CENTRO ESTADUAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA PAULA SOUZA ESCOLA TÉCNICA ESTADUAL IRMÃ AGOSTINA CURSO TÉCNICO INTEGRADO AO MÉDIO EM QUÍMICA ANDERSON FERNANDES RIBEIRO ANDERSON SILVÉRIO JUNIOR FRANCIELE CUSTÓDIO GONÇALVES DAS NEVES RENAN SANTINI BARBOSA PRODUÇÃO DE FILME BIODEGRADÁVEL DOPADO COM POTENCIAL INDICADOR DE QUALIDADE PARA ALIMENTOS SÃO PAULO 2014
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Produção de filme biodegradável dopado com potencial indicador de qualidade para alimentos
A cada dia que passa observa-se que a necessidade do ser humano de produzir mercadorias com maiores rendimentos e que agridam cada vez menos o meio ambiente tem aumentado. Visando atender esta demanda, este trabalho propôs o uso do pigmento natural antocianina extraído das cascas do rabanete vermelho (Raphanus sativus) no desenvolvimento de filmes biodegradáveis para potencial uso como embalagem inteligente, indicadora de pH e consequentemente do frescor do alimento embalado. A extração do pigmento envolveu a utilização de etanol acidificado como solvente extrator, havendo uma proporção de 1:3 entre a massa de casca e o volume de solvente extrator. Os filmes foram elaborados pela técnica de casting tendo como formulação base o polímero biodegradável poli(3-hidroxibutirato) (PHB), poli(etilenoglicol) (PEG) de massas molares 90, 400 e 6000 e etanol, e incorporados com duas concentrações de antocianinas: 0,005 g e 0,01 g/g de filme formado. Os filmes foram avaliados quanto as suas propriedades morfológicas (difração de raios-X e microscopia óptica), físico-químicas (razão de intumescimento) e análise de mudança de cor. Após a caracterização, a atividade indicadora de pH foi testada com peixe cru embalado em recipientes de vidro tampados com o filme. Os recipientes foram acondicionados em temperatura ambiente. A avaliação da atividade indicadora de pH foi realizada por meio da análise de mudança de cor do filme relacionada com o pH do peixe. Os resultados obtidos foram promissores, uma vez que os filmes avaliados mostraram-se bons indicadores de pH, mesmo com índices visuais mínimos. No entanto, é necessário o desenvolvimento de uma metodologia que vise a retirada ou diminuição dos carboidratos provenientes das antocianinas, que potencialmente aumentam a degradação do filme de maneira indesejada. Além disso, é importante a realização de testes futuros com uma concentração de antocianinas muito maior, do qual acentue os testes visuais, além de aumentar a resistência do filme à degradação fotoquímica.
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CENTRO ESTADUAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA PAULA SOUZA
ESCOLA TÉCNICA ESTADUAL IRMÃ AGOSTINA
CURSO TÉCNICO INTEGRADO AO MÉDIO EM QUÍMICA
ANDERSON FERNANDES RIBEIRO
ANDERSON SILVÉRIO JUNIOR
FRANCIELE CUSTÓDIO GONÇALVES DAS NEVES
RENAN SANTINI BARBOSA
PRODUÇÃO DE FILME BIODEGRADÁVEL DOPADO COM
POTENCIAL INDICADOR DE QUALIDADE PARA ALIMENTOS
SÃO PAULO
2014
ANDERSON FERNANDES RIBEIRO
ANDERSON SILVÉRIO JUNIOR
FRANCIELE CUSTÓDIO GONÇALVES DAS NEVES
RENAN SANTINI BARBOSA
PRODUÇÃO DE FILME BIODEGRADÁVEL DOPADO COM
POTENCIAL INDICADOR DE QUALIDADE PARA ALIMENTOS
Trabalho de Conclusão de Curso, apresentado
a Escola Técnica Estadual Irmã Agostina, como
parte das exigências para a obtenção do título
de técnico em química.
Orientador (a):
Prof. Me. Klauss Engelmann
SÃO PAULO
2014
Produção de filme biodegradável dopado com potencial indicador de qualidade para alimentos / Anderson Fernandes Ribeiro... [et al.] – 2014.
79 f.: il. color. ; 30 cm
Orientador: Professor Mestre Klauss Engelmann
Trabalho de Conclusão de Curso (Técnico) – Escola Técnica de São Paulo Irmã Agostina, Curso Técnico de Química, 2014.
1. Embalagem inteligente. 2. PHB. 3. Antocianina. I. Engelmann, Klauss. II. Escola Técnica de São Paulo Irmã Agostina. Curso Técnico em Química. III. Título
ANDERSON FERNANDES RIBEIRO
ANDERSON SILVÉRIO JUNIOR
FRANCIELE CUSTÓDIO GONÇALVES DAS NEVES
RENAN SANTINI BARBOSA
PRODUÇÃO DE FILME BIODEGRADÁVEL DOPADO COM
POTENCIAL INDICADOR DE QUALIDADE PARA ALIMENTOS
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso Técnico Integrado ao Médio
em Química, da Escola Técnica Estadual Irmã Agostina como requisito final para a
obtenção do título de Técnico em Química, sob a orientação do Prof. Me. Klauss
Engelmann.
Aprovado ( ) Reprovado ( ) pela Banca Examinadora em ____/____/______
Embalagens inteligentes são aquelas que, além de proteger, reagem de
alguma forma ás mudanças em algumas das propriedades do alimento embalado,
ou do ambiente no qual está exposto (DOBRUCKA; CIERPISZEWSKI, 2014;
SUGIMOTO, 2008), em virtude da incorporação de indicadores ou sensores que
produzem um sinal como resposta a qualquer alteração das condições iniciais da
embalagem, dando informações ao fabricante e ao consumidor sobre o estado
dessas propriedades e, portanto, de qualidade dos alimentos embalados
(VASCONCELOS, 2013).
