www.roteskreuz.at 1 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Probleme bei der immunhämatologischen Abklärung Fortbildung für Blutdepotbeauftragte 10.Mai und 07.Juni 2016 Elisabeth Schistal, Christof Jungbauer
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Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland
Probleme bei der immunhämatologischen
Abklärung
Fortbildung für Blutdepotbeauftragte 10.Mai und 07.Juni 2016
Elisabeth Schistal, Christof Jungbauer
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Prätransfusionelle Untersuchungen
ABO und RhD (validierte Doppelbestimmung)
Antikörper-Suchtest (im ICT 37°C)
Serologische Verträglichkeitsprobe
- muss vor jeder allogenen Erythrozytentransfusion
durchgeführt werden
- kann vor jeder autologen Transfusion durchgeführt werden
- maximale Gültigkeit KP: 72 Stunden
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ABO-Blutgruppenbestimmung
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Probleme bei der ABO-Bestimmung
Antigenbestimmung
irreguläre Reaktionen der Erythrozyten mit den Testreagenzien Anti-A, Anti-B
Serumgegenprobe
irreguläre Reaktionen des Probandenserums
mit A1-, A2-, B- und O-Testerythrozyten
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Irreguläre Reaktionen der Erythrozyten 1) Partielle, schwache oder fehlende Agglutination Physiologisch (Neugeborene, A-Untergruppen!)
Angeboren
- Seltene A, B und O Varianten
ev. irreguläres Anti-A1 bei A-var, ev. Adsorption-Elution
- Chimärismus
Krankheitsbedingt
- Blutgruppenungleiche (Notfall-, Fehl- bzw. ”kompatible” Transfusion) Mischfeldagglutination
- Knochenmarkstransplantation
- Leukämische Erkrankungen
- Acquiriertes B (bei BG A1)
Fallbeispiel
BG mit MF-Reaktionen und fehlender Isoagglutinine in der SGP
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Fallbeispiel 3:
BG mit MF-Reaktionen und fehlender Isoagglutinine in der SGP im Rö
RhD Bestimmung im Rö
A B AB A1 A2 B 0 E D CDE Ko
P 132708
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• Auflösung Fallbeispiel :
• 1. KMT im Mai 2015 Empfänger A negativ, Spender B positiv ccD.Ee
• 2. KMT im Juli 2015 Empfänger A negativ, Spender B positiv CCD.ee
• während Konditionierung Transfusion mit O negativ
• nach KMT Transfusion mit O positiv CCD.ee
• ab 09.2015 Transfusion mit B positiv CCD.ee, da keine Iso´s vom
Empfänger gegen den Spender mehr vorhanden sind
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Irreguläre Reaktionen der Erythrozyten 2) Irreguläre positive Reaktionen (Agglutination)
Beladung mit Kälte-Wärme-Auto-Antikörpern (DAT positiv)
(eventuell BG-Bestimmung bei 37°C)
Pseudoagglutination
- Geldrollenbildung (Paraproteinämien)
- Unspezifische Aggregation (Dextrane)
- Verunreinigung mit Warthonscher Sulze
VORSICHT falsch positive Reaktionen bei pos. DAT(ctl.pos.)in
der Dia-Med-Gel-Karte !!!
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A RhD positiv ctl. pos, DAT IgG 2+ polyclonal
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A RhD positiv ctl. pos, DAT IgG 2+ monoclonal
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A RhD positiv ctl. pos, DAT IgG 3+ Röhrchenmethode monoclonal
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Irreguläre Reaktionen in der Serumgegenprobe 1) SGP schwach oder negativ physiologisch – angeboren
- Neugeborene
- Alter
- Chimäre (Immuntoleranz)
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Irreguläre Reaktionen in der Serumgegenprobe 1) SGP schwach oder negativ krankheitsbedingt
- Hypogammaglobulinämie
- BG-ungleiche Transfusion
- Immunsuppresive Therapie
- Leukämische Erkrankung
- St.p.KMT/SZT (Immuntoleranz)
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Verstärkung der Reaktionen der Serumgegenprobe
INKUBATION für ca. 20 Min. bei 4°C
Isoagglutinine primär kältereaktiv (IgM-Ak)
O-Zelle + E-KO mitführen!
