azbr02 – (inóculo = Meio F)
Azbr03 – (inóculo = Meio F)
Azbr01 – (inóculo = CN)
6 Resultados e Discussão
81
Não se conhece muito a respeito da influência do pH sobre os aspectos fisiológicos
e bioquímicos em Azospirillum. De uma maneira, variações de pH podem causar: alterações
nas funções das membranas, modificações no consumo de substrato e no perfil de produtos
metabólicos, alterações na morfologia e estruturas celulares e na floculação e/ou adesão a
superfícies (Forage & Pitt, 1985).
6.5.3 Sacarose
Como os ensaios foram determinados de acordo com os resultados em incubador
rotativo, utilizou-se a fonte de carbono sacarose apenas com A.lipoferum (Figura 6.9), no
qual, utilizou-se o mesmo meio de cultura do fermentador na etapa do pré-inóculo. O tempo
de crescimento para esta linhagem foi de 7,5 horas e obtendo-se um crescimento celular
não muito satisfatório (1,92 g/L), acompanhada pelo decréscimo da concentração do
substrato e de nitrogênio, atingindo-se um valor consideravelmente alto de velocidade
específica máxima de crescimento (0,35 h-1). Como ocorreu nos ensaios em shaker, o pH
neste processo também decresceu.
Nos ensaios em biorreator, pôde-se observar as variações mais detalhadamente,
devido a periodicidade das amostragens. Esse caso especificamente, detectou-se
concentrações de glicose e frutose. As curvas nas figuras 6.9 e 6.10 mostram o consumo
total de sacarose e sua associação com a término de crescimento celular. Da mesma
maneira, as concentrações de glicose e frutose caíram sem nenhum acúmulo no meio de
cultura. De acordo com Jackson and Ricard, (2003), sacarose é hidrolisada a glicose e
frutose e posteriormente oxidada (Figura 3.1). De acordo também com a figura 6.10, a
etapa principal da enzima da sacarose é sua hidrólise a glicose e frutose, uma vez que
aparentemente toda sacarose transformada em glicose e frutose é consumida, não havendo
acúmulo destas fontes de carbono no meio.
6 Resultados e Discussão
82
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
0 2 4 6 8 10tempo (h)
Variáveis
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0 N (g/L)
Figura 6.9 Evolução das concentrações de biomassa (□); sacarose (◊); Absorbância ( );
Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em fermentador.
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
0 2 4 6 8 10
tempo (h)
g/L Frutose Glicose Sacarose
Figura 6.10 Evolução das concentrações de frutose, glicose e sacarose em Azlp01.
Foi observada dois tipos de floculação bacteriana caracterizados por sua densidade e
aparência. Um dos tipos, menor e mais compacto sedimentava com rapidez quando em
repouso e era facilmente colocado em suspensão quando a agitação era reiniciada. O outro
tipo de floco apresentava tamanho maior, densidade menor e aparência de “algodão”, com
ramificações (“fiapos”) visíveis. Pensou-se inicialmente em contaminação por outras
Azlp01 – (inóculo = Meio F)
Azlp01 – (inóculo = Meio F)
6 Resultados e Discussão
83
bactérias ou fungos, mas observações microscópicas efetuadas não demonstraram a
presença de outros microrganismos que não Azospirillum.
Este tipo de floco talvez tenha se formado, principalmente, pela adesão inicial das
células em bolhas de ar depois permanecido ocluso, inflando o floco.
6.5.4 Etanol
Os ensaios com etanol também foram processados somente com A. brasilense, e
observou-se que o tempo de crescimento e a formação de biomassa podem estar envolvidos
com o fato de utilizar caldo nutriente no inóculo, pois para o mesmo crescido em meio
fermentador o cultivo atingiu 12 h, sem consumo do etanol. Os resultados comparativos nos
ensaios com etanol, estão apresentados na tabela 6.6, e mostram resultados satisfatórios,
baseando–se nos valores de concentração final (3,03 g/L), µmax (0,103 h-1) e produtividade
(0,110 g/L.h). Os acompanhamentos realizados durante os experimentos podem ser
observados na figura 6.11.
6 Resultados e Discussão
84
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0 5 10 15 20 25 30tempo (h)
Variáveis
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60 N (g/L)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0 5 10 15tempo (h)
Variáveis
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60 N (g/L)
Figura 6.11 - Evolução das concentrações de biomassa (□); etanol (◊); Absorbância ( );
Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em fermentador.
