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DESENVOLVIMENTO DE UM PROCESSO BIOTECNOLGICO PARA A PRODUO DE
CIDO SUCCNICO POR Actinobacillus
succinogenes
EELLCCIIOO RR IIBBEEIIRROO BBOORRGGEESS
Tese de Doutorado, apresentada ao Programa de Ps-graduao em
Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos para Obteno do Grau de
Doutor em Cincias (DSc)
ORIENTADOR: Prof. Nei Pereira Jr, PhD
Universidade Federal do Rio de Janeiro Escola de Qumica
2011
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Prog. Ps-Grad. TPQBq/EQ/UFRJ Elcio Ribeiro Borges, 2011
ii
DESENVOLVIMENTO DE UM PROCESSO PARA PRODUO DE CIDO SUCCNICO POR
Actinobacillus Succinogenes
ELCIO R IBEIRO BORGES
Tese de Doutorado apresentada ao Curso de Ps-Graduao em
Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos para a Obteno do Grau
de Doutor
em Cincias (DSc)
Universidade Federal do Rio de Janeiro Escola de Qumica
2011
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Prog. Ps-Grad. TPQBq/EQ/UFRJ Elcio Ribeiro Borges, 2011
iii
DESENVOLVIMENTO DE UM PROCESSO BIOTECNOLGICO PARA PRODUO DE CIDO
SUCCNICO POR Actinobacillus Succinogenes
Elcio Ribeiro Borges
Tese submetida ao Programa de Ps-graduao em Tecnologia de
Processos Qumicos e Bioqumicos da Escola de Qumica da Universidade
Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessrios
obteno do grau de Doutor em Cincias, sob orientao do Prof. Nei
Pereira Jr.
Banca examinadora:
Prof. Nei Pereira Junior, PhD (EQ/UFRJ)
(Orientador-Presidente)
Profa. Gisella Maria Zanin, DSc (DEQ/UEM)
Prof. Paulo Luiz de Andrade Coutinho, DSc (BRASKEN)
Profa. Ins Conceio Roberto, DSc (EEL/USP)
Prof. Donato Alexandre Gomes, DSc (EQ/UFRJ)
Profa. Ldia Maria Melo Santa Anna, DSc (PETROBRAS)
EQ/UFRJ 2011
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Prog. Ps-Grad. TPQBq/EQ/UFRJ Elcio Ribeiro Borges, 2011
iv
F ICHA CATALOGRFICA
Borges, Elcio Ribeiro.
DESENVOLVIMENTO DE UM PROCESSO BIOTECNOLGICO PARA PRODUO DE CIDO
SUCCNICO POR Actinobacillus Succinogenes / Elcio Ribeiro Borges Rio
de Janeiro, 2011.
Tese (Doutorado em Cincias) Universidade Federal do Rio de
Janeiro - UFRJ, Escola de Qumica, Programa de Ps-Graduao em
Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos, 2011.
Orientador: Nei Pereira Jr., PhD.
1. cido succnico 2. Fermentao 3. Bagao de cana-de-aucar 4. Gs
carbnico
I. Pereira Jr., Nei (Orient.) II. Universidade Federal do Rio de
Janeiro. Escola de Qumica. Ps-Graduao em Tecnologia de Processos
Qumicos e Bioqumicos. III. Ttulo.
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Prog. Ps-Grad. TPQBq/EQ/UFRJ Elcio Ribeiro Borges, 2011
v
memria de minha me, Lucia Helena Ribeiro Borges, memria do meu
irmo, Erick Anderson Ribeiro Borges,
Famlia e entes queridos, Saudosamente,
Dedico
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Prog. Ps-Grad. TPQBq/EQ/UFRJ Elcio Ribeiro Borges, 2011
vi
"A cada dia que vivo, mais me conveno de que o desperdcio da
vida est no amor que no damos, nas foras que no usamos, na
prudncia
egosta que nada arrisca."
Carlos Drummond de Andrade
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Prog. Ps-Grad. TPQBq/EQ/UFRJ Elcio Ribeiro Borges, 2011
vii
AGRADECIMENTOS
Ao meu querido orientador, Professor Nei Pereira Jr, pelo
presente concedido atravs da possibilidade de fazer parte de uma
jornada de conhecimentos e vivenciar experincias, bastante
sustentadoras, no mbito profissional e pessoal. Saber enxergar, sem
ressalvas, a potencialidade de cada aluno e acrescent-los em sua
rotina de trabalho, de forma enriquecedora, um privilgio daqueles
que possuem uma racionalidade intuitiva, contribuindo imensamente
para elevar o potencial de nossa Universidade. Diante de tanto
talento e contribuio, palavras a mais se tornam mera redundncia. No
obstante, qualquer tentativa de registrar minha gratido, em algumas
linhas, no suficiente para estimar a imensido de minha admirao,
respeito e inspirao. Porm, cada pgina traz consigo a presena
sensvel de uma felicidade invisvel, silenciosa, sempre motivada e
direcionada por uma orientao de notvel qualidade, excelncia e
singularidade;
Ao Departamento de Engenharia Bioqumica e seus funcionrios,
especialmente ao tcnico Luiz Cludio, pelo fundamental apoio no
ambiente de trabalho e pela indispensvel atuao administrativa. Alm
do convvio, amizade e confiana conquistados ao longo dos ltimos
anos, de forma incisiva e verdadeira;
minha famlia, pela gratificante oportunidade de solidificar
diversos valores pessoais de carter, envolvendo acertos e erros no
educantrio terrestre, contribuindo para o meu crescimento e
amadurecimento;
minha querida e saudosa me, Lucia Helena Ribeiro Borges, pela
constncia de seus ensinamentos repletos de amor, carinho e
incentivos. Mesmo ausente, fisicamente neste plano, conforta e
emana a vibrao que alimenta a minha f e esperana, ajudando a
superar de forma obstinada toda e qualquer provao;
Aos companheiros de trabalho, Patrcia, Flvia, Vernica, Eleandro,
Liliana, Mariana, Ludmylla, Fabio, Diogo, Carolina, Paulo, Vanessa,
Roberto, Gabriel, Jorge, Graziela e a todos aqueles que fizeram
parte de gratas recordaes;
Danielle Silveira dos Santos, particularmente, pela presena
inevitavelmente sustentadora em todos os momentos aparentemente
difceis, contribuindo efetivamente para formulao e definio do real
significado das palavras amizade e confiana;
Ao Programa de Ps-graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e
Bioqumicos da Escola de Qumica da UFRJ, pela agradvel recepo e
convivncia diria;
Ao CNPq, FAPERJ e PETROBRAS pelo apoio financeiro.
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Prog. Ps-Grad. TPQBq/EQ/UFRJ Elcio Ribeiro Borges, 2011
viii
RESUMO
BORGES, Elcio Ribeiro. Desenvolvimento de um processo para
produo de cido succnico por Actinobacillus succinogenes.
Orientador: Nei Pereira Jr. Escola de Qumica - Universidade Federal
do Rio de Janeiro, 2011.
Atualmente, a maioria do cido succnico produzido comercialmente
feito por sntese qumica. Entretanto, recentemente a ateno tem sido
focalizada na produo microbiana de cido succnico por microrganismos
como uma alternativa para a sntese qumica. Neste trabalho
objetivou-se definir uma estratgia de produo de cido succnico, por
Actinobacillus succinogenes CIP 106512, em fermentaes com
hidrolisado hemicelullsico de bagao de cana-de-acar. Inicialmente,
trs estratgias de planejamentos experimentais sequenciais foram
adotadas para a otimizao do processo. Adicionalmente, o processo de
Sacarificao e Fermentao Simultneas (SSF), tambm foi realizado. Em
uma primeira etapa, foi desenvolvido um Planejamento Fatorial
Fracionado PFF 241, seguido de um Delineamento Composto Central
Rotacional (DCCR), para se estimar o efeito de cada varivel. As
melhores concentraes de nutrientes para formulao do meio de
cultivo, segundo o resultado predito pelo modelo foram: NaHCO3,
10,0 g/L; MgSO4, 3,0 g/L; Extrato de levedura, 2,0 g/L e KH2PO4,
5,0 g/L. Posteriormente, um Planejamento Fatorial Fracionado PFF 2
5-1 foi delineado para a avaliao das seguintes condies: concentrao
de substrato, extrato de levedura, temperatura, agitao e pH. A
validao das condies timas, em biorreator instrumentado, para produo
de cido succnico a partir da frao hemicelulsica do bagao de
cana-de-acar, resultou em uma concentrao final de produto igual a
40,3 g/L, com 80,0 g/L de concentrao inicial de xilose, sob agitao
de 150 rpm a 37C. Finalmente, um modelo cintico simples para a
produo de cido succnico a partir de glicose, incluindo os termos de
inibio pelo substrato e pelo produto, foi proposto baseando-se em
modelos encontrados na literatura. O perfil de crescimento celular
da bactria A. succinogenes pode ser expresso por um modelo de Monod
expandido, incorporando a inibio causada pela concentrao de glicose
e pelos cidos orgnicos (metablitos secundrios) acumulados durante a
fermentao. Com outros modelos elaborados, como o de Andrews,
Levenspiel e Luedeking-Piret foi obter condies para descrever a
formao do produto e o perfil de subprodutos. Em todos os casos, as
simulaes do modelo mostraram-se satisfatrias e de acordo com os
dados experimentais, sendo possvel facilitar a compreenso do
aspecto cintico da fermentao durante a converso em cido succnico. O
modelo proposto pode ser til para o desenvolvimento e o
aperfeioamento dos processos para a produo de cido succnico a
partir de fontes renovveis.