Ausschluss kältereaktiver (Auto)antikörper
SGP im IAT 37°C („immune Isoagglutinine“)
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Irreguläre Reaktionen in der Serumgegenprobe 2) Irreguläre positive Reaktionen in der SGP
irreguläres Anti-A1 (klinische Relevanz?) A-Variante (A2-Zellen wichtig!)
irreguläres Anti-H
spezifischer, primär kältereaktiver AK
Anti-M, Anti-Le, Anti-P1, Anti-N, Rh-Ak, Kell-Ak
“unspezifische Kälteagglutinine”(meist Anti-I)
Bei BG O als Kontrolle O-Zelle + E-KO mitführen!
BG A RhD negativ ccddee
AK-Screening negativ
BG-Bestimmung und SGP bei RT
Fallbeispiel
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Fallbeispiel BG A RhD negativ ccddee, irreguläres Anti-A1
AK-Screening negativ
A1
A2
B
0
E-Ko
SGP im Rö bei 37°C
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ABO-Tabelle irreguläres Anti-A1 und Anti-H
A1 mit irreg. Anti-H
A1B mit irreg. Anti-H
A2 mit irreg. Anti-A1
A2B mit irreg. Anti-A1
A1
-
-
1+/-4+
1+/-4+
A2
1+/-4+
1+/-4+
-
-
B
4+
-
4+
-
0
1+/-4+
1+/-4+
-
-
E-KO
-
-
-
-
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Serumgegenprobe bei Anti-c
Anti-A neg.
Anti-B 4+
Anti-AB 4+
A1-Zelle 3+
A2-Zelle 2+
B-Zelle 3+
O-Zelle 1+
E-KO neg.
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RhD-RhCE-Bestimmung
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Probleme bei der RhD-RhCE-Bestimmung
Mischfeldagglutination
weakD – partialD
Bestimmung bei positivem DAT
Del (serologisch negativ / genetisch positiv)
Wann ist eine Genotypisierung sinnvoll?
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Serologische Abklärung RhD/RhCE
Doppelbestimmung mit 2 unterschiedlichen – aufeinander abgestimmten Testreagenzien gilt für alle Ag-Bestimmungen
z.B.: monoklonales (das die Kat VI nicht erkennt) und polyklonales Testreagenz ( „DVI+“)
Ein Testreagenz sollte auch im IAT angesetzt werden
„scheinbar“ negative Reaktionen bei RT
RhD-negative mit CDE-positiv Anti-D im IAT
Vorsicht: RT-Milieu negativ, IAT positiv um Testergebnis richtig zu interpretieren, muss DAT negativ sein!
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Serologische Abklärung RhD/RhCE
Mischfeldagglutination:
angeborener Chimärismus
erworbener Chimärismus
- Vortransfusion
(“kompatible” Transfusion, Notfalltransfusion mit O negativ)
- St.p.KMT/SZT
- leukämische Erkrankungen
genetische Abklärung sinnvoll
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MF-Agglutination Mischfeld RhD, RhCDE
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MF-Agglutination Mischfeld RhC
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RHD - Varianten RhD var, weakD, partialD Sammelbegriff für serologisch schwach exprimiertes RhD: D var
(historisch: Du, Dweak)
serologisch deskriptive Bezeichnung (ohne nähere Zuordnung)
derzeit können 30 Epitope (mit monoklonalen Ak) auf RhD untersucht werden
Unterscheidung weak-/ partial D praktisch nur genetisch möglich (Hauptproblem sind weak D Typen wegen falsch negativer Reaktionen der Anti-D-Testreagenzien)
weak D Sensibilisierung unwahrscheinlich - (alle Epitope vorhanden)
Polymorphismus intramembranös bzw. zytoplasmatisch
partial D Sensibilisierung möglich - (nicht alle Epitope vorhanden)
Polymorphismus extrazellulär
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Blutspendedienst
Vorgehen bei Patienten mit abgeschwächter D-Expression
D var – Transfusionsempfehlung und Rhesusprophylaxe
Patienten mit weakD-Typ 1,2,3 können wie D-positiv gesehen werden: (sofern eine serologische RhD-Mindestexpression von >= „?/ 1+“ vorliegt)
- Transfusionsempfehlung RhD-positiv
- keine Rhesusprophylaxe in der Schwangerschaft
Patienten mit abgeschwächter D-Expression (Dvar), bei denen
kein weakD-Typ 1,2,3 vorliegt, werden mit RhD-negativem Blut versorgt.