Assim, embalagens inteligentes fazem mais do que apenas proteger o
produto, identificando e evidenciando em tempo real suas mudanças (AZEREDO;
FARIA; AZEREDO, 2000; ROBERTSON, 2006). Embora diferente do conceito de
embalagens ativas, características de embalagens inteligentes podem ser utilizadas
para verificar a eficácia e a integridade dos sistemas de embalagens ativas (SOUZA;
DITCHFIELD; TADINI, 2010).
Arenas (2012) afirma que
Fatores essenciais para a aplicação de embalagens inteligentes são: o custo, a robustez e a compatibilidade com os diferentes materiais de embalagem. Para estes sistemas de embalagem ser práticos, eles devem ser fáceis de usar, eficazes e ter bom custo-benefício.
A data de validade dos alimentos é estimada pelas indústrias considerando
condições de distribuição e armazenamento (especialmente temperatura) para a
qual o produto alimentar está previsto ser submetido (INSTITUTO BRASILEIRO DE
DEFESA DO CONSUMIDOR, 201?).
Os indicadores ou sensores nas embalagens permitem aos consumidores
terem confiança no produto a ser comprado. Além disso, empresas podem verificar e
abordar os pontos negativos na cadeia de abastecimento de seus produtos, havendo
a possibilidade de redução dos mesmos (DOBRUCKA; CIERPISZEWSKI, 2014).
Microporos e defeitos de vedação em sistemas de embalagem podem levar
produtos alimentares para uma inesperada exposição alta ao oxigênio, o que pode
resultar em indesejáveis mudanças, principalmente a multiplicação de micro-
organismos durante o armazenamento dos alimentos (ARENAS, 2012; DOBRUCKA;
CIERPISZEWSKI, 2014).
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Os indicadores de frescor monitoram a qualidade dos alimentos embalados e
reagem a mudanças que ocorrem no produto devido ao crescimento microbiológico
(ARENAS, 2012).
Conforme relatado por Smolander (2008) sobre os indicadores de frescor para
embalagens de alimentos, um pré-requisito crucial para o sucesso no
desenvolvimento deste tipo de indicadores é o conhecimento dos metabólitos
indicadores de qualidade, que podem ser compostos voláteis, por exemplo, produtos
voláteis de origem microbiana, tais como dióxido de carbono, compostos
nitrogenados, aminas biogênicas, toxinas, bem como bactérias patogênicas em si.
Os estudos que envolvem embalagens inteligentes, na sua grande maioria, já
estão patenteados. Muitas pesquisas têm sido empreendidas em uma ampla gama
de disciplinas, sendo que a grande maioria de embalagens inteligentes indicadoras
de frescor de alimentos utiliza corantes químicos sintéticos e está relacionada à
aplicação em polímeros derivados do petróleo (SOUZA; DITCHFIELD; TADINI,
2010; VEIGA-SANTOS; DITCHFIELD; TADINI, 2011).
Arenas (2012) desenvolveu uma embalagem inteligente à base da fécula da
mandioca, formando um filme compósito de amido/argila, e integrou o pigmento
antocianina em sua estrutura, e avaliou a aplicação deste para o mercado de peixes
e produtos cárneos. Este é um dos poucos trabalhos encontrados na literatura que
empregam o pigmento natural antocianina como sensor químico para embalagens
inteligentes.
Entre os indicadores visuais, encontram-se os indicadores de pH, também
chamados indicadores ácido-base, os quais são substâncias orgânicas fracamente
ácidas ou fracamente alcalinas que apresentam cores diferentes para suas formas
protonadas e desprotonadas. Quando adicionados a uma solução, os indicadores de
pH ligam-se aos íons H3O+ ou OH-. A ligação a estes íons provoca uma alteração da
configuração eletrônica destes indicadores e, consequentemente, altera-lhes a cor.
Estes corantes são dotados de propriedades halocrômicas, que é a capacidade de
mudar de coloração em função do pH do meio (FAULKNER, 2006; VOGEL, 1979).
Devido à deterioração dos alimentos geralmente estar acompanhada por uma
mudança do pH e, a inviabilidade do consumidor detectar e conhecer qual o pH
adequado de um alimento, um sistema de embalagem que muda de cor com a
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alteração do pH do alimento embalado poderia permitir ao consumidor avaliar seu
frescor e qualidade, sem a necessidade de abrir a embalagem, no próprio local de
compra (VEIGA-SANTOS; DITCHFIELD; TADINI, 2011).
Assim, a pesquisa de embalagens indicadoras de pH é muito promissora,
porém está em seus estágios iniciais, especialmente no que se diz respeito aos
Poli(3-hidroxibutirato) (PHB) (C4H6O2)n Usina da Pedra
Poli(etilenoglicol) 90 HO(C2H4O)nH Polytechno
Poli(etilenoglicol) 400 HO(C2H4O)nH Quimesp
Poli(etilenoglicol) 6000 P.A. HO(C2H4O)nH Synth
Resina Lewatit S 6368 Sulfate - LANXESS
4.2 MÉTODOS
Preparação da matéria-prima para extração de antocianinas
Um estudo prévio foi necessário para a avaliação da obtenção de
antocianinas a partir de um composto natural. Definiu-se que os rabanetes podem
ser uma fonte viável de extração de antocianinas (PEREIRA et al., 2007), além da
observação de que dificilmente se encontra na literatura teor do pigmento no
legume, bem como métodos de quantificação.