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Prog. Ps-Grad. TPQBq/EQ/UFRJ Elcio Ribeiro Borges, 2011
ix
ABSTRACT
BORGES, Elcio Ribeiro. Development of a process for succinic
acid production by Actinobacillus succinogenes. Supervisor: Nei
Pereira Jr. High School of Federal University of Rio de Janeiro
Brazil , 2011.
Nowadays the majority of succinic acid produced commercially is
made by chemical synthesis. However, attention has been focused on
microbial succinic acid production as an alternative to chemical
synthesis. This work aims at defining a strategy for succinic acid
production by Actinobacillus succinogenes from the hemicellulose
hydrolysate of sugarcane bagasse. Additionally, the Simultaneous
Saccharification and Fermentation (SSF) has been processed. In a
first approach, three sequencial experimental designs were
performed for optimizing the succinic acid production. The first
experiment consisted of a 241 fractional factorial design, and the
second entailed a Central Composite Rotational Design so as to
achieve optimal conditions. The optimal concentrations of nutrients
predicted by the model were: NaHCO3, 10,0 g/L; MgSO4, 3,0 g/L;
yeast extract, 2,0 g/L; KH2PO4. 5,0 g/L; wich these were
experimentally validated. In the third experiment, the fermentation
was carried out using a two-level fractional factorial design 25-1.
The variables analyzed and their levels were: concentration of
substrate; yeast extract, temperature, pH and agitation. Under the
best conversion conditions, as determined by statistical analysis,
the production of succinic acid was carried out bachwise in an
instrumented bioreactor using sugarcane bagasse hemicellulose
hydrolysate, yielding a concentration of 40,3 g/L, with 80,0 g/L of
initial concentration, at temperature 37C and orbital agitation at
150rpm. Finally, the kinetic model was performed for succinic acid
production by Actinobacillus succinogenes, based on models told in
the researches, that use conditions for substrate and product
inhibitions. The growth of Actinobacillus succinogenes strain could
be showed by a modified Monod model incorporating inhibitions
effects of substrate and products in the fermentation. In agreement
with the literature, several models were able to describe the
formation of organic acids presents during fermentation process. In
all analyse, the kinetic model simulation showed a great adjustment
with the experimental observations. The proposed model can be
useful for the development and optimization of succinic acid
production process, contributing to the subsequent studies.
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x
SMARIO
AGRADECIMENTOS........................................................................................................
VII RESUMO
.........................................................................................................................
VIII
ABSTRACT........................................................................................................................
IX SMARIO
...........................................................................................................................X
CAPTULO 1
.......................................................................................................................1
APRESENTAO DO TEMA DA
TESE..............................................................................1
CAPTULO 2
.......................................................................................................................6
REVISO
BIBLIOGRFICA................................................................................................6
2.1. cidos
orgnicos......................................................................................................7
2.1.1. Aspectos histricos
...........................................................................................8
2.1.2.
Comercializao................................................................................................8
2.1.3. cidos orgnicos como blocos de
construo.................................................12
2.2. cido succnico
......................................................................................................15
2.2.1. Aplicaes do cido
succnico.........................................................................16
2.2.2. Biopolmeros, bioplsticos e plsticos biodegradveis
....................................20 2.2.2.1. O Potencial das
inovaes de base biotecnolgica em biopolmeros...........23
2.3. Aspectos mercadolgicos da produo mundial de cido succnico
......................24 2.4. Processos de produo de cido succnico
...........................................................26
2.4.1. Rota qumica
...................................................................................................26
2.4.2. Rota fermentativa
...........................................................................................27
2.4.2.1. Matrias-primas utilizadas na produo de cido succnico
.........................28 2.4.3. Materiais
lignocelulsicos................................................................................30
2.4.3.1. Celulose
.......................................................................................................32
2.4.3.2. A Lignina
......................................................................................................33
2.4.3.3. A Frao
Hemicelulsica..............................................................................33
2.4.4. Materiais lignocelulsicos e o contexto de
biorrefinaria...................................34 2.4.5. Bagao de
cana-de-acar
.............................................................................35
2.4.6. Tipos de
Pr-Tratamento.................................................................................36
2.4.6.1. Pr-tratamento cido
....................................................................................38
2.4.6.1.1. Inibidores do processo de
fermentao.....................................................39
2.4.6.1.2. Processos de
Destoxificao.....................................................................40
2.4.6.1.3. Pr-tratamento alcalino
.............................................................................41
2.4.6.1.4. Hidrlise enzimtica da celulose
...............................................................41
2.4.7. Sacarificao e fermentao simultneas (SSF)
.............................................44 2.4.8. Sacarificao
com co-fermentao simultneas
(SSCF).................................45 2.4.9. Microrganismos
produtores de cido
succnico..............................................46 2.4.9.1.
Metabolismo na produo de cido succnico
..............................................49
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2.5. Processos de recuperao e purificao de cidos orgnicos
...............................52 2.5.1. Processos de separao e
recuperao de cido succnico ...........................53
2.6. Modelagem e Simulao de Processos
.................................................................56
2.6.1. Modelagem de Processos Biotecnolgicos
.....................................................57 2.6.2.
Modelos cinticos de crescimento microbiano
................................................61 2.6.3. Mtodos
matemticos utilizados para a resoluo dos modelos
....................65 2.6.3.1. Mtodo dos resduos ponderados
...............................................................65
2.6.3.2. Mtodo de Colocao Ortogonal
.................................................................65
2.6.3.3. Mtodo das Linhas
.......................................................................................65
2.6.3.4. Mtodo de Runge-Kutta
...............................................................................65
2.6.3.5. Planejamento
Experimental..........................................................................66
2.7. Estratgias de fermentao para a produo de cido succnico
..........................67 2.8. Consideraes
gerais.............................................................................................72
CAPTULO 3
.....................................................................................................................74
JUSTIFICATIVAS E
OBJETIVOS......................................................................................74
3.1.
Justificativa.............................................................................................................74
3.2. Objetivo geral
.........................................................................................................75
3.2.1. Objetivos
especficos.......................................................................................76
CAPTULO 4
.....................................................................................................................77
MATERIAIS E
MTODOS.................................................................................................77
4.1. Esterilizao das vidrarias e do meio de cultivo
.....................................................78 4.2.
Material
microbiolgico...........................................................................................78
4.2.1. Microrganismo
utilizado...................................................................................78
4.2.2. Manuteno do microrganismo
.......................................................................78
4.2.3. Observao microscpica
...............................................................................79
4.3. Meios empregados para ativao, propagao e fermentao
..............................79 4.3.1. Meio de ativao para obteno
do pr-inculo .............................................79 4.3.2.
Inculo.............................................................................................................80
4.3.3. Meios de
Fermentao....................................................................................82
4.3.4. Processo de propagao mediante aclimatao
celular..................................83
4.4. Processos de fermentao em frascos
agitados....................................................84
4.4.1. Fermentao em presena de CO2 na fase gasosa
........................................86
4.5. Avaliao da influncia da relao C:N no crescimento celular
.............................87 4.5.1 Anlise estatstica
............................................................................................88
4.6. Planejamentos experimentais sequenciais para a
otimizao................................88 4.6.1 Avaliao da
influncia dos componentes do meio de fermentao (PFF) ......88
4.6.2. Delineamento Composto Central
Rotacional...................................................89
4.6.3. Otimizao das condies de cultivo do processo atravs de PFF
.................90
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4.6.4. Anlise estatstica
...........................................................................................90
4.7. Fermentao em biorreator instrumentado a partir de meio
sinttico....................91 4.8. Fermentao em biorreator a
partir da frao hemicelulsica................................92
4.8.1. Pr-tratamento
cido.......................................................................................92
4.8.2. Fermentao em biorreator
instrumentado......................................................92
4.9. Experimentos empregando a estratgia SSF
........................................................93 4.9.1.
Pr-tratamento alcalino
...................................................................................93
4.9.2. Pr-hidrlise enzimtica
..................................................................................94
4.9.3. Processo SSF em biorreator
...........................................................................95
4.10. Desenvolvimento de um modelo para produo de cido succnico
....................95 4.10.1. Avaliao e estimao dos parmetros
cinticos ..........................................96 4.10.2.