Schwangere erhalten eine Rhesusprophylaxe.
Empfehlungen des BSD SRK. Immunhämatologische und prätransfusionelle Untersuchungen an Patientenproben. 2009
ÖGBT Standards 2015
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RhD-Varianten Was ist der Nutzen der Differenzierung von D var in: weakD bzw. partialD?
ca. 50% der Europäer mit Rh Dvar haben weak D type 1, 2 oder 3
> 95% der europäischen weak D-Typen sind weak D type 1, 2, 3, 4
Einsparung von ca. 3% RhD negativer EK‘s
Schwangere keine Rhesusprophylaxe notwendig
Seltene Phänotypen, z.B. CCddee, ccddEE, pp, Oh, etc…
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Auswertung genetische RHD-Bestimmung 1/2014 bis 10/2015 n= 465
weak D type 1 146
weak D type 2 34
weak D type 3 37
Summe 217 (46%)
anderer weak D-Typ
weakDtype15, weakDtype66
weakDtype5, weakDtype14
9
weak D type 4
17
Summe
26 (5,6%)
RHD positiv serologisch abgeschwächt
„Ceppellini“
Summe
151 (32%)
serologisch positiv
36
partial D
D Kat.VII 27
D Kat.VI 10
Sonstige partial D-Typen 34
Summe 71 (15,3%)
wea
k D
D
po
siti
v p
arti
al D
RHD-Genotypisierung Auswertung von 465 Zusendungen (1/2014 bis 10/2015) wegen abgeschwächter D-Expression
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RHD-Genotypisierung Auswertung von 465 Zusendungen wegen abgeschwächter D-Expression
46% 32%
15,3% 5,6%
> 2/3 der Patienten können RhD positiv transfundiert werden
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Vorsicht RhD-Bestimmung bei pos DAT (IgG+, C3d+, ctl-Karte pos, etc.)
Interpretation der Testergebnisse Ansatz Anti-D RT und IAT
(Blend-Reagenzien: monoclonal IgM / IgG)
RT 1+/2+ IAT 37°C 1+/2+ RH-D var
RT - IAT 37°C - RH-D negativ
RT - IAT 37°C 1+/2+ RH-D derzeit nicht bestimmbar
RT 3+/4+ (falls Milieu-KO negativ ist) RH-D positiv
Serologische Bestimmung von RhD CcEe bei positivem DAT
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BG A RhD negativ, ctl pos. DCT IgG 2+
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Patient mit Del und Anti-D (Titer 1:128) Anti-D serologisch negativ, genetisch alle 10 D-Exons vorhanden, DAT negativ
Adsorption - Elution
KO Überstand letzter Waschschritt
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MF-Agglutination im RhD durch Notfalltransfusion mit RhD negativ
bzw. „kompatibler“ EKs
Krankheitsbedingte Doppelpopulation (leukäm. Erkrankung)
Negride Bevölkerung
Bsp. St. Anna KSp. (DAU; weak D type 14) -diese Var. erscheinen serologisch positiv
RhD negative Patienten mit GB routinemäßig RHD-SSP (als Qualitätskontrolle)
Alle RhD negativen Erstspender mit GB (als Qualitätskontrolle)
Anti-D bei RhD positiv
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RHD Bei welchen Fragestellungen ist eine Genotypisierung sinnvoll
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Antigentypisierung
- wenn man einen Phänotyp wissen möchte, aber die Probe ungeeignet ist
- wenn die Molekularbiologie ausführlichere oder bessere Ergebnisse liefert
- wenn die Molekularbiologie effizienter bzw. kosteneffizienter ist als die Serologie
Wann verwendet man die Genetik?
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Antikörper-Screening Ak-Differenzierung Kreuzprobe
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Ak-Screening/-Differenzierung-Reaktionsmilieus
Ak-Differenzierung im Speziellen:
-Ak gegen polymorphe Ag
-Ak gegen HFA
-Ak gegen LFA
-Autoantikörper -Medikamenten-Ak/ DAT
-HTLA-Ak
-Einsatz von Enzym
-Kreuzprobe
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Die in den käuflichen Antikörperscreening – Panels ausgewiesenen Antigene decken die häufigen Antikörperspezifitäten bei Europäern ab
Nach Möglichkeit soll für jedes Ag eine homozygot positive Zelle vorhanden sein
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Positiver Ak-Suchtest Ak-Differenzierung Reaktionsmilieus
Indirekter Antihumanglobulintest (IAT)
(AHG-Test, Coombs-Test)klinisch relevante AK vom IgG-Typ
Neutralmilieu RT bzw.4°C (Röhrchen/Gelkarte)
bei V.a. primär kältereaktive Ak vom IgM-Typ
(SGP>, O-Zelle positiv)
(ABO, M/N, P1, Lea/Leb)
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Ak-Differenzierung Reaktionsmilieus
Enzymmilieu
papainresistent: Le, RhD, Jk Ag
papainsensitiv: M/N, Fy, Ch/Rg
weitere Enzyme: Trypsin, DTT, etc…
LISS/Albumin- Röhrchenmethode
RT, LISS/ Albumin 37°C /IAT
Einsatz bei durchgehend positiven Reaktionen in der Gel-Karte
Neutralmilieu Röhrchenmethode RT/ 37°C/ IAT
Einsatz bei kälte-wärmereaktiven Autoantikörpern bzw. bei V.a.
milieuassoziierte Störfaktoren
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Ak-Differenzierung-Ak gegen polymorphe Ag Anti-c
O positiv, CCD.ee
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O positiv, CCD.ee
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Ak-Differenzierung-Ak gegen hochfrequente Ag
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Anti-Dia (Frequenz: 0,01%)
Antikörper gegen LFA
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Low Frequency Antigens (LFA)
Frequenz < 1% z.B.: Vw (0,06%), Wra (0,01%), Dia (0,01%)
Mia (0,01%, Asiaten bis 15%) , etc.
Differenzierung nicht unbedingt notwendig, KP ausreichend!
Vorsicht: Frauen im gebärfähigem Alter! HDFN
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Antikörperidentifikation bei negativer Autokontrolle
Reaktionsmuster Panelzellen
Interpretation Weitere Vorgehensweise
einzelne Panelzellen positiv ähnliche Reaktionsstärke
spezifischer Allo-Ak, Einzelspezifität Ausschluss weiterer Allo-Ak Bestätigung der Spezifität mittels ausgewählter Testzellen
einzelne oder alle Panelzellen positiv unterschiedliche Reaktionsstärken
mehrere spezifische Allo-Ak bzw. Allo-Ak gegen HFA
Antigenprofil der Patientenzellen Dosierungseffekt? Austestung von Zellen, die dem Phänotyp des Patienten entsprechen, wenn negativ ausgewählte Testzellen,um Allo-Ak zu bestätigen bzw. auszuschließen wenn positiv V.a. Allo-Ak gegen HFA
alle Panelzellen positiv ähnliche Reaktionsstärke
spezifischer Allo-Ak gegen HFA mehrere spezifische Allo-Ak
einzelne Panelzellen sehr schwach reaktiv schwach reaktiver spezifischer Allo-Ak bzw. Antikörper mit Dosierungseffekt
Antigenprofil der Patientenzellen homozygote Testzellen verwenden, deren Antigene beim Patienten negativ sind Techniken zur Verstärkung der Reaktionen verwenden, z.B. Enzyme
nur eine Panelzelle reagiert positiv spezifischer Allo-Ak gegen LFA Testzellen verwenden, die bezüglich LFA positiv sind eventuell ad Referenzlabor zur weiteren Abklärung