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Os rabanetes foram obtidos em um mercado popular na região sul da cidade
de São Paulo, e então seguindo o que foi proposto por Luengo (2001), foram
lavados e então armazenados adequadamente, com as folhas retiradas, guardados
em saco plástico fechado, para posterior análise.
Extração de antocianinas do rabanete (Raphanus sativus)
Seguindo o que foi proposto por Terci (2004), utilizou-se da proporção de 1:3
para massa da fração de fruta:volume de solvente.
Com o auxílio de um descascador, retirou-se as cascas dos legumes e
armazenaram-se em um béquer de 100 mL. Após isso, pesou-se cerca de 30 g de
casca em um béquer de 250 mL, e adicionou-se, com o auxílio de uma proveta de
100 mL, 90 mL de etanol 92,8°INPM em pH 2,8, na proporção correta.
Tendo tal sistema pronto, aqueceu-se sem agitação no banho termostático à
temperatura de 50°C, por 2 horas. Após o resfriamento do extrato, armazenou-se em
um frasco âmbar.
Um outro sistema idêntico ao anterior foi preparado, no entanto utilizou-se
60 g de casca de rabanete e 180 mL de etanol 92,8°INPM em pH 2,3, além de não
ter sido aquecido em banho termostático, deixando apenas em temperatura
ambiente.
Simultaneamente, preparou-se um sistema de extração à frio, por pesar
aproximadamente 15 g de casca, e imergir em 45 mL de etanol 92,8° INPM em
pH 2,8, armazenando em frasco âmbar, estando em geladeira à aproximadamente
8°C.
A cada três dias trocaram-se as cascas dos frascos, como medida para
concentração do extrato. Tal etapa foi executada em duplicata, sempre respeitando
a proporção de 1:3 da massa da fração de casca:volume de solvente, por medir o
volume de solvente a cada troca.
O extrato à frio foi desconsiderado nas análises posteriores, devido não ter
extraído tão efetivamente quanto os outros dois sistemas, o que ficou perceptível
visualmente.
Os extratos preparados foram testados em três condições: à quente,
temperatura ambiente e frio. Os trabalhados nas condições à temperatura ambiente
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e à quente foram filtrados utilizando papel filtro quantitativo Quanty® de 25 µm, como
é possível observar na Figura 4.1, e posteriormente armazenados em frascos âmbar
estando em geladeira à 8°C.
Figura 4.1. Filtragem do extrato alcoólico de rabanete
Purificação das antocianinas
Preparou-se uma coluna cromatográfica com a resina LANXESS® Lewatit S
6368 Sulfate. Lavou-se adequadamente a coluna e posteriormente eluiu-se o extrato
na condição de temperatura ambiente, cerca de 180 mL, como é possível observar
na Figura 4.2. A fase de eluição despendeu um tempo de 4 horas.
Houve a necessidade de realizar o teste de Benedict para avaliar a presença
de açucares redutores no extrato e na solução de lavagem eluídos pela coluna, e
consequentemente avaliar o efeito deste resultado nas análises posteriores.
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Figura 4.2. Purificação das antocianinas em coluna cromatográfica Lewatit S 6368 Sulfate
Secagem e conservação do extrato antociânico
Volumes conhecidos de extratos foram colocados em um balão de fundo
redondo de 1 L e levados ao evaporador rotativo com banho termostático variando
de 30 à 55°C por 2 horas. É possível observar o sistema de secagem em
evaporador rotativo na Figura 4.3.
Figura 4.3. Secagem do extrato antociânico em evaporador rotativo
Os extratos secos de antocianinas utilizados foram armazenados em placas
de Petri fechadas, e mantidos em dessecador para uso posterior nas análises
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espectrofotométrica e de incorporação nas soluções filmogênicas. O aspecto do
extrato seco pode ser observado na Figura 4.4.
Figura 4.4. Aspecto do extrato seco de antocianinas
Análise espectral de antocianinas
Após a secagem e armazenamento serem consumados, procurou-se analisar
as regiões de absorção das antocianinas do extrato, partindo-se da proposta da
literatura, denominada como método do pH diferencial (FAVARO, 2008),
considerando as condições adaptáveis do laboratório em que foram realizados os
procedimentos.
O método utilizado é fundamentado nas transformações sofridas pelas
antocianinas com a variação do pH, ou seja, as diferentes estruturas
correspondentes às diferentes colorações das soluções em diferentes pHs. Além
disso, como alguns extratos podem apresentar material em suspensão, causando o
espalhamento de luz, o método recomenda leitura da absorbância em comprimento
de onda onde não há absorção referente às antocianinas (700 nm), além daquele
onde ocorre absorção.
A amostra do extrato seco (aproximadamente 10 mg) foi dissolvida em água
destilada e diluída em balões volumétricos de 25 mL com soluções tampão pH 1,0 e
pH 4,2 e as leituras de absorbância foram realizadas na faixa espectral de 260 nm à
700 nm no espectrofotômetro de absorção molecular NOVA modelo 1600 UV. O
aspecto visual das soluções preparadas pode ser observado na Figura 4.5.
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Figura 4.5. Aspecto visual das soluções de antocianinas em (a) pH 1,0 e (b) pH 4,2
Preparo das soluções filmogênicas de PHB
Fez-se necessário o preparo de quatro soluções de concentrações distintas,
porém lineares, de PHB, sendo elas 25 g L-1, 50 g L-1, 75 g L-1 e 100 g L-1.