Modelo para estimao dos
parmetros........................................................98
4.11.
Amostragem.........................................................................................................98
4.12. Mtodos Analticos
...............................................................................................99
4.12.1. Determinao de
biomassa...........................................................................99
4.12.2. Determinaes quantitativas
.......................................................................100
4.12.3. Medida do
pH..............................................................................................101
4.13. Avaliao de resultados
.....................................................................................101
4.13.1. Clculo de eficincia do processo
...............................................................101
4.13.2. Taxa instantnea especfica de crescimento microbiano
............................101 4.13.3. Tempo de duplicao
..................................................................................102
4.13.4. Variveis de
Resposta................................................................................103
CAPTULO
5......................................................................................................................104
RESULTADOS E DISCUSSO
..............................................................................................104
5.1. Levantamento de informaes e panorama geral das pesquisas
sobre AS .........105 5.2. Morfologia da linhagem Actinobacillus
succinogenes...........................................107 5.3.
Padronizao da metodologia para ativao celular e preparo de inculo
...........108
5.3.1. Cultivo de ativao em meio sinttico
...........................................................108
5.3.2. Cultivo de crescimento para obteno de inculo
.........................................109 5.4. Processo de
fermentao mediante estratgias de aclimatao celular
..............112 5.5. Avaliao do efeito da fonte de carbono e
influncia da relao C:N ..................115 5.6. Planejamentos
experimentais seqenciais para otimizao do processo
............119
5.6.1. Planejamento Experimental Fatorial Fracionado PFF 24-1
.............................119 5.6.2. Delineamento Composto
Central Rotacional (DCCR)
...................................125
5.7. Planejamento Experimental Fatorial Fracionado PFF25-1
.....................................134 5.8. Ensaios experimentais
em biorreator
...................................................................142
5.8.1. Formao de Subprodutos
............................................................................158
5.9. Avaliao da produo de cido succnico pelo processo SSF
...........................160
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5.10. Evoluo dos experimentos desenvolvidos na produo de cido
succnico .....166 5.11. Comparao entre os processos a partir do
hidrolisado hemicelulsico e SSF .168 5.12. Desenvolvimento de um
modelo para produo de cido succnico ..................170
5.12.1. Classificao do perfil para o crescimento celular
.......................................170 5.12.2. Classificao para
o perfil de formao de produto e subprodutos .............175
5.12.3. Classificao do perfil de consumo de
substrato.........................................175
5.13. Consideraes finais
..........................................................................................176
CAPTULO
6......................................................................................................................178
CONCLUSES
...................................................................................................................178
6.1. Concluses
..........................................................................................................178
6.2. Sugestes
............................................................................................................181
CAPTULO
7......................................................................................................................182
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
.........................................................................................182
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xiv
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1. Estrutura qumica do cido
succnico...............................................................................
16 Figura 2.2. Produtos obtidos a partir do cido succnico
...................................................................
19 Figura 2.3. Polisteres alifticos e aromticos.
..................................................................................
21 Figura 2.4. Estruturas possveis para os copolmeros
PET-co-PES.................................................. 23
Figura 2.6. Principais matrias-primas glicdicas e seus substratos
correspondentes...................... 30 Figura 2.7. Polmeros
constituintes do material
lignoceulsico..........................................................
30 Figura 2.8. Disposio das molculas de
glicose.........................................................................
32 Figura 2.9. lcoois precursores da lignina
.........................................................................................
33 Figura 2.11. Esquema simplificado das rotas tecnolgicas
(Biorrefinarias)....................................... 35 Figura
2.12. Enzimas envolvidas na hidrlise da celulose.
................................................................ 42
Figura 2.13. Diagrama de blocos do processo
SSF...........................................................................
44 Figura 2.14. Diagrama de blocos do processo SSCF.
.......................................................................
45 Figura 2.15. Via bioqumica para sntese de succinato, por E.
coli.................................................... 50 Figura
2.16. Metabolismo de A. succiniciproducens e A.
succinogenes............................................ 51 Figura
2.17. Transporte de diferentes espcies atravs de uma
membrana..................................... 53 Figura 2.18.
Processo de separao e purificao de cido succnico
............................................. 54 Figura 2.19.
Esquema de funcionamento de membranas bipolares de
eletrodilise.......................... 55 Figura 2.20. Diagrama de
blocos da produo de cidos orgnicos por
fermentao...................... 55 Figura 2.21. Resumo de alguns
parmetros, fenmenos e interaes dos estudos cinticos.......... 58
Figura 2.22. Classificao dos modelos matemticos
.......................................................................
59 Figura 2.23. Padres cinticos de crescimento celular e formao de
produtos............................... 64 Figura 4.1. Esquema
representativo das estratgias para a padronizao do inculo
..................... 81 Figura 4.2. Metodologia para propagao
celular..
............................................................................
83 Figura 4.3. Esquema ilustrativo geral para crescimento celular e
produo de cido succnico....... 85 Figura 4.4. Esquema ilustrativo
do sistema de adio de CO2
.......................................................... 86
Figura 4.5. Biorreator BIOFLO III (New .Brunswick) utilizado na
produo de cido succnico ........ 91 Figura 4.6. Etapas do
pr-tratamento cido do bagao de cana-de-acar
...................................... 92 Figura 4.7. Etapas do
pr-tratamento alcalino
...................................................................................
93 Figura 4.8. Aspecto da celulignina aps a pr-hidrlise enzimtica,
em frascos agitados ............... 94 Figura 4.9. Celulignina aps
a pr-hidrlise enzimtica, em biorreator
............................................ 94 Figura 4.10.
Diagrama de blocos para o tratamento das amostras.
.................................................. 99 Figura 4.11.
Cromatograma tpico com identificao dos cidos orgnicos
.................................... 101 Figura 5.1. Nmero de
patentes e trabalhos publicados, at
2010.......................................... 105 Figura 5.2.
Peridicos com maior nmero de publicaes e os temas mais estudados,
at 2010 . 106 Figura 5.3. Observao microscpica das linhagens
Actinobacillus succinogenes ....................... 107 Figura 5.4.
Cintica de crescimento do cultivo de ativao da bactria A.
succinogenes .............. 109 Figura 5.5. Cintica de crescimento
do inculo em meio sinttico
(xilose)...................................... 110 Figura 5.6.
Cintica de crescimento do inculo em meio sinttico
(glicose).................................... 110
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Figura 5.7. Cintica de crescimento do inculo contendo
hidrolisado hemicelulsico diludo......... 111 Figura 5.8. Cintica
de fermentao de em meio sinttico
.............................................................. 112
Figura 5.9. Perfil de crescimento celular a partir das estratgias
de propagao celular................ 113 Figura 5.10. Efeitos de
diferentes fontes de carbono na produo de biomassa
........................... 115 Figura 5.11. Produo de biomassa em
meio, com xilose, em diferentes razes C:N.................... 116
Figura 5.12. Produo de biomassa em meio, com glicose, em diferentes
razes C:N.................. 116 Figura 5.13. Efeitos de diferentes
fontes de carbono na concentrao de AS
................................ 118 Figura 5.14. Efeitos de
diferentes fontes de carbono na concentrao de AS
(histograma)........... 118 Figura 5.15. Histograma de influncia
das variveis e suas interaes, do PFF 24-1 ..................... 123
Figura 5.16. Diagrama de Pareto para o efeito estimado das variveis
......................................... 124 Figura 5.17.
Superfcie de resposta mostrando o efeito da interao entre as
variveis. ............... 125 Figura 5.18. Histograma de influncia
das variveis e suas interaes, para o DCCR................... 131
Figura.5.19.Superfcie de resposta dos efeitos combinados (DCCR)
para xilose ........................... 132 Figura.5.20.Superfcie
de resposta dos efeitos combinados (DCCR) para glicose..
....................... 133 Figura 5.21. Diagrama de Pareto para os
efeitos estimados pelo PFF 2 5-1 (24h) ..........................
139 Figura 5.22. Diagrama de Pareto para os efeitos estimados pelo
PFF 2 5-1 (48h) .......................... 140 Figura 5.23.
Superfcie de resposta da concentrao de cido succnico a partir de
glicose ......... 141 Figura 5.24. Superfcie de resposta da
concentrao de cido succnico a partir de xilose ........... 141
Figura 5.25. Fermentao em meio sinttico, com 22,0 g.L-1 de
xilose........................................... 143 Figura 5.26.
Fermentao em meio sinttico de composio definida aps otimizao.
................ 145 Figura 5.27. Fermentao do hidrolisado
hemicelulsico, com 22,0 g.L-1 de xilose........................ 146
Figura 5.28. Fermentao em meio sinttico, com 52,0 g.L-1 de
xilose........................................... 148 Figura 5.29.