Azbr06 – (inóculo = CN)
Azbr07 – (inóculo = Meio F)
6 Resultados e Discussão
85
6.6 Comparação entre os ensaios
A comparação entre os ensaios foi realizada levando-se em conta os fatores de
conversão e produtividade no desenvolvimento do processo de produção de Azospirillum,
bem como a tendência à formação de flocos e carotenóides. As comparações entre as
fontes de carbono foram efetuadas preponderantemente nos resultados obtidos em
fermentador de 5L (Tabela 6.5).
Tabela 6.5 – Tempo de crescimento, concentrações iniciais e finais de células (Xo, Xf), Substrato (So, Sf), Nitrogênio (No, Nf) para os diferentes ensaios, em função da composição do meio de cultura.
ENSAIOS Pré-inóculo Fonte de Inóculo Tempo de Xo Xf So Sf No (N)f µmax YX/S YX/N PX
Azbr07 CN Etanol MEIO F 12 0,24 0,67 5,53 4,84 0,53 0,48 0,09 0,62 7,81 0,07
Velocidade específica máxima de crescimento (µx), fatores de conversão de Substrato (YX/S) e de nitrogênio (YX/N) em células, produtividade (PX). Obs:. Meio F.= acrescentado da fonte de carbono em estudo, CN = caldo nutriente
A tabela 6.5 demonstra que para A. lipoferum, a utilização do próprio meio de
cultura utilizado em fermentador igual ao do inóculo como forma de adaptação da bactéria,
foram obtidos resultados expressivos. Para sacarose e glicerol como fonte de carbono foram
obtidas, respectivamente, após 7,5 e 11 h de cultivo, concentrações celulares finais de 1,93
e 2,56 g/L. Foram obtidos altos valores de produtividade, velocidade específica máxima de
crescimento e fator de conversão em células (0,24 g/L.h, 0,35 h-1 e 0,41 g/g), quando foi
6 Resultados e Discussão
86
comparada sacarose ao segundo substrato escolhido, glicerol (0,22 g/L.h, 0,28 h-1 e 0,46
g/g). Nos ensaios com A. brasilense, não foram obtidos bons resultados quando o meio de
crescimento do inoculo (CN) foi substituído pelo meio utilizado em fermentador (ensaios
Azbr02, 03, 04 e 07). Por outro lado, utilizando-se inoculo com CN, o tempo de ensaio para
A. brasilense no esgotamento total das fontes de C, frutose, glicerol e etanol foram,
respectivamente, 15h, 37h e 26h. A concentração celular final, a velocidade específica
máxima de crescimento, os fatores de conversão substrato e nitrogênio em células e
produtividade foram altas (Tabela 6.6). As concentrações celulares finais foram,
respectivamente de 2,67 g/L, 4,04 g/L e 3,03 g/L.
Percebe-se que os ensaios em biorreator desenvolveram-se de forma semelhante aos
ensaios em incubador rotativo. Entretanto, observou-se uma importante diferença em
relação a influência das condições ambientais melhor controladas obtidas no biorreator
relativa à agitação, aeração e nível de O2 dissolvido, que contribuíram positivamente para
aumentar os parâmetros cinéticos do cultivo.
Para o desenvolvimento de um processo aeróbio de produção de microrganismos, a
adequação do binômio agitação-aeração é de fundamental importância devido aos efeitos
diretos (falta de homogeneidade do sistema, ruptura de células por cisalhamento,
floculação, formação de espuma, etc.) ou indiretos (limitação pelo oxigênio dissolvido) que
influem no metabolismo celular, nas velocidades de crescimento e de respiração, na
formação de subprodutos e de materiais de reserva e na eficiência energética.
Taciro (1986) obteve para A. brasilense Sp 7 cultivada em biorreatore valor de
produtividade de 0,4 g/Lh, Yx/s = 0,45 g/g e µmax = 0,3 h-1 usando frutose (10 g/L) como
fonte de C DAP como fontes de nitrogênio e fósforo (2,64 g/L), extrato de levedura (1g/L)
e outros sais minerais. Os valores destes parâmetros para esta linhagem foram superiores
aos encontrados no presente trabalho (Tabela 6.6), devido provavelmente a diferenças
fisiológicas entre as linhagens.
6 Resultados e Discussão
87
Em todas as amostras coletadas durante os cultivos, foram efetuadas em paralelo,
determinações de absorbância e concentração celular mássica. Na Figura 6.12 reuniram-se
os valores de absorbância e concentração celular obtidos nos ensaios em fermentador,
obtendo-se através de uma regressão linear a equação abaixo, com o coeficiente de
correlação de 0,9799. O correu uma correlação linear entre os pontos obtidos até 0,6 g/L,
após este valor, houve algumas diferenças entre as grandezas devido à floculação e à
formação de carotenóides. Já a correlação logarítmica, a absorbância acompanhou bem de
perto a concentração celular ao longo dos ensaios.