Foram pesadas em balança analítica aproximadamente 5 g de PHB industrial
em um béquer de 100 mL, aos quais foram acrescentados 50 mL de clorofórmio. A
amostra foi então transferida para um frasco reagente de 50 mL e deixada em
repouso por 1 dia. Após o período, solubilizou-se o PHB residual por meio de um
sistema de refluxo pelo período de 3 horas, armazenando posteriormente no frasco
reagente.
O mesmo procedimento foi realizado para outras duas amostras, utilizando
10 g e 15 g de PHB. No entanto, diluiu-se as soluções com 150 mL de clorofórmio
para corresponder respectivamente às concentrações 50 g L-1 e 75 g L-1. A partir da
solução de 50 g L-1 preparou-se a solução 25 g L-1, diluindo 50 mL de solução com
50 mL de clorofórmio.
Todas as soluções foram submetidas ao refluxo por um período médio de 3
horas. A Figura 4.6 mostra um sistema de refluxo para a solução 100 g L-1 de PHB.
Após o período, as soluções foram filtradas em papel filtro quantitativo Quanty® de
25 µm, a fim de eliminar resíduos grosseiros de PHB que não foram solubilizados.
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Posteriormente, armazenaram-se as soluções em frascos reagentes de
200 mL devidamente identificados.
Figura 4.6. Solução 100 g L-1 de PHB em refluxo
Elaboração dos filmes
Utilizou-se uma pipeta volumétrica de 5 mL para a uniformização das
soluções em placa de Petri, devidamente lavadas e secas em estufa, utilizando
quantidades suficientes para a quantidade de solução gerada. Tal processo
caracteriza o método de casting, onde se verte uma solução filmogênica sobre um
suporte, geralmente liso e reto, para posterior secagem.
As soluções foram deixadas em capela de exaustão por 2 horas, sendo tempo
suficiente para a evaporação de todo clorofórmio. Foram testadas duas condições
para todas as quatro soluções, de diferentes concentrações, de PHB: a primeira
condição envolvia untar a placa de Petri com uma pequena camada de graxa de
silicone, e a segunda condição sem graxa de silicone. O teste com graxa de silicone
foi necessário para verificar a facilidade de remoção do filme após a evaporação do
solvente. No entanto, o procedimento não foi efetivo, pois o filme aderiu à placa,
dificultando sua remoção; os filmes produzidos sem silicone apresentaram-se
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melhores e mais fáceis de remover. Desta forma, decidiu-se prosseguir com os
testes posteriores sem o auxílio da graxa de silicone. A Figura 4.7 mostra o método
de casting com as soluções de PHB em capela de exaustão.
Figura 4.7. Casting das soluções filmogênicas de PHB (a) com graxa de silicone e (b) sem graxa de
silicone
Incorporação de antocianinas nos filmes
Nos testes de elaboração dos filmes percebeu-se que as concentrações de
25 g L-1 e 50 g L-1 se mostraram melhores para a formação de filmes com a
espessura ideal. Portanto, para os testes de incorporação de antocianinas decidiu-se
trabalhar apenas com essas duas concentrações.
Devido as antocianinas serem insolúveis em clorofórmio e em PEG 400,
utilizou-se uma mistura de solventes que pudesse solubilizar as antocianinas e
manter certa resistência no filme. Misturou-se PEG 90 e PEG 400 na proporção 1:1,
o que criou um bom sistema de solubilização.
Testaram-se duas concentrações de antocianina: 2,5 g L-1 e 5 g L-1. Pesaram-
se 0,025 g e 0,05 g de extrato seco de antocianina e solubilizou-se em 10 mL da
mistura de solventes, respectivamente.
A solução filmogênica antociânica foi composta por 30 mL de solução de
PHB, 4 mL da solução de antocianina e 1% de solução alcoólica de PEG 6000 em
concentração 5 g L-1. O aspecto visual da emulsão formada pela solução de PHB
50 g L-1 e antocianina 5 g L-1 pode ser visualizado na Figura 4.8. Uma solução
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filmogênica sem antocianinas foi elaborada como medida de controle, para avaliar o
efeito provocado pelo pigmento nas propriedades do filme.
Figura 4.8. Aspecto visual da solução filmogênica antociânica
Devido a emulsão formada não ficar estável por muito tempo, houve a
necessidade de fazer o método de casting de maneira mais rápida, evitando a
separação de fases, e consequentemente a não uniformidade do filme. Desta forma,
os filmes foram elaborados em placas de Petri dentro de dessecador a vácuo, a uma
pressão variando de -300 à -400 mmHg por 20 minutos. O volume de solução
filmogênica antociânica introduzido em placa foi de 2 mL. A Figura 4.9 mostra o
sistema de casting em dessecador a vácuo.
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Figura 4.9. Sistema de casting em dessecador a vácuo
Caracterização dos filmes
Para avaliar as propriedades que os filmes obtiveram e o efeito da adição de
antocianinas, escolheram-se os seguintes testes: microscopia óptica, difração de
raios X e razão de intumescimento, além do teste sensorial para avaliar a atividade
do filme com a mudança de pH.
4.2.9.1 Microscopia óptica
Pequenas porções de filme foram recortadas e dispostas em lâmina de
26 X 76 mm com lamínula cobrindo o analito. As amostras foram analisadas em
microscópio óptico binocular Bioval modelo L 1000 T, utilizando uma lente com
aumento de 40 vezes. As imagens foram obtidas pela captura no binóculo com uma
câmera digital comum de celular.
4.2.9.2 Difração de Raios X
Os difratogramas de raios X, gentilmente cedidos pelo Instituto de Pesquisas
Energéticas e Nucleares da Universidade de São Paulo (IPEN – USP), por
intermédio do Prof. Me. Klauss Engelmann, foram realizados em um equipamento
Difratomêtro de Raios X Rigaku, modelo MiniFlex II onde utilizou-se fonte de
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radiação CuKα (λ = 1,54 Å) e filtro de Ni. A partir deles, foi possível a caracterização
da superfície dos filmes.
Nestes testes empregaram-se os filmes de PHB em concentração 50 g L-1, e
os filmes PHB/PEG em concentrações 50 g L-1 e 25 g L-1 com dopamento de
antocianinas em concentração 5 g L-1.
4.2.9.3 Razão de Intumescimento
Para a determinação do índice de intumescimento foram recortadas amostras
de filmes nas dimensões de 1 cm x 1 cm, e estas foram secas por aproximadamente
1 hora em estufa com temperatura de 50°C. Após pesagem os filmes foram imersos
em 20 mL de água destilada e em tempos pré-determinados a massa foi novamente
verificada. A pesagem de filmes intumescidos foi realizada após uma leve secagem
em papel toalha para absorção do excesso de água. O procedimento foi realizado
em triplicata. A razão de intumescimento foi calculada através da Equação 1, onde
Wt é a massa no tempo e W0 é a massa inicial.
𝑅𝐼 =𝑊𝑡
𝑊0
4.2.9.4 Avaliação da atividade do filme com a mudança de pH
Utilizaram-se porções adequadas de uma espécie de sardinha, em estado cru
e fresco, dentro um tubo de ensaio tampado com o filme inteligente. Os tubos foram
acondicionados em ambiente fechado, evitando ao máximo à exposição à luz. A
temperatura do laboratório era de 20°C. Aguardou-se o período de três dias para
avaliar a alteração visual provocada no filme.
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5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 PURIFICAÇÃO DAS ANTOCIANINAS
A metodologia de purificação de antocianinas extraídas do rabanete envolveu
o uso de uma resina de troca iônica LANXESS® da linha Lewatit, a resina S 6368
Sulfate. Esta resina é de troca aniônica, macroporosa, monodispersa, fortemente
alcalina, com agrupamentos amino quartenários, adaptada para o uso na indústria
de alimentos, baseada num copolímero de estireno e divinilbenzeno (LANXESS,
2014).
A forma utilizada é particularmente adequada para a remoção de ácidos com
uma descoloração de soluções de substâncias orgânicas, como açúcar, gelatina,
glicerina e concentrados de frutas (LANXESS, 2014).
Para confirmação de sua efetividade houve a necessidade de realizar o teste
de Benedict, que baseia-se no princípio de que os açucares que apresentam uma
hidroxila livre no C-1, nomeadamente classificado como carbono anomérico, como
por exemplo a glicose, são bons agentes redutores. O carbono anomérico
desempenha um papel fundamental neste teste, uma vez que este pode estar
envolvido em uma ligação glicosídica, como nas próprias antocianinas. A estrutura
química da glicose é apresentada na Figura 5.1. Devido a este motivo a extremidade
que contém a hidroxila passa a ser chamada de extremidade redutora e o açúcar, de
açúcar redutor. A capacidade que esses compostos apresentam de reduzir íons
metálicos em soluções alcalinas é um bom método de identificação desses
compostos (SOUZA; NEVES, 2014).
Figura 5.1. Molécula de glicose (SOUZA; NEVES, 2014)
56
A reação apresentada na Figura 5.2 esquematiza o princípio da prova de
Benedict, baseada na redução de íons Cu2+ a Cu+, com formação de um precipitado
vermelho ou amarelo.
Figura 5.2. Reação de redução dos íons Cu2+ à Cu+ com formação de precipitado (Adaptado de
SOUZA; NEVES, 2014)
Segundo o teste, o extrato de rabanete eluído pela coluna cromatográfica
apresentou açúcar em sua composição, dando teste positivo para a presença de
açúcar redutor. No entanto a solução de lavagem da coluna cromatográfica não
apresentou açúcar em sua composição, dando teste negativo para a presença de
açúcar redutor, ou seja, a coluna não reteve nem mesmo parte dos açucares
presentes no extrato de rabanete.
Com esta análise, pode-se concluir que o uso da resina Lewatit S 6368
Sulfate não resultou na implicação esperada, uma vez que não reteve os açucares
presentes na amostra, embora possa ter concentrado o extrato e eliminado
inclusões.
5.2 ANÁLISE ESPECTRAL DE ANTOCIANINAS
A propriedade das antocianinas de sofrer transformações em sua estrutura
em função do pH, e consequentemente na coloração do meio em que estão
inseridas, é uma das mais admiráveis, o que torna objeto de fascínio e muitos
estudos acerca do assunto. Tendo esta ideia em mente, esta análise espectral das
antocianinas extraídas do rabanete foi necessária para avaliar suas características e
o tipo de antocianina do qual se trabalhou ao comparar com dados em literatura.
Para a obtenção dos espectros na região do UV-Vis, as soluções em pH 1,0 e
4,2 foram submetidas a uma varredura espectral de 280 nm à 700 nm, usando o
espectrofotômetro de absorção molecular NOVA modelo 1600 UV. Desta forma,
obtiveram-se os picos máximos de absorbância, como expresso na Figura 5.3.
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Figura 5.3. Características espectrais de antocianinas de rabanete (Raphanus sativus) em soluções
tampão pH 1,0 e pH 4,2
A região de absorção indicada pela Figura 5.3 entra em harmonia com o
aspecto visual da solução indicado na Figura 4.5, sob o tópico 4.2.5, onde
nitidamente percebe-se que a solução em pH 1,0 absorve especialmente na região
do visível, enquanto a solução em pH 4,2 absorve na região do ultravioleta.
Em solução pH 1,0 as antocianinas estão predominantemente na forma de
cátion flavilium, de coloração fortemente vermelha ou alaranjada. Isto é evidenciado
pelo fato dos cromóforos de antocianinas neste meio absorverem na região visível
do espectro eletromagnético, tendo sua absorção máxima no comprimento de onda
de 506 nm. Nesta solução ocorreu um deslocamento hipsocrômico, que é o
deslocamento da banda de absorção para um comprimento de onda menor do que o
esperado (ALBUQUERQUE et al., 197?; WIETHAUS, 2010), de 510 nm (TERCI,
2004). Tal deslocamento pode ter ocorrido devido a fatores como o aumento da
polaridade do solvente, nomeadamente solvatocromismo negativo, ou ainda efeitos
de substituição ou de solvente utilizado (OLIVEIRA, 2009). A estrutura do cátion
flavilium é expressa na Figura 5.4.
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
270 370 470 570 670
Ab
sorb
ân
cia
Comprimento de onda (nm)
pH 1,0
pH 4,2
58
OOH
OH
OAçúcar
R
OH
R'+
Figura 5.4. Estrutura do cátion flavilium - forma predominante de antocianina em pH 1,0
No caso da solução em pH 4,2 as antocianinas estão predominantemente na
forma de carbinol ou pseudobase incolor. Seu pico de absorção máximo está na
região do ultravioleta, com um comprimento de onda de 311 nm. Sua estrutura é
expressa na Figura 5.5.
OOH
OH
OAçúcar
R
OH
R'
OH
Figura 5.5. Estrutura da pseudobase incolor ou carbinol – forma predominante de antocianina em
pH 4,2
O espectro de absorção obtido neste procedimento, expresso na Figura 5.3, é
muito semelhante aos dados encontrados em literatura referentes as antocianinas
de rabanete purificadas, como é possível verificar na Figura 5.6.
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Figura 5.6. Características espectrais de antocianinas de rabanete purificadas (derivados acilados de
pelargonidina-3-soforosídio-5-glicosídeo) em soluções tampão de pH 1,0 e 4,5
(LEIDENS, 2011)
A semelhança entre os espectros pode não ser maior devido as
concentrações utilizadas de solução diferirem, o pH da segunda solução não ter sido
necessariamente 4,5, além do efeito hipsocrômico na solução em pH 1,0, no qual
ocorre uma diminuição da intensidade de absorção.
Desta forma pode-se confirmar que as antocianinas presentes no rabanete
são predominantemente expressas como pelargonidina-3-soforosídio-5-glicosídeo.
Considerando que as antocianinas extraídas não foram purificadas utilizando
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC, do inglês High Performance Liquid
Chromatography), como no trabalho referenciado por Leidens (2011), e sim com o
método de cromatografia em coluna utilizando uma resina de troca iônica, pode-se
concluir que o processo de extração e purificação foi suficientemente eficaz para
obter um extrato com o mínimo de inclusões possíveis, ocasionando o mínimo
possível de desvio no espectro de absorção.
5.3 ELABORAÇÃO DOS FILMES
Para a elaboração dos filmes dopados com antocianina foi necessário avaliar
um solvente que solubilizasse as antocianinas e incorporasse na solução
filmogênica. Desta forma, foi necessário elaborar uma mistura de solventes que
desempenha-se este papel.
O PEG-90 empregado como uma das fases do solvente é conhecido
usualmente como polímero W-25, da empresa Polytechno®. Normalmente é utilizado
em formulações de shampoo e condicionadores, pois serve como solvente, agente
60
umectante (retentor de água) e agente de aumento da viscosidade em fase aquosa
(COSMETICS INFO, 2014). Estas características ficaram perceptíveis na formulação
teste de filme. O uso desse solvente produziu filmes úmidos, porém extremamente
quebradiços. Para eliminar este problema, utilizou-se PEG 400 na mistura de
solventes, o que produziu filmes mais resistentes.
Nem todas as formulações utilizadas produziram um filme ideal. Aquelas que
utilizaram a solução de PHB em concentração de 50 g L-1 mostraram-se mais firmes,
resistentes e homogêneas em relação as de concentração 25 g L-1, como é possível
visualizar na Figura 5.7.
Após a etapa de secagem, posterior à evaporação do solvente clorofórmio, os
filmes foram facilmente retirados das placas. Os filmes que apresentaram bolhas ou
que aderiram à placa não foram empregados nos testes. Através da análise visual e
tátil dos filmes biodegradáveis contendo antocianina, percebeu-se que estes
mostraram-se pegajosos e com maior higroscopicidade, como também indicado
pelos testes de intumescimento.
Figura 5.7. Filme biodegradável elaborado por casting à base de PHB e antocianinas
5.4 CARACTERIZAÇÃO DOS FILMES
As análises para caracterização dos filmes foram aplicadas nos resultados
das diferentes propriedades dos filmes biodegradáveis produzidos com duas
quantidades de antocianina: 0,005 g e 0,01 g por grama de filme formado. Nestas
análises, ambos os fatores (melhoramento proporcionado pelas antocianinas ao
61
filme e atividade em diferentes pHs) foram de igual interesse, assim como a
interação entre eles.
Microscopia Óptica
Os testes que envolvem a microscopia óptica são, geralmente, um bom
parâmetro para a análise morfológica dos filmes (ALVES, 2009; MOTTIN, 2011),
embora muitos estudos trabalhem com microscopia eletrônica de varredura (MEV)
devido sua maior eficiência e especificidade. Consequentemente, o efeito de
agentes externos à matriz do polímero, neste caso as antocianinas, também é
elucidado. As amostras analisadas utilizando o microscópio óptico binocular Bioval
modelo L 1000 T não receberam qualquer preparação anterior à análise, sendo
dispostas em lâminas de vidro e tendo as imagens captadas utilizando uma câmera
digital de celular.