Fermentao em meio sinttico de composio definida aps otimizao
................. 149 Figura 5.30. Fermentao do hidrolisado
hemicelulsico, com 52,0 g.L-1 de xilose........................ 151
Figura 5.31. Fermentao em meio sinttico, com 80,0 g.L-1 de
xilose........................................... 152 Figura 5.32.
Fermentao em meio sinttico de composio definida aps otimizao
................. 154 Figura 5.33. Fermentao do hidrolisado
hemicelulsico, com 80,0 g.L-1 de xilose ........................
155 Figura 5.34. Concentrao final de produto e subprodutos do
processo SSF ................................ 161 Figura 5.35.
Perfil cintico do processo SSF, em frascos agitados.
................................................ 162 Figura 5.36.
Perfil cintico do processo de fermentao, em
biorreator.......................................... 163 Figura
5.37. Perfil cintico do processo SSF com concentrao de glicose
igual a 81,0 g.L-1........ 164 Figura 5.38. Evoluo da produo de
cido succnico com o decorrer do trabalho ...................... 168
Figura 5.39. Avaliao dos efeitos da concentrao inicial de glicose
sob a tx de cresc ................ 172 Figura 5.40. Perfil cintico
de formao de cido succnico, crescimento celular e consumo de
substrato (glicose).
...........................................................................................................................
173 Figura 5.41. Perfil cintico da formao dos cidos actico, frmico
e ltico .................................. 174
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LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1. Pontos de ebulio, frmulas moleculares e constantes
(Ka) . ..............................................7 Tabela 2.2.
Ano de descoberta e/ou isolamento de alguns cidos orgnicos
..........................................8 Tabela 2.3. Blocos
primrios produzidos por rota fermentativa ou qumica
............................................13 Tabela 2.4.
Candidatos em potencial como blocos de construo
..........................................................13 Tabela
2.5. Valores de produtividade e rendimento de alguns cidos
orgnicos...................................14 Tabela 2.6 .
Caractersticas do cido succnico
.......................................................................................16
Tabela 2.7. Composio de resduos agro-industriais
.............................................................................31
Tabela 2.8. Constituintes bsicos de alguns materiais
lignocelulsicos
..................................................31 Tabela 2.9.
Parmetros para aplicao de processos de separao
......................................................53 Tabela
2.10. Tipos de modelos usados em processos
microbianos........................................................59
Tabela 2.11. Modelos cinticos no estruturados .
..................................................................................62
Tabela 2.12. Modelos para formao de produto metablico
inibitrio....................................................64
Tabela 2.13. Valores encontrados e calculados para diferentes
estratgias de fermentao.................68 Tabela 4.1. Meio de
manuteno
(TSA)...................................................................................................79
Tabela 4.2. Composio do meio utilizado para
pr-inculo....................................................................79
Tabela 4 3. Composio do meio de crescimento utilizado para inculo
................................................82 Tabela 4.4.
Composio do meio sinttico para fermentao
.................................................................82
Tabela 4.5. Composio qumica do meio lquido com diferentes razes
C:N........................................87 Tabela 4.6. Parmetros
e nveis usados no PFF
24-1...............................................................................89
Tabela 4.7. Parmetros e nveis usados no
DCCR..................................................................................90
Tabela 4.8. Variveis analisadas no PFF e nveis codificados e reais.
...................................................90 Tabela 4.9.
Composio do meio de fermentao, aps estudos de
otimizao....................................91 Tabela 4.10. Condies
operacionais do cromatgrafo
.........................................................................100
Tabela 4.11. Condies operacionais do cromatgrafo (cidos orgnicos)
..........................................101 Tabela 5.1. Parmetros
relevantes nos processos de propagao de clulas de A. succinogenes.
...111 Tabela 5. 2. Variveis de Resposta na Avaliao do Efeito da
Aclimatao........................................114 Tabela 5.3.
Influncia da concentrao inicial de substrato e da razo C:N no
crescimento celular. ..117 Tabela 5.4. Matriz experimental do PFF
24-1 e concentrao final de cido succnico, para xilose......119
Tabela 5.5. Matriz experimental do PFF 24-1 e concentrao final de
cido succnico, para glicose....120 Tabela 5.6. Anlise de varincia
(ANOVA), no PFF 241 para xilose como fonte de
carbono..............122 Tabela 5.7. Anlise de varincia (ANOVA), no
PFF 241 para glicose como fonte de carbono............122 Tabela
5.8. Matriz experimental do DCCR investigando os efeitos dos
nutrientes do meio (xilose) ....127 Tabela 5.9. Matriz experimental
do DCCR investigando os efeitos dos nutrientes do meio (glicose)
..128 Tabela 5.10. Anlise de varincia (ANOVA) para xilose como
fonte de carbono.................................129 Tabela 5.11.
Anlise de varincia (ANOVA) para glicose como fonte de
carbono...............................130 Tabela 5.12. Matriz
experimental do planejamento fatorial fracionado PFF 25-1 para
glicose ..............135 Tabela 5.13. Matriz experimental do
planejamento fatorial fracionado PFF 25-1 para xilose
................135 Tabela 5.14. Efeitos estimados do planejamento
fatorial fracionrio PFF 25-1 glicose (24h)................136
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Tabela 5.15. Efeitos estimados do planejamento fatorial
fracionrio PFF 25-1 xilose(24h)...................137 Tabela 5.16.
Efeitos estimados do p lanejamento fatorial fracionrio PFF 25-1
para glicose (48h) ......138 Tabela 5.17. Efeitos estimados do
planejamento fatorial fracionrio PFF 25-1 para xilose
(48h)..........138 Tabela 5.18. Variveis de resposta obtidos para
meio sinttico e hidrolisado hemicelulsico..............157 Tabela
5.19. Concentrao final de produto e subprodutos dos processos de
fermentao ..............159 Tabela 5.20. Variveis de resposta e
concentrao de produto e subprodutos pelo processo SSF. ..165 Tabela
5.21. Resultados finais e evoluo do processo para a produo de cido
succnico ............167 Tabela 5.22. Produo de cido succnico a
partir dos hidrolisados hemicelulsico e celulsico .......169 Tabela
5.23. Valores obtidos dos parmetros cinticos de
fermentao..............................................171
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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
SIGLAS
ABS: Absorvncia; AIE: Agncia Internacional de Energia; ANOVA:
Anlise de varincia; ARD: Agro-industrie Recherches e Dveloppements;
AS: cido succnico; AA: cido actico; AS: cido frmico; AL: cido
ltico; ATP: Adenosina trifosfato; ATP: Adenosina trifosfato; ATP:
Adenosina trifosfato; BHT: Butirolactona; CBH: Celobiohidrolases;
CIP: Institut Pasteur Collection; CM: Concentrao mxima; CTA:
Triacetato de celulose; DCCCF: Delineamento composto Central de
Faces-centradas; DCCR: Delineamento Composto Central Rotacional;
DNP: Diversified Natural Products; DOE: Departamento de Energias do
EUA; DSP: Processo de Separao e Purificao; EBMP: Membranas
bipolares de eletrodilise; ED: Eletrodilise; EDO: Equaes
diferenciais ordinrias; EDP: Equaes diferenciais parciais; EL:
Extrato de levedura; ELL: Extrao lquido-lquido; EMP:
Embden-Meyerhof Pathway; EVOH: Copolmero de etileno e lcool
vinlico; GL: Graus de Liberdade; GT: Grupo de trabalho; GT-6: Grupo
de trabalho;
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CLAE: Cromatografia lquida de alta eficincia; IBGE: Instituto
brasileiro de geografia e estatstica; IUPAC: Unio Internacional de
Qumica Pura e Aplicada; IV: Infravermelho; KEGG: Kyoto Encyclopedia
of Genes and Genomes; LADEBIO: Laboratrio de Desenvolvimento de
Bioprocessos-Departamento de Engenharia Qumica-Escola de
Qumica/UFRJ; MAPA: Ministrio de Agricultura, Pecuria e
Abastecimento; MBI: International, Myriant Technologies; MCG: Meio
de Crescimento Guetler; MCL: Meio de Crescimento LADEBIO; MCT: Meio
de Crescimento Triptona; MF: Microfiltrao; MQ: Mdia Quadrtica; NF:
Nanofiltrao; OI: Osmose Inversa; P.E: Ponto de ebulio; P.F: Ponto
de fuso; PA: Poliamida; PB: Plackett-Burman; PBS:
Polibutilenosuccinato; PBT: Polibutilenotereftalado; PC: Pontos
centrais; PCCell: Modelo e marca de membrana de
eletrodilise(Electrodialysis Cell); PEP: Fosfoenolpiruvato;
PES:Polisuccinato de etileno; PET: Polietileno tereftalato; PFF:
Planejamento Experimental Fatorial Fracionrio; PFF: Planejamento
Experimental Fatorial; PFF: Planejamento Fatorial Fracionrio; PHA:
Polihidroxialcanoato; PIM: Polymer inclusion membranes; PROALCOOL:
Programa Nacional do lcool; PST: Polisuccinato tereftalato; PVC:
Poli (cloreto) de vinila; PVDC: Copolmero de cloreto de vinilideno;
RSM: Superfcie de Resposta;
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SES: Succinato etileno succinato; SQ: Soma Quadrtica; TCA: Ciclo
dos cidos tricarboxlicos; TCA: Ciclo dos cidos tricarboxlicos; TES:
Tereftalato etileno succinato; TET: Tereftalato etileno
tereftalato; THF: Tetrahidrofurano; TSA: Agar Triptona de Soja
500gr M/Difco TSA: Agar Triptona de Soja 500gr M/Difco; TSB: Caldo
de Triptona de Soja - 500gr M/Difco; TSB: Caldo de Triptona de Soja
- 500gr M/Difco; UF: Ultrafiltrao; UNICA: Unio de Agroindstria
Canavieira de So Paulo
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NOMENCLATURA MATEMTICA
Ef: eficincia, expressa em porcentagem;
fd: fator de diluio empregado na soluo;
g: gramas; h: hora; Ka: constantes de dissociao cida; Kd: taxa
de mortalidade especfica (h-1); Ki : constante de inibio do
substrato (g/L); KS: constante de saturao do substrato (g/L); L:
litro; mg: miligrama; MMAS: massa molecular do cido succnico; MMGl:
massa molecular da glicose; mmol/L: milimol por litro; ms:
coeficiente de manuteno energtic (g/g.h); P: concentrao de produto
(g/L); P: concentrao final de cido succnico, g/L; PCRIT: concentrao
crtica de produto (g/L); pH: potencial hidrogeninico; Po:
concentrao inicial de cido succnico, g/L; QP: produtividade
volumtrica em cido succnico, g/L.h; r
X : taxa de formao de biomassa (g/L.h); rSA : taxas de formao
dos cidos succnico (g/L.h); S: concentrao final de substrato, g/L;
So: concentrao inicial de substrato, g/L; T: temperatura, oC; td:
tempo de duplicao, horas; tf: tempo de fermentao, horas; v/v: relao
volume/volume; vvm: vazo de ar por volume de meio por minuto,
min-1; X: concentrao final de biomassa, g/L; Xo: concentrao inicial
de biomassa, g/L; YAA: fator de rendimento estequiomtrico para cido
actico g/g; YAF: fator de rendimento estequiomtrico para cido
frmico g/g; YAL: fator de rendimento estequiomtrico para cido ltico
g/g;
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YP/S: fator de rendimento em produto por substrato consumido,
g/g; YX/S: fator de rendimento em biomassa por substrato consumido,
g/g; Z: Discrepncias quadrticas entre os dados experimentais e
simulados
Letras gregas
max: taxa especfica mxima de crescimento (h-1); :::: taxa de
crescimento especfico (h-1); AA: parmetro de formao de cido actico
associado ao crescimento (g/g); FA: parmetro de formao de cido
frmico associado ao crescimento (g/g); LA: parmetro de formao de
cido ltico associado ao crescimento (g/g); SA: parmetro de formao
de cido succnico associado ao crescimento (g/g); AA: parmetro de
formao de cido actico no associado ao crescimento (g/g); FA:
parmetro de formao de cido frmico no associado ao crescimento
(g/g); LA: parmetro de formao de cido ltico no associado ao
crescimento (g/g); AS: parmetro de formao de cido succnico no
associado ao crescimento (g/g)
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CAPTULO 1 APRESENTAO DO TEMA DA TESE
Uma etapa fundamental para o desenvolvimento sustentvel de uma
Sociedade a mudana da realidade dependente do petrleo para o uso
abundante de recursos renovveis. Os impactos ambientais,
decorrentes da queima de combustveis fsseis, representam uma
realidade com a qual a Sociedade tem que conviver, controlar e se
adaptar, necessitando de uma tomada de conscincia da importncia da
questo e exigindo mudanas em muitos hbitos de consumo e
comportamento (PEREIRA JR, 2010).
Grande parte dos especialistas sugere que, nos prximos anos, o
petrleo se tornar mais escasso e consideravelmente mais caro do que
nos dias atuais. Segundo o anurio Perspectiva de Energia Mundial
(2010), as observaes descritas pela Agncia Internacional de Energia
(AIE) indicam que sem a alterao da matriz energtica, os combustveis
fsseis responderiam por 90% do aumento projetado na demanda
mundial, at 2035. O crescimento da populao associado demanda por
combustveis e produtos qumicos, tem aumentado a busca e o
desenvolvimento para o uso mais diversificado de matria-prima
renovvel (EMBREE et al., 2001; WILLKE & VORLOPO, 2004).
Neste contexto, a indstria qumica do sculo XXI ser obrigada a
passar por uma completa reestruturao, recorrendo ao uso de recursos
renovveis como matria-prima bsica e Biotecnologia para realizao de
muitas transformaes qumicas (BRDTAC, 2002; NRC, 2000; WILKE,
2000).
A maior parte dos esquemas relacionados a uma indstria qumica a
base de biomassa envolve um pequeno nmero de molculas intermedirias
versteis, normalmente de baixa massa molar. Cada um destes
intermedirios-base d origem a uma
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famlia de substncias qumicas derivadas, obtidas por meio de
converses biolgicas ou, mais freqentemente, por reaes qumicas
tradicionais, em um esquema muito similar ao que ocorre na indstria
petroqumica atual (LYND et al., 1999). Nestes termos, um exemplo de
intermedirio-base que tem sido bastante reportado na literatura o
cido butanodiico, conhecido como cido succnico (WERPY &
PETERSON, 2004). Sendo passvel de obteno por rota fermentativa,
este cido tem o potencial para se tornar uma comoditie, produzido
em larga escala, podendo se constituir na base para o fornecimento
de uma srie de substncias intermedirias e produtos finais
importantes na indstria qumica, principalmente de biopolmeros a
partir de succinato, alm de ser um componente chave na produo de
mais de 30 produtos comercialmete importantes, na indstria de
alimentos, farmacutica e de cosmticos (MCKINLAY et al., 2007;
ZEIKUS & JAIN, 1999; SONG & LEE, 2005).
Cabe ressaltar que o cido succnico pode substituir mais de 250
produtos qumicos derivados do benzeno, que conhecidamente
carcinognico por todas as rotas de exposio (KERMANSHAHI et al.,
2005). Somado a sua importncia como bloco de construo para o
segmento industrial, uma vantagem adicional desta substncia qumica
reside na sua produo por fermentao, a qual ocorre com consumo de
CO2, fornecendo uma alternativa interessante para o problema de
seqestro do carbono (VAN DER WERF & GUETLER, 1997).
A maioria dos cidos orgnicos existentes no mercado produzida via
sntese qumica, gerando altos nveis de poluio. A evoluo do mercado
mundial dos produtos derivados de matrias-primas agro-industriais
est obrigando as empresas do Setor Qumico a incorporar novas
tecnologias para alcanar maiores ndices de qualidade e eficincia.
Na busca por produtos finais mais competitivos e rentveis, como por
exemplo, cidos orgnicos e plsticos biodegradveis, o setor
industrial vem sendo compelido a incorporar inovaes tecnolgicas,
desenvolvimentos de novos sistemas produtivos e de equipamentos
para processos que protejem o meio ambiente e gerem menor
quantidade de poluentes (CORDOBA, 2001).
O Frum de Competitividade em Biotecnologia foi constitudo para
definir as aes necessrias inscrio da rea de Biotecnologia entre as
vrias opes estratgicas da Poltica Industrial, Tecnolgica e de
Comrcio Exterior. O GT-6 vem avaliando o segmento da Biotecnologia
Industrial e Outras Aplicaes, que tem como referncia a classificao
de Biotecnologia Branca (White Biotechnology), como o setor que
aplica recursos naturais para a produo industrial de bioprodutos de
interesse comercial. As profundas alteraes ocorridas no setor
agroindustrial com apropriao de novas tecnologias e a formao de
grandes clusters de cadeia produtiva das culturas extensivas de
soja, cana-de-acar e milho (produo de sementes ou mudas, plantio,
colheita e beneficiamento) tm
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impulsionado a discusso sobre um novo modelo de indstria de
transformao destas matrias-primas renovveis em produtos qumicos
intermedirios e finais, atravs de modificaes fsicas, qumicas e
biolgicas (PRADELLA, 2006).