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Antikörperidentifikation bei positiver Autokontrolle
Reaktionsmuster Panelzellen positiver DAT
Interpretation Weitere Vorgehensweise
alle Panelzellen reagieren negativ mit Serum oder Eluat
eventuell Medikamentenantikörper 1) Antigenprofil des Patienten, allogene
Adsorption (vortransfundiert)
2) Autoadsorption, wenn nicht vortransfundiert
3) Testung (ausgewählter) Panelzellen mit Serum des Patienten
4) Testung von Panelzellen mit Eluat, bei KMT/SCT oder Vortransfusion mit plasmahältigen Präparaten auch mit A und B-Zellen
einzelne Panelzellen sind reaktiv mit Serum und Eluat
Transfusionsreaktion durch Allo-Ak ,falls kürzlich transfundiert spezifischer Auto-Ak (gegen „normalverteiltes“Ag)
alle Panelzellen positiv mit Serum und Eluat nicht vortransfundierter Patient panreaktiver Auto-Ak bei AIHA, Med.-Ak vortransfundierter Patient Transfusionsreaktion durch Allo-Ak gegen HFA, AIHA, Med.-Ak
alle Panelzellen positiv mit Serum , Eluat negativ möglicher Allo-Ak Medikamentenantikörper
alle Panelzellen positiv mit Eluat, mit Serum negativ
Panreaktiver Auto-Ak bei AIHA, kein frei im Serum vorhandener Auto-Ak Frühe Transfusionsreaktion (Allo-Ak gegen HFA)
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Antikörperidentifikation bei positiver/negativer Autokontrolle
Reaktionsmuster Panelzellen negativer DAT (positive oder negative Autokontrolle)
Interpretation Weitere Vorgehensweise
alle Panelzellen positiv V.a. Ak gegen Testmedium („Stabilisatorunverträglichkeit“)
Ak-Testung in einem anderen Medium, z.B.Röhrchenmethode Neutralmilieu Elution, wenn klinische Symptome Hämolyse (verkürzte Ery-Überlebensrate) vorhanden sind, z.B. DAT negative AIHA
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HISTORISCHE Antikörper müssen beachtet werden!
z.B. Anti-Jk, Anti-Fy, Anti-E
BOOSTERUNG
verzögerte hämolytische Transfusionsreaktion!
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Wann dürfen Ak-Spezifitäten ausgegeben werden?
- Antikörperspezifitäten dürfen nur bei technisch eindeutiger Differenzierung bei ausreichendem Sicherungsgrad ausgegeben werden.
- Kein „Anzüchten“ von Antikörpern (insbes. bei MDS)
- Vorläufige deskriptive Lösung: „ das Serum des Patienten reagiert mit M-negativen schwächer als mit M-positiven Zellen“.
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Serologische Verträglichkeitsprobe („Kreuzprobe“)
Majortest: Empfänger-Serum + Spenderzellen OBLIGAT
Autoantikörperkontrolle (Eigen-Ko) zu empfehlen, nicht obligat
Reaktionsmilieu: IAT 37°C kein Enzymansatz!!
Teil der prätransfusionellen Untersuchung
Im Rahmen einer Transfusionstherapie KP innerhalb 72h zu wiederholen
Akutsituationen-Minimalanforderungen:
BG+RhD Blutprobe vor Transfusion
KP und Ak-Suchtest mit Beginn der Transfusion
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Österreichisches Rotes Kreuz Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland
Labordiagnostik - Immunhämatologie Wiedner Hauptstrasse 32 1040 Wien Tel.: +43 1 58 900 -260 Fax.: +43 1 58 900 -262 Email: [email protected]
Danke für die Aufmerksamkeit !
Dr. Elisabeth Schistal [email protected], Tel. DW.: -408
Dr. Christof Jungbauer [email protected], Tel. DW.: -402