A realização deste teste utilizou unicamente os filmes elaborados com PHB
em concentração 50 g L-1. Tal medida foi necessária devido a inviabilidade da
utilização dos filmes elaborados com PHB em concentração 25 g L-1, uma vez que
formaram filmes extremamente finos, não uniformes e com muitos orifícios em sua
totalidade.
Os filmes em que não houve a incorporação de antocianinas apresentaram-se
uniformes em quase sua totalidade, com espaços uniformemente preenchidos com
PHB e PEG, como é possível visualizar na Figura 5.8. A interação existente entre
PHB e PEG ocasiona em uma diminuição na resistência à tração dos filmes, em
relação ao PHB puro, provavelmente devido à redução das ligações secundárias
intermoleculares entre as cadeias de PHB (QUENTAL et al., 2010). No entanto, a
natureza biodegradável é mantida, o que cumpre um quesito proposto neste
trabalho. Desta forma, a adição de antocianinas pode favorecer a velocidade de
degradação, o que pode ser perceptível no estudo morfológico.
62
Figura 5.8. Microestrutura visual do filme PHB/PEG em microscópio óptico binocular Bioval modelo
L 1000 T com aumento de 40 vezes (foto de William Marinho Paulo de Alencar)
Nos filmes em que houve a incorporação de antocianinas é possível perceber
que o PHB, PEG e as antocianinas preencheram quase que em sua totalidade toda
estrutura do filme. No entanto, não houve a mesma uniformidade existente na
solução sem antocianinas, como pode ser observado na Figura 5.9. Um fator que
pode ter favorecido isto é a instabilidade da emulsão formada na solução filmogênica
antociânica. Mesmo que o método de elaboração dos filmes por casting tenha
ocorrido em atmosfera sob vácuo, a separação de fases ainda pode ter ocorrido, o
que contribui para a não uniformidade do filme produzido.
63
Figura 5.9. Microestrutura visual do filme PHB/PEG com antocianinas em microscópio óptico
binocular Bioval modelo L 1000 T com aumento de 40 vezes (foto de William Marinho
Paulo de Alencar)
No que diz respeito à biodegradabilidade nos filmes com a adição das
antocianinas, pode ocorrer um aumento em sua velocidade. Isto pode se dar devido
a presença de carboidratos como glicosídeos das antocianinas. Esta classe de
substâncias pode ser metabolizada e utilizada diretamente pela maioria dos micro-
organismos, incluindo bactérias, seja por via oxidativa ou fermentativa (GAVA;
SILVA; FRIAS, 2009), dos quais podem causar alterações ao filme ainda quando
aplicado como embalagem, como alteração da cor e propriamente a degradação
enzimática por parte dos micro-organismos (COUTINHO et al., 2004; GAVA; SILVA;
FRIAS, 2009; KOLLER et al., 2012), o que inviabiliza sua aplicação até o
desenvolvimento de uma metodologia que vise eliminar esta problemática.
Razão de Intumescimento
Em geral, o fato de não haver ligações cruzadas facilita a penetração de
moléculas de solvente, como a água, nas cadeias poliméricas. Isto é evidenciado
nos testes de intumescimento dos filmes, tanto nos quais houve incorporação de
antocianinas como os em que não houve. No entanto, percebe-se que os filmes que
receberam o dopamento obtiveram uma razão de intumescimento (RI) maior dos
64
que não receberam, ou seja, absorveram maior quantidade de água. Esta relação
pode ser observada na Figura 5.10.
A análise mostrou-se eficiente, sendo possível calcular a razão de
intumescimento dos filmes através da Equação 1.
Figura 5.10. Razão de Intumescimento versus tempo para filmes de PHB/PEG e PHB/PEG dopado
com antocianinas
A instabilidade dos resultados obtidos a respeito dos filmes em que não
ocorreu dopamento, não possuindo uma linha de tendência invariável, se deu por
conta dos filmes mostrarem-se cada vez mais frágeis com o decorrer das
observações, tornando-se quebradiços e consequentemente, por perder massa,
inviáveis de continuar com a análise.
Entretanto, os filmes em que ocorreu dopamento, embora tenham se
mostrado relativamente frágeis, conseguiram manter uma linha de tendência
invariável por pelo menos 50 minutos da análise, absorvendo uma quantidade maior
de água. Muito provavelmente isto se deu devido à forte interação que as
antocianinas presentes no filme possuem com solventes polares (HOHNOVÁ;
ŠŤAVÍKOVÁ; KARÁSEK, 2008), como neste caso a água, e consequentemente
aumentando a penetração das moléculas de solvente na matriz do polímero.
0,75
0,85
0,95
1,05
1,15
1,25
1,35
0 50 100 150
RI
Tempo (minutos)
PHB/PEG
PHB/PEG dopados
65
Difração de raios X
Os difratogramas de raios X para os filmes formados com dopamento tendo
PHB em concentração 25 g L-1 e 50 g L-1 e sem dopamento com PHB em
concentração 50 g L-1 são apresentados na Figura 5.11.
Figura 5.11. Difratogramas dos filmes elaborados por casting, com e sem dopamento
Para todas as amostras, os picos médios observados em 2θ foram 13,41° e
16,91° representados por dois picos intensos, e 21,45° e 27,10° representados pelos
picos de intensidade média, como é possível observar na Figura 5.11.
Comportamentos similares foram relatados em literatura (MENDES, 2009;
THIRÉ; RIBEIRO; ANDRADE, 2006). Segundo Thiré e colaboradores (2006), o perfil
da amostra de PHB analisada exibe picos bem definidos em 2θ iguais a 13,6°, 17,1°,
21,7°, 22,7° e 25,6°.
Mendes (2009) encontrou valores para 2θ iguais a 13,2° e 16,7°
representados por dois picos intensos e os picos em 2θ iguais a 19,8°, 21,2°, 22,3°,
25,3° e 26,9° representados pelos picos de intensidade média.
Com base nesta análise, percebeu-se que tais resultados encontrados nas
experimentações correspondem predominantemente ao PHB. Observou-se que o
66
PHB é um polímero semicristalino e extremamente quebradiço. No entanto, com a
adição da mistura de solventes para as antocianinas, a saber PEG 90 e PEG 400,
suas características melhoram significativamente, como observado na intensidade
dos picos de difração em 13,41° e 16,91° no filme sem dopamento.
Com a adição das antocianinas aos filmes, percebe-se que os picos de
difração máximos apresentaram-se com menor intensidade, tanto para a
concentração de PHB em 25 g L-1 como para 50 g L-1, sendo mais acentuada no de
menor concentração. Desta forma, percebe-se que a adição de antocianinas diminui
consideravelmente a cristalinidade do filme, resultando em um filme amorfo, pelo
menos em respectivas regiões. Isto pôde ser identificado na análise de microscopia
óptica, no qual percebeu-se que a dispersão das antocianinas não foi integral no
filme, como observado na Figura 5.9.
Avaliação da atividade do filme com a mudança de pH
Nesta fase do estudo, como o intuito era avaliar o comportamento do filme em
função do pH, foram utilizadas unicamente as formulações de maior concentração
de PHB e antocianina, sendo 50 g L-1 e 5 g L-1, respectivamente. Para isto, porções
de peixe cru foram embaladas em tubos de ensaio tampados com o filme, como é
possível observar na Figura 5.12. Os tubos foram acondicionados à temperatura
ambiente, variando de aproximadamente 20°C à 25°C. Após três dias foi realizada a
análise de cor do mesmo filme.
Figura 5.12. Porção de peixe cru embalada com o filme inteligente
67
Observou-se que a cor dos filmes alterou levemente, como se era almejado,
começando com um branco-roseado e terminando com um amarelo-esverdeado. A
Figura 5.13 indica as cores inicial e final dos filmes, respectivamente. Desta forma,
houve a indicação da correlação entre as alterações de coloração do filme e a
deterioração do produto.
Estado inicial Estado final
Figura 5.13. Aspecto visual dos filmes em seu estado pré-deterioração (Estado inicial) e pós-
deterioração (Estado final) do peixe
Este comportamento era esperado, pois conforme o peixe deteriora ocorre a
liberação de uma variedade de aminas voláteis básicas como trimetilamina (TMA),
amônia (NH3) e dimetilamina (DMA) conhecidas como nitrogênio básico volátil total
(TVB-N, do inglês Total Volatile Basic Nitrogen) e são substâncias liberadas em
peixes depois de ter passado sua fase inicial de frescura (GIROTO; MASSON;
HARACEMIV, 2010).
Esta análise indicou que a mudança pretendida na coloração do filme,
característica de uma embalagem inteligente, foi atingida. No entanto, devido a
concentração de antocianinas utilizada ter sido relativamente baixa, a percepção na
alteração colorimétrica foi dificultosa. Aliado a este fato, percebeu-se que com o
decorrer do tempo os filmes vão perdendo sua coloração original, muito
provavelmente devido à fotodegradação das antocianinas (LOPES et al., 2007;
STRINGHETA; BOBBIO, 2000) presentes no filme. Por isso, foi muito importante
durante esta análise a manutenção dos tubos em ambiente com o mínimo possível
de exposição à luz.
68
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A metodologia de extração e purificação das antocianinas mostrou-se eficaz,
uma vez que o espectro gerado apresentou semelhança com dados obtidos em
literatura.
A morfologia e as características mecânicas dos filmes elaborados foram
diretamente influenciadas pela composição da solução filmogênica.
Visualmente, os filmes apresentaram-se opacos e levemente rosados quando
secos, mas relativamente translúcidos e ainda rosados quando solvatados. Tal
condição se dá muito provavelmente pela adição de PEG 90, um bom agente
retentor de água. Além disso, os filmes mostraram-se pegajosos e com grande
higroscopicidade, o que foi confirmado pelos testes de intumescimento.
Os filmes incorporados com antocianina na matriz polimérica representam
uma boa alternativa ecologicamente correta para indicar variações de pH no meio.
Quando o filme foi exposto ao pH próximo à neutralidade e alcalinidade, ocorreu
gradativa alteração da cor roseada para amarelo/esverdeada. No caso da avaliação
com peixe cru, os filmes mostram-se muito promissores, uma vez que houve
mudança de cor do filme quando o pH do peixe atingiu um nível considerado inviável
para o consumo humano. Desta forma, os filmes indicaram a deterioração do
produto pela liberação de TVB-N.
As informadas mostradas neste estudo indicam que existe um grande
potencial de utilização destes materiais biodegradáveis à base de PHB como
embalagens de alimentos. Entretanto, esta aplicação depende da produção de
materiais mais estáveis, com maior flexibilidade, além da implicação de
concentrações de antocianina muito maiores, na ordem de 50 g L-1, o que aumenta a
resistência à degradação fotoquímica dos filmes.
69
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