Esse modelo pressupe integrao de processos e de fluxos de
insumos, otimizao das utilidades industriais e da logstica de
transporte, alto rendimento de converso, alta produtividade e ampla
escala de produo, com a finalidade de reduzir custos, diversificar
e flexibilizar a produo, para responder s demandas de mercado,
modelo similar ao praticado pela indstria petroqumica. Por fazerem
uso de matrias-primas de origem biolgica e possurem um forte
componente de transformao bioqumica, prope-se o termo Biorrefinaria
para designar os processos ou os arranjos industriais dessa
natureza (PEREIRA JR, 2006).
As Biorrefinarias pertencem categoria dos agronegcios, devendo
ser consideradas uma extenso da cadeia produtiva agrcola e,
portanto, integradas fisicamente no processo de plantio, colheita,
beneficiamento e transformao desses plantios. Dentro desta
perspectiva, vrias categorias de produtos devem ser destacadas como
candidatas potenciais para desenvolvimento do chamado comoditie de
larga utilizao (RODRIGUEZ, 2006).
Do ponto de vista do balano energtico, as Biorrefinarias podem
ser extremamente eficientes, uma vez que os resduos lignocelulsicos
podem ser aproveitados para produo de energia, que ser consumida na
unidade industrial, gerando tambm crditos de carbono, passveis de
comercializao (PRADELLA et al., 2006). A cana-de-acar e seus
residuos constituem-se em fontes de carbono de baixo custo que
podem minimizar os custos de produo em relao aos seus sucedneos
advindos de petrleo.
O bagao de cana-de-acar apresenta-se como um dos materiais
lignocelulsicos com maior potencial para a obteno de diversos
produtos de interesse comercial. A separao seletiva das fraes do
material lignocelulsico de acordo com suas caractersticas qumicas
e/ou dos produtos a serem obtidos, representa uma das estratgias a
serem adotadas no campo da Biotecnologia.
Sendo a hemicelulose e a celulose, as principais fraes
estruturais do bagao de cana, representando uma fonte potencial de
xilose e glicose, respectivamente, o presente trabalho investiga o
desenvolvimento de um processo para a produo de cido succnico, por
uma linhagem de Actinobacillus succinogenes. Porm, a obteno desses
acares requer a aplicao de tcnicas que permitam a sua extrao
seletiva. No caso da extrao de xilose, so utilizadas diferentes
metodologias de solubilizao e hidrlise, dentre as quais o
pr-tratamento cido normalmente empregado (BETANCUR & PEREIRA
JR, 2010).
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Este trabalho faz parte de uma das linhas de pesquisas
desenvolvidas nos Laboratrios de Desenvolvimento de Bioprocessos
Escola de Qumica/ UFRJ, sob a coordenao do Prof. Dr. Nei Pereira
Jr., intitulada Valorizao de Resduos Lignocelulsicos para o
Aproveitamento Integral de Biomassas Residuais por Via
Biotecnolgica.
No que se refere produo internacional, o nmero de pesquisas vm
se destacando, de forma gradativa, ao longo dos ltimos anos, com
diferentes tipos de microrganismos. Em relao ao cenrio nacional,
possvel constatar alguns trabalhos em andamento acerca da produo de
cido succnico nas universidades de grande potencial.
Organizao do trabalho
O presente trabalho encontra-se estruturado em 7 captulos e uma
seo final, intitulada Anexos, incluindo os artigos publicados em
peridicos internacionais. O captulo dois apresenta a Reviso
Bibliogrfica dos aspectos relevantes ao assunto tratado,
ressaltando a importncia da produo de cido succnico e suas
potenciais utilizaes, alm de abordar aspectos cientficos,
tecnolgicos e econmicos. Neste captulo, tambm so descritos, de
forma sucinta, alguns fundamentos da modelagem matemtica de
processos biotecnolgicos, incluindo mtodos matemticos freqentemente
utilizados para resoluo destes modelos, alm de tcnicas para
otimizao e controle de processos.
No captulo trs, intitulado Justificativas e Objetivos, so
apresentados os motivos que levaram ao desenvolvimento desta tese,
bem como os objetivos especficos desenvolvidos.
O captulo quatro refere-se descrio dos Materiais e Mtodos
utilizados para a execuo deste trabalho, como por exemplo,
detalhamento das metodologias experimental e analtica adotadas, bem
como das tcnicas de planejamento experimental para a anlise dos
resultados.
Os Resultados e Discusso relativos s principais anlises
conduzidas encontram-se no quinto captulo. Para a otimizao dos
parmetros e condies de processo, foram desenvolvidos planejamentos
seqenciais para a realizao dos experimentos com maior grau de
confiabilidade. Foi avaliada a hierarquia de efeitos estimados
sobre a varivel de resposta do processo, bem como apresentados os
estudos iniciais dos parmetros cinticos para a modelagem do
processo visando produo de cido succnico, mediante o estudo do
comportamento microbiano durante a fermentao. No captulo seis so
registradas as Concluses e Sugestes do presente trabalho.
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Por fim, as Referncias Bibliogrficas so apresentadas no stimo
captulo, atravs das quais todas as informaes contidas nesse texto
podero ser localizadas e, obtidos mais detalhes sobre seus
registros.
Com o desenvolvimento da presente pesquisa, foram publicados
(ANEXO) os seguintes trabalhos:
Lista de trabalhos publicados em perdicos indexados: 1. Borges,
E.R. & Pereira Jr., N. Succinic acid production from sugarcane
bagasse
hemicellulose hydrolysate by Actinobacillus succinogenes.
Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, v. 13, p.
1-11, 2010.
2. Borges, E.R.; Souza, L.B.R & Pereira Jr, N. Study of
succinic acid production by Actinobacillus succinogenes. Jornal of
Life Sciences, v. 4, p. 5-12, 2010.
Trabalhos completos em congressos nacionais: 1. Borges, E.R.;
Souza, L.B.R & Pereira Jr., N. Uso de biomassas para produo
de
cio succnico por Actinobacillus succinogenes. IX SHEB - Seminrio
de Hidrlise Enzimtica e Biomassas, Maring-PR, 23 -27/11/2009.
2. Borges, E.R.; Souza, L.B.R. & Pereira Jr, N. Recuperao e
purificao de cido succnico obtido por um processo biotecnolgico.
XXXIV ENEMP - Congresso Brasileiro de Sistemas Particulados,
Campinas SP, 18 a 21/10/09.
3. Borges, E.R.; Souza, L.B.R & Pereira Jr, N. Estudo das
variveis de processo na produo de cido succnico por Actinobacillus
succinogenes. XVII SINAFERM Simpsio Nacional de Bioprocessos, Natal
RN.
4. Borges, E.R.; Souza, L.B.R. & Pereira Jr, N. Produo de
cido succnico por Actinobacillus succinogenes a partir do
hidrolisado da frao hemicelulsica do bagao de cana-de-acar. XVIII
SINAFERM Simpsio Nacional de Bioprocessos, Caxias do Sul RS. 24 a
27/07/2011. Situao: Aceito
Participao em eventos 1. Borges, E.R.; Souza, L.B.R. &
Pereira Jr, N. Influncias das Variveis de
Processo na Produo de cido Succnico por Actinobacillus
succinogenes. XXXI Jornada Giulio Massarani de Iniciao Cientfica,
Artstica e Cultural da UFRJ, Rio de Janeiro.
2. Borges, E.R.; Souza, L.B.R. & Pereira Jr, N. Influncia da
Razo C:N no Crescimento Celular e Biossntese de Metablitos Durante
a Produo de cido Orgnico. XXX Jornada Giulio Massarani de Iniciao
Cientfica, Artstica e Cultural da UFRJ, Rio de Janeiro.
3. Borges, E.R. & Pereira Jr, N. Succinic Acid Production
from Sugarcane Bagasse by Actinobacilus succinogene. 32nd Symposium
on Biotechnology for Fuels and Chemicals. 2010. Orlando/Flrida.
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CAPTULO 2 REVISO BIBLIOGRFICA
Neste captulo so apresentados os diferentes aspectos tericos
referentes temtica abordada: cidos orgnicos de interesse
industrial; o cido succnico e suas aplicaes no mercado;
microrganismos produtores e aspectos de metabolismo; o bagao de
cana como matria-prima para a produo do cido succnico; algumas
caractersticas relevantes ao processo de aproveitamento do material
lignocelulsico e consideraes importantes sobre o uso dos cidos
orgnicos como intermedirios na produo de plsticos biodegradveis e
como blocos de construo para a produo de substncias qumicas de
interesse comercial.
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2.1. cidos orgnicos
Os cidos orgnicos so importantes para a indstria de transformao,
principalmente a qumica, farmacutica e de alimentos. Podem ser
comercializados, tanto como cidos (com relativo grau de pureza), ou
na forma de sais deles derivados.
Ao contrrio das principais fermentaes de alimentos e de bebidas
cujas origens remontam antiguidade, os processos de produo desses
cidos s comearam a ser desenvolvidos nos ltimos cem anos. A
primeira fbrica, para produo em larga escala de uma substncia
qumica por fermentao, comeou a operar em 1881 em Massachusetts
(EUA) para produo de lactato de clcio, empregando bactrias.
Com exceo do cido clordrico presente no suco gstrico, os cidos
mais comuns com os quais convivemos so orgnicos, ou seja, queles
contendo tomos de carbono. Destes, o maior grupo o dos cidos
carboxlicos, que so os cidos caracterizados pela presena do grupo
funcional (COOH), a carboxila (SNYDER, 1995). As propriedades, para
alguns cidos carboxlicos, classificados como mono e dicarboxlicos,
de acordo com o nmero de carboxila presente em sua estrutura
qumicas, so apresentadas na Tabela 2.1 (SOLOMONS, 1996; HARRIS,
1999).
Tabela 2.1. Pontos de ebulio, frmulas moleculares e constantes
de dissociao cida (Ka) de alguns cidos carboxlicos.
cidos monocarboxlicos Nome do cido (IUPAC/nome usual) Frmula
molecular P.E/C Ka Metanico (frmico) HCOOH 100,5 1,80X10-4 Etanico
(actico) CH3COOH 118 1,75x10-5 Propanco (propinico) CH3CH2COOH 141
1,34 x10-5 Butanico (butrico) CH3CH2CH2COOH 164 1,52 x10-5
Pentanico (valrico) CH3(CH2)3COOH 187 1,44 x10-5 Hexanico (caprico)
CH3(CH2)4COOH 205 - Octanico (caprlico) CH3(CH2)6COOH 239 -
Decanico (cprico, P.F. 31) CH3(CH2)8COOH 269 -
cidos dicarboxlicos
Butanodiico (succnico,P.F.187C) HOOC(CH2)2COOH 235 K = 6,2 x
10-5
K = 2,3 x 10-6
Pentanodiico (glutrico, P.F. 98 C) HOOC(CH 2)3COOH 303 K = 4,6 x
10-5
K = 3,7 x 10-6
Hexanodiico (adpico, P.F. 153 C) HOOC(CH 2)4COOH 340 K = 3,8 x
10-5
K = 3,8 x 10-6
Fonte: (SOLOMONS, 1996; HARRIS, 1999).
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A presena do grupo COOH confere aos cidos carboxlicos, entre
outras propriedades, a de serem cidos fracos em meio aquoso e de
apresentarem elevados pontos de ebulio devido facilidade com que
formam interaes intermoleculares do tipo ligaes de hidrognio
(LINTOMEN et al., 1990).
2.1.1. Aspectos histricos
A descoberta dos cidos orgnicos est intimamente relacionada ao
desenvolvimento da qumica experimental. Neste contexto, Carl
Wilhelm Scheele (1742-1786), um notvel qumico experimental sueco,
desempenhou um papel primordial. Dentre os 15 a 20 mil experimentos
atribudos a ele, esto as descobertas de compostos orgnicos de
natureza cida (cidos carboxlicos e fenis), como os cidos tartrico
(2,3dihidroxibutanodiico), mlico (2-hidroxibutanodiico), lctico
(2-hidroxipropanico), oxlico (etanodiico), rico, glico
(3,4,5-trihidroxibenzico) e ctrico
(2-hidroxipropan-1,2,3-tricarboxlico) (FIORUCCI et al., 2002).
Scheele fez uso de reaes e tcnicas que at ento estavam intimamente
relacionadas com a Qumica Inorgnica (extraes por solventes, formaes
de sais, diferenas de solubilidade). Uma atribuio destas
descobertas e seus respectivos autores esto descritas na Tabela
2.2.
Tabela 2.2. Ano de descoberta e/ou isolamento de alguns cidos
orgnicos e seus respectivo descobridores.
cido Data Pesquisador Fonte descoberta Frmico 1500 H.
Brunschwigk Destilao por arraste de vapor de solues
contendo formigas Benzico 1556 M. Nostredame Sublimao da goma do
benjoim (resina extrada do benjoeiro) Succnico 1600 Oswald Croll
Sublimao do mbar (resina vegetal fssil) Tartrico 1770 C.W. Scheele
Do resduo de fermentao do vinho Pcrico 1771 Peter Woulfe Do
tratamento do ndigo com cido ntrico Oxlico 1760 J.C. Wiegleb
Isolado do trevo azedo (oxalis) Oxlico 1776 C.W. Scheele Oxidao do
acar com cido ntrico Ltico 1780 C.W. Scheele Fermentao do leite
azedo rico 1780 C.W. Scheele Dos resduos da urina Ctrico 1784 C.W.
Scheele Dos sucos de frutas ctricas Mlico 1785 C.W. Scheele Extrado
do suco de ma Glico 1786 C.W. Scheele Das nozes da Gala
Fonte: (FIORUCCI et al., 2002)
2.1.2. Comercializao
Os cidos orgnicos apresentam muitas aplicaes nas indstrias
qumica, farmacutica e alimentcia, com propriedades organolpticas
importantes, tanto que o
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sabor azedo caracterstico foi o primeiro critrio para
classificao destes compostos. Na indstria alimentcia, os cidos so
adicionados por diferentes propsitos, aos alimentos. As funes mais
importantes dessa adio so: conservantes devido participao em
sistemas tampo, a habilidade de produzir um sabor azedo (onde o
gerador o on hidrognio ou hidrnio - H3O+) e tambm, como acidulante,
devido capacidade de modificar e intensificar o sabor de outros
condimentos.
Como conservantes, atuam como sequestrantes de ons metlicos
atravs do on carboxila, evitando a catlise de reaes de oxidao nos
alimentos (GITIRANA, 2007). A adio de acidulantes comumente
destinada s bebidas gasosas, principalmente aquelas s quais se
procura dar sabor parecido ao das frutas; estas bebidas j
apresentam leve teor cido, pelo CO2 que encerram em forma de cido
carbnico (H2CO3). O pequeno grau de acidez dado pelos acidulantes
faz com que estes sejam empregados como recursos de melhoria de
sabores. Entre outros produtos em que os acidulantes so empregados,
pode-se destacar: gelias artificiais, sorvetes, balas, ps para
coberturas, produtos de confeitaria, etc. Os cidos orgnicos
comumente usados na indstria de alimentos so os cidos: actico,
ltico, ctrico, mlico, fumrico, succnico e tartrico (FENNEMA, 1985).
Os cidos, frmico e actico tm cheiro intenso, irritante e paladar
azedo. O cido fosfrico (H3PO4) o nico cido inorgnico empregado
extensivamente como acidulante alimentar.
Os cidos de quatro a oito tomos de carbono tm odores
desagradveis, como os cidos caprico (hexanico), caprlico (octanico)
e cprico (decanico). Entretanto, em pequenas concentraes, os cidos
carboxlicos so responsveis por muitas fragrncias. Os cidos,
benzico, cinmico (3-fenil-2-propenico), mirstico (tetradecanico) e
isovalrico (3-metilbutanico) esto presentes em leos essenciais, que
so leos volteis, odorferos, de origem vegetal (SHREVE & BRINK,
1980).
Uma grande parte dos cidos orgnicos, oriundos de microrganismos,
ou como intermedirios naturais em caminhos metablicos principais
podem contribuir para o avano nas produes biotecnolgicas a partir
de fontes renovveis. Por causa dos grupos funcionais dos cidos
orgnicos, estas molculas so extremamente teis para a indstria
qumica. Por exemplo, cido succinico poderia susbtituir o anidrido
maleico, que possui um mercado bastante amplo na petroqumica (WERPY
& PETERSEN, 2004).
Os cidos orgnicos so amplamente usados na indstria de alimentos
como aditivos. Como agentes de processamento, so adicionados para
controlar a alcalinidade de muitos produtos podendo agir como
tampes ou simplesmente como agentes neutralizantes. Como
conservantes, podem atuar desde agentes antimicrobianos at
antioxidantes. Algumas caractersticas desses cidos orgnicos so
abordadas a seguir:
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cido Metanico (frmico): causa do ardor das picadas de formiga, o
mais simples dos cidos carboxlicos. Seu nome origina-se da palavra
em Latim para formiga, formica.
cido Etanico (actico): o principal ingrediente do vinagre. Seu
nome deriva do Latim acetum, que significa azedo. Conhecido e usado
h tempos pela humanidade, usado como condimento e conservante de
alimentos. A oxidao aerbica, por bactrias do gnero Acetobacter, do
lcool a cido actico diludo (8%) um processo antigo, que produz o
vinagre, uma soluo de cido actico aromatizada, obtida pela
fermentao do vinho, da cidra, do malte ou do lcool diludo (SHREVE
& BRINK, 1980). O cido actico para uso industrial e em
laboratrios comercializado na forma de cido actico glacial
(~99,5%), assim chamado porque em dias frios se solidifica com
aspecto de gelo (P.F. 17 C). O cido actico o cido orgnico mais
abunda nte, freqentemente utilizado como matria prima para se
preparar outros produtos como steres acticos. Outra importante
aplicao do cido actico como solvente para muitos processos
industriais, como na fabricao de acetato de celulose e de produtos
farmacuticos (SHI et al., 2005). Recentemente, muitos pesquisadores
tm se esforado para determinar por que cidos orgnicos, como o cido
actico funcionam como inibidores de crescimento de microrganismos
patognicos e deteriorantes (JENSEN et al., 2003).
cido 2-acetoxibenzico (acetilsaliclico): conhecido como aspirina
e empregado como antipirtico e analgsico, produzido pela reao de
esterificao do cido saliclico (2-hidrxibenzico) com o anidrido
actico (SHREVE e BRINK, 1980). O nome cido saliclico deriva do
Latim e designa a rvore do salgueiro, salix. Os mdicos da Grcia
Antiga conheciam as propriedades antipirticas e redutoras da febre,
da casca desta rvore. Em 1829, o qumico francs Henri Leroux isolou
da casca do salgueiro, o composto ativo na forma pura, a salicina,
que uma molcula estruturalmente semelhante aspirina (SNYDER,
1995).
cido 2-hidroxi-1,2,3-propanotricarboxlico (ctrico): o responsvel
pela acidez de frutas ctricas. Para emprego industrial, o cido
ctrico fabricado pela fermentao aerbica do acar bruto (sacarose) ou
acar de milho (dextrose) por uma linhagens especiais de Aspergillus
niger. Seu maior emprego como acidulante em bebidas carbonatadas e
alimentos. No campo mdico, empregado na fabricao de citratos e de
sais efervescentes (SHREVE & BRINK, 1980).
cido etanodiico (oxlico): um cido dicarboxlico txico e presente
em plantas, como espinafre e azedinhas. Embora a ingesto de cido
oxlico puro seja fatal, seu teor na maioria das plantas comestveis
muito baixo para apresentar um risco srio (SNYDER, 1995). um bom
removedor de manchas e ferrugem, sendo usado em vrias preparaes
comerciais de limpeza. Alm disso, a grande maioria dos clculos
renais
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constituda pelo oxalato de clcio monohidratado, um sal de baixa
solubilidade derivado deste cido. Seu nome (do Latimoxalis) resulta
do seu primeiro isolamento do trevo azedo (Oxalis acetosella).
cido propanico (propinico): um cido monocarboxlico, saturado, de
cadeia aberta, que apresenta um odor pungente, aroma e sabor suave,
podendo ser usado como aromatizante (HEATH, 1978). O cido propanico
o responsvel pelo cheiro caracterstico do queijo suo (SNYDER,
1995). Durante o perodo principal de maturao deste tipo de queijo,
Propionibacterium shermanii e microrganismos similares, convertem
cido ltico e lactatos aos cidos propinico e actico e a dixido de
carbono. O gs CO2 gerado responsvel pela formao dos buracos
caractersticos do queijo suo. Suas molculas se atraem por pontes de
hidrognio e, solvel em gua, em qualquer proporo. O cido propinico e
seus sais so amplamente usados como matria-prima em diferentes
indstrias. Os steres do cido propinico so usados na indstria de
perfumes e propionato de celulose utilizado na indstria de plsticos
(GOSWAMI & SRIVASTAVA, 2000).
cido butanico (butrico): seu nome deriva do Latim butyrum, que
significa manteiga; fornece um odor peculiar rancidez da manteiga.
usado na sntese de aromas, em frmacos e em agentes emulsificantes
(PARKER, 1997).
cido 2-hidroxipropanico (ltico): um hidrxicido carboxlico que
contribui para o sabor de manteiga, e sua estrutura altamente polar
com limitada volatilidade (FORSS & SUGISAWA, 1981). largamente
distribudo na natureza, e comercialmente disponvel, sob a forma de
soluo aquosa que incolor, inodora, viscosa e no voltil. usado na
indstria de alimentos para inibir a deteriorao de azeitonas curadas
e para ajustar acidez na produo de queijos (ANTUNES & CANHOS,
1983). Pode ser produzido por meio da fermentao bacteriana da
lactose, acar do leite, por Streptococcus lactis. Fabricado
industrialmente pela fermentao controlada de hexoses de melao,
milho e leite, empregado no curtimento de couros, e na indstria
alimentcia, como acidulante. O cido ltico tambm produzido pelo
corpo humano. Quando a glicose metabolizada pela atividade muscular
anaerbica, o cido ltico gerado nos msculos e, ento, decomposto
(oxidado totalmente) a CO2 e H2O (LEHNINGER et al., 1995). Com o
exerccio intenso, o cido ltico formado mais rapidamente do que pode
ser eliminado. Esta acumulao transiente do cido ltico responsvel
pela sensao de cansao e de dor muscular.
cido 2,4-hexadienico (srbico): encontrado em muitas plantas, e
empregado como fungicida, conservante em alimentos e na manufatura
de plsticos e lubrificantes (PARKER, 1997).
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cido pentanico (valrico): o responsvel pelo aroma do queijo
Roquefort. Foi isolado pela primeira vez da raiz de uma valeriana
(do Latim valere).
cido hexanodiico (adpico): um cido dicarboxlico. Seu nome vem do
Latim adipem, que significa uma gordura, e reflete a observao de
que o cido adpico uma das substncias formadas quando gorduras so
oxidadas com cido ntrico. Sua importncia industrial est relacionada
com a descoberta do nylon, um polmero de condensao, por Wallace H.
Carothers e seus colaboradores, pesquisadores da empresa americana
Du Pont. Eles descobriram que pela reao de polimerizao de uma
mistura do cido adpico e 1,6-diaminohexano poderiam produzir o
nylon (SNYDER, 1995; SHREVE & BRINK, 1980).
cido 3-oxo-L-gulofuranolactona (ascrbico): conhecido como
vitamina C, tem seu nome qumico representando duas de suas
propriedades: uma qumica e outra biolgica. Em relao primeira, um
cido, embora este no pertena claramente classe dos cidos
carboxlicos. Sua natureza cida em soluo aquosa deriva da ionizao de
uma hidroxila de um dos grupos enlicos (pKa = 4,25) (DAVIES et al.,
1991). Adicionalmente, o termo ascrbico representa seu valor
biolgico na proteo contra a doena escorbuto, do Latim scorbutus
(LEHNINGER et al., 1995).
2.1.3. cidos orgnicos como blocos de construo
Segundo o Departamento de Energia dos EUA (DOE) e a Comisso
Europia, o cido succnico tm sido apontado como o cido orgnico de
maior potencialidade acerca de uma variedade de aplicaes
industriais. O mercado para este cido de aproximadamente 20.000
30.000 toneladas por ano, considerando a sua produo por rota
qumica, a partir do anidrido maleico (KIDWELL, 2008). Compostos que
apresentam uma ampla aplicao industrial, a partir dos quais se obtm
uma srie de subprodutos, esto inseridos no conceito de blocos de
construo, os quais constituem a base para o fornecimento de uma
srie de substncias intermedirias e produtos finais, importantes na
indstria qumica. (DELHOMME et al., 2009; WERPY et al., 2004).
As Tabelas 2.3 e 2.4, mostram a posio de destaque do cido
succnico, em comparao com outros onze blocos de construo, obtidos
por rota qumica ou biotecnolgica e os trinta candidatos que podem
ser classificados e apresentados, de acordo com o nmero de carbono
em sua estrutura e interesse industrial (PATEL et al., 2006). O
interesse em processos de produo biotecnolgica vem sendo
considerado uma alternativa vivel do ponto de vista ambiental,
dentro do contexto de biorrefinaria. Com o crescente avano de
processos acerca de produtos derivados de matrias-primas
agro-industriais, vrios setores industriais se propem a alcanar
maiores ndices de qualidade,
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com produtos finais mais competitivos e rentveis, como o cido
succnico (DELHOMME et al., 2009) A produo de cidos orgnicos
amplamente utilizada em escala industrial, sendo limitada a produo
de cidos de origem microbiana, a qual vem apresentando vantagens
econmicas sobre a sntese qumica destes compostos (MATTEY,
1992).
Tabela 2.3. Blocos primrios produzidos por rota fermentativa ou
qumica
Blocos de construo cido succnico, fumrico e mlico
cido 2,5 furanodicarboxlico cido 3 hidrxipropinico
cido asprtico cido glucrico cido glutmico cido itacnico cido
levulnico
3-hidrxibutirolactona
glicerol
sorbitol
Xilitol/ arabinitol Fonte: Top Value Added Chemicals from
Biomass (DOE/GO-2006). U.S. Department of Energy
Tabela 2.4. Candidatos em potencial como blocos de construo
N de Carbono
Candidatos em potencial
1 Monxido de carbono & Hidrognio (gs de sntese) 2 nenh