Pro Gradu TiaAnnette Kakko

Polysakkaridialdehydien selektiivinen muokkaus

oksinitrilaasientsyymill

Tia-Annette Kakko Pro gradu -tutkielma

Orgaanisen kemian laboratorio Kemian laitos

Helsingin yliopisto Marraskuu 2012

i

Tiedekunta/Osasto Fakultet/Sektion Faculty Matemaattis-luonnontieteellinen tiedekunta

Laitos/Institution Department Kemian laitos

Tekij/Frfattare Author Tia-Annette Kakko Tyn nimi / Arbetets titel Title Polysakkaridialdehydien selektiivinen muokkaus oksinitrilaasientsyymill Oppiaine /Lromne Subject Kemia Tyn laji/Arbetets art Level Maisterin tutkielma

Aika/Datum Month and year Marraskuu 2012

Sivumr/ Sidoantal Number of pages 67

Tiivistelm/ Referat Abstract

Guarkumi on monikyttinen aine niin lke- kuin ravintoaineteollisuudessa. Guarkumille tehtvt reaktiot lisvt mahdollisesti sen monikyttisyytt. Tss tyss tarkoituksena oli pident guarkumialdehydin (galaktomannaanin galaktoosin C-6 aldehydin) hiiliketjua yhdell hiilell syanohydriinien avulla. Oksinitrilaasi on syanohydriinej muodostava entsyymi, jota kasvit kyttvt syanogeneesiss. Orgaanisissa synteeseiss tt entsyymien ominaisuutta kytetn pinvastaiseen tarkoitukseen eli syanohydriinien muodostamiseen. Reaktioita oksinitrilaasilla on suoritettu kirjallisuuden mukaan runsaasti, mutta lhtaine on ollut orgaaniseen liuottimeen liukeneva, reaktioseoksena on kytetty orgaanista liuotinta, liuotinseosta tai entsyymi on ollut kiinnitettyn matriisiin. Tutkimuksen kohteena olivat polysakkaridialdehydien oksinitrilaasilla tehtvt entsymaattiset jatkoreaktiot. Tyss tutkittiin syanohydriinien entsymaattista syntetisointia vesipitoisissa puskuriliuoksissa. Kokeet tehtiin raffinoosilla ja guarkumilla, jotka oli hapetettu entsymaattisesti, selektiivisesti, galaktoosin C-6 asemasta aldehydiksi. Syanohydriinien muodostumista tutkittiin kolmella eri oksinitrilaasilla ja kahdella syanidia vapauttavalla yhdisteell; natriumsyanidilla ja etyylisyanoformaatilla. Lisksi tutkittiin erilaisten puskurien vaikutusta tulokseen. Nytteist muodostettiin johdos metanolyysin ja silyloinnin avulla. Haihtuviksi tehdyt sakkaridit analysoitiin GC-MS:lla. Tulokset tarkistettiin lisksi NMR- ja LC-MS/MS tekniikoilla. Reaktioiden tuloksena oli -hydroksiamidiksi hydrolysoitunut syanohydriini. Synteesin toimivuutta ja tuloksia olisi hyv tutkia viel alhaisessa lmptilassa, sill thn tutkimukseen sislletyt kokeet tehtiin huoneenlmptilassa. Lisksi parhaan tuloksen tuottanutta AtHNL -entsyymi olisi hyv kokeilla pH:ssa 3,3, jolloin kemiallinen reaktio olisi kokonaan suppressoitu.

Avainsanat Nyckelord Keywords

Oksinitrilaasi, hydroksinitriililyaasi, guarkumi, polysakkaridi, PaHNL, syanohydriini

Silytyspaikka Frvaringstlle Where deposited

Kumpulan kampuskirjasto, Kemian laitos, orgaanisen kemian laboratorio

Muita tietoja vriga uppgifter Additional information

ii

Alkusanat

Erikoistyn tekeminen ja pro gradun kirjoittaminen on ollut opettavainen ja krsivllisyytt

vaativa projekti. Haluaisin kiitt ohjaajaani FT Kirsti Parikkaa positiivisesta

kannustuksesta ja opastuksesta laboratoriotyt suoritettaessa. Lisksi hn on antanut hyvi

kommentteja kirjoitusta ajatellen. Kiitn mys Sami Heikkist avusta NMR-analyysien

suorittamisessa sek Sun-Li Chongia MS-analyysien tekemisest. Professori Maija

Tenkaselle kiitos siit, ett kokeellisen osuuden suorittaminen Viikin Elintarvike- ja

ympristtieteiden laitoksella oli mahdollista. Professori Ilkka Kilpelist haluan kiitt

tuesta ja ymmrtvisest asenteesta koko opintojeni aikana. Tyn, opiskelun ja kodin

yhteensovittaminen on toisinaan ollut haasteellista, opintojeni loppuun saattamiseksi olen

saanut paljon tukea sek ty- ett opiskelukavereilta. Kaikkein eniten tahdon kuitenkin

kiitt puolisoani Tommy siit, ett hn on tukenut minua opintojeni aikana ja

kannustanut minua tss projektissa aina loppuun saakka. jatkamaan opintojani filosofian

maisteriksi asti.

iii

Sisllys

Tiivistelm .................................................................................................................................... i

Alkusanat .................................................................................................................................... ii

Sisllys ........................................................................................................................................ iii

Lyhenneluettelo ............................................................................................................................v

KIRJALLINEN OSUUS ..............................................................................................................1

1 Johdanto ..............................................................................................................................1

2 Syanohydriinit .....................................................................................................................2

2.1 Mrittely ja synteesi ..................................................................................................2

2.1.1 Syanidilhteet ...........................................................................................................4

2.2 Syanohydriinien reaktioita..........................................................................................5

2.2.1 Hydroksyyliryhmn reaktiivisuus ..............................................................................5

2.2.2 Syanoryhmn reaktiivisuus........................................................................................7

3 Entsymaattiset menetelmt syanohydriinien valmistuksessa ........................................... 11

3.1 Entsyymit ................................................................................................................... 11

3.2 Syanohydriinien valmistaminen ............................................................................... 12

3.2.1 Hydroksinitriililyaasilhteit ................................................................................... 13

3.2.1.1 Rekombinanttientsyymit ................................................................................. 16

3.2.2 (R)-Oksinitrilaasi .................................................................................................... 17

4 Hiilihydraatit ..................................................................................................................... 18

4.1 Mono-, oligo- ja polysakkaridit ................................................................................. 18

4.2 Galaktomannaanit ..................................................................................................... 22

4.2.1 Galaktomannaanien reaktiivisuus ............................................................................ 23

KOKEELLINEN OSUUS .......................................................................................................... 25

5 Johdanto ............................................................................................................................ 25

5.1 Materiaalit ja menetelmt ......................................................................................... 26

5.1.1 Reagenssit ja entsyymit ........................................................................................... 26

5.1.2 Sokereiden hapetus ................................................................................................. 28

iv

5.2 Syanohydriinien synteesi ........................................................................................... 29

5.2.1 Syanidilhteet ......................................................................................................... 29

5.2.2 Puskuriolosuhteet .................................................................................................... 30

5.3 Synteesit hapetetulla raffinoosilla ............................................................................. 31

5.3.1 Reaktiot natriumsyanidilla ....................................................................................... 31

5.3.2 Reaktiot etyylisyanoformaatilla ............................................................................... 32

5.3.3 Kemiallisen reaktion tutkiminen .............................................................................. 33

5.3.4 Reaktiot korkeammassa pH:ssa ............................................................................... 34

5.4 Synteesit hapetetulla guarkumilla ............................................................................ 35

5.5 Nytteiden ksittely ................................................................................................... 36

5.5.1 GC-MS nytteiden valmistaminen ........................................................................... 36

5.5.1.1 Pelkistminen ................................................................................................. 36

5.5.1.2 Hapan metanolyysi ja silylointi ....................................................................... 36

5.5.2 NMR- ja MS- nytteiden valmistaminen ................................................................. 38

5.6 Muita kokeita ............................................................................................................ 38

5.6.1 Saostus.................................................................................................................... 38

5.6.1.1 Puhdistuskokeet .............................................................................................. 39

5.6.2 Jtteiden hvitys ...................................................................................................... 39

5.7 Analysointi ................................................................................................................. 40

5.7.1 GC-MS analyysi ..................................................................................................... 40

5.7.1.1 Lhtaineiden hapetusasteen mrittminen .................................................... 40

5.7.2 Massaspektrometrinen analyysi ............................................................................... 41

5.7.3 NMR analyysi ......................................................................................................... 42

5.8 Tulokset ..................................................................................................................... 42

5.8.1 Lhtaineiden hapetusasteet .................................................................................... 42

5.8.2 Syanohydriinit......................................................................................................... 43

5.8.2.1 GC-MS analyysin tulokset .............................................................................. 43

5.8.2.2 MS/MS analyysin tulokset .............................................................................. 51

5.8.2.3 NMR analyysin tulokset.................................................................................. 55

5.8.2.4 Tulosten kooste ............................................................................................... 59

6 Johtoptkset ................................................................................................................... 60

Viiteluettelo ................................................................................................................................ 61

LIITE 1.

v

Lyhenneluettelo

CLEA Cross -linked enzyme aggregate, ristisilloitettu entsyymiryhmittym

DAST Dietyyliaminorikkitrifluoridi

DIPE di-Isopropyylieetteri

DMF N,N-Dimetyyliformamidi

DS Substituutioaste

Et2O Dietyylieetteri

Fru Fruktoosi

Gal Galaktoosi

GC Kaasukromatografi

GG Guarkumi

Glc Glukoosi

GO Galaktoosioksidaasi

HCN Vetysyanidi

HMDS Heksametyylidisiloksaani

HNL Hydroksinitriililyaasi, (R)-oksinitrilaasi

KCN Kaliumsyanidi

KF Kaliumfluoridi

Man Mannoosi

Me3SiCl Trimetyylisilyylikloridi

MS Massaspektrometri

NaBD4 Natriumboorideuteridi

NaBH4 Natriumboorihydridi

NaCN Natriumsyanidi

NCCOOEt Etyylisyanoformaatti

NMR Nuclear magnetic resonance, ydinmagneettinen resonanssi

vi

NTP Normal temperature and pressure, normaalilmptila ja -paine

PCl5 Fosforipentakloridi

Pd Palladium

py Pyridiini

R3SiCN Trialkyylisilyylisyanidi

Raf Raffinoosi

Sac Sakkaroosi

TBDMS-Cl tert-Butyylidimetyylisilyylikloridi

TEMPO 2,2,6,6,-Tetrametyylipiperidiini-1-oksyyli

TMCS Trimetyylikloorisilaani

TMSCl Trimetyylisilyylikloridi

tr Retentioaika

1

KIRJALLINEN OSUUS

1 Johdanto

Kemia on jatkuvasti kehittyv tieteenala, jossa edistyst tapahtuu niin uusien tuotteiden

syntetisoinnissa kuin laitetekniikassa. Usein tutkimuksessa sovelletaan monia eri

menetelmi ja tieteen alalajeja. Kytnnss tm tarkoittaa sit, ett yhden asian hallinta

ei aina riit, vaan monen alalajin tuntemus ja soveltaminen on tarpeen. Tss tyss

yhdistyvt orgaaninen kemia, biotekniikka sek laitetekniikka.

Tutkimuksen tarkoituksena oli selvitt muodostuuko mantelista perisin olevan

hydroksinitriililyaasi -entsyymin avulla vesipitoisissa sakkaridiliuoksissa yhdisteit, jotka

sisltvt syanohydriini-funktionaalisuuden. Reaktiossa muodostui kuitenkin amidiksi

hydrolysoitunut syanohydriini. Haastetta tutkimukseen toivat sek lhtaineiden

liukoisuusominaisuudet ett entsyymien vaatimien reaktio-olosuhteiden stely. Lisksi

lhtaineiden rajallisuus ja synteesituotteen puhdistuksen haasteellisuus toivat

lismaustetta.

Uusien, synteesimenetelmien ympristystvllisyys, ns. vihre kemia, on viime aikoina

ollut trkess asemassa. Lisksi tuotantotekniset vaatimukset ovat tiukkoja, mieluiten

kytetn olemassa olevaa tekniikkaa, sit vain hiukan muunnellen. Orgaanisten

liuottimien kytn vhentminen ja synteesimenetelmien muuttaminen kestvmmn

kehityksen suuntaan ovat trkess asemassa uusia menetelmi kehitettess.

Bioteknologian yhdistminen orgaanisen kemian reaktioihin on vhentnyt suojaryhmien

kytt, samalla reaktioreitit ovat lyhentyneet ja tarvittavien reagenssien mr on

vhentynyt. Tss tyss ympristnkkohdat huomioitiin mahdollisuuksien mukaan.

Syanohydriinit ovat monikyttisi lhtaineita kemiallisissa synteeseiss ja niiden

muodostaminen on yksi orgaanisen kemian perusreaktioista. Kemiallisessa reaktiossa

tuotteena muodostuu -hydroksinitriilien raseeminen seos. Entsymaattisessa reaktiossa

saadaan muodostettua suurimmaksi osaksi tietty konformaatiota, jolloin lopputuotteen

stereokemia riippuu kytetyn entsyymin stereospesifisyydest.

2

2 Syanohydriinit

2.1 Mrittely ja synteesi

Syanohydriineiss on sek syano- ett hydroksyyliryhm, jotka ovat kiinnittynein

molekyylin samaan, alifaattiseen, osaan.1 Syanohydriinej valmistettaessa hiiliketju pitenee

yhdell hiilell ja molekyyliin saadaan usein muodostettua kiraliakeskus.2. Tmn lisksi

syanohydriinej voidaan valmistaa sek kemiallisesti ett entsymaattisesti.

Kuva 1. Syanohydriinien muodostuminen. R1= alkyyli, sykloalkyyli, aryyli, heteroaryyli; R2= H, alkyyli.3.

Kemiallisessa synteesiss vetysyanidia voidaan liitt raseemisesti joko aldehydi- tai

ketonirunkoon jolloin muodostuu -hydroksinitriilej. Reaktiota katalysoidaan emksell

(kuva 1.).1, 4 Vetysyanidin vaaralliselta ksittelylt vltytn muodostamalla se suola- tai

rikkihapon avulla in situ.5. Vaihtoehtoisesti -hydroksinitriili muodostetaan syanidi-ionin

vaihdolla ketonisyanohydriinin ja aldehydin vlill. Menetelm kutsutaan

transhydrosyanaatioksi.3 Reaktiossa muodostuu stabiilimpi, aldehydist perisin oleva,

syanohydriini (kuva 2.). Usein tss reaktiossa ketonina toimii asetonisyanohydriini.1, 6, 7

Kuva 2. Syanohydriinin valmistaminen transhydrosyanaatiolla. R, R ja R= alkyyli- tai aryyliryhm.1, 3

3

Mekanistisesti reaktio on nukleofiilinen additio karbonyylihiileen, jolloin syanidi-ionin

liittyminen karbonyylihiileen on reaktion nopeutta stelev tekij. Alifaattiset aldehydit ja

suurin osa alifaattisista ketoneista muodostavat syanohydriinej.5 Ketoneilla reaktio on

yleisesti ottaen hitaampi johtuen sek elektroneja luovuttavan ryhmn vaikutuksesta ett

alkyylin aiheuttamasta steerisest esteest. Joissakin tapauksissa reaktion tasapaino on

enemmn lhtaineiden puolella. Tllin tasapainon siirtminen tuotteen puolelle onnistuu

vain joko reaktiotuotteen poistamisella reaktioseoksesta, vetysyanidin mrn lismisell

tai biokatalyytin avulla.4 Aldehydeist muodostuva syanohydriini on pysyvmpi ja reaktion

tasapaino on psntisesti tuotteen puolella.1, 5 Ketonin ja aldehydin muoto vaikuttavat

reaktionopeuteen ja -tasapainoon siten, ett alkyyli-aryyliketonit reagoivat huonosti, jos

lainkaan. Lisksi molemmilla ryhmill molekyylin haaroittuneisuus hidastaa

reaktiivisuutta.1

Entsymaattisissa reaktioissa perusperiaate reaktiolle on sama kuin kemiallisessa reaktiossa,

mutta niss reaktioissa entsyymit katalysoivat vetysyanidin enantioselektiivist liittymist

karbonyylihiileen.3, 4 Samalla molekyyliin muodostuu kiraliakeskus, jossa hiiliatomiin on

liittynyt nelj erilaista ryhm ja molekyylist tulee optisesti aktiivinen. Kytettvt

entsyymit tuottavat reaktiossa usein vain joko R- tai S- muotoa, kun taas kemiallisessa

reaktiossa muodostuu aina molempia stereoisomeerej.2, 3, 8 Tllin enantiopuhtaita

tuotteita valmistettaessa kemiallisen reaktion tuottavuus j suurimmillaan 50 %:iin.9

Entsymaattinen hiili-hiili sidoksen muodostuminen on yleens hyvin diastereo-, enantio-,

kemo-, ja regioselektiivist.3

Edell mainittujen menetelmien lisksi syanohydriinien enantioselektiivist syntetisointia

on tehty yhdistmll sek kemiallinen ett entsymaattinen menetelm. Tllin

emskatalysoidussa reaktiossa muodostetaan syanohydriinien raseeminen seos, jonka

annetaan edelleen reagoida entsymaattisesti esim. lipaasientsyymin ja asetylointireagenssin

kanssa.10

Syanohydriinien muodostumisreaktio on eksoterminen ja korkeassa pH:ssa reversiibeli.

Tst seuraa, ett kemiallisten, emskatalysoitujen, reaktioiden tuotteet saadaan eristetty

vasta kun reaktioseos on stabiloitu hapon avulla.1

4

2.1.1 Syanidilhteet

Syanohydriinien muodostamiseen tarvitaan syanidi-ioni, -CN. Perinteinen tapa syanidi-

ionin muodostamiseksi on ollut kytt vetysyanidia (HCN) emskatalysoidussa tai

syanidisuolaa (NaCN tai KCN) happokatalysoidussa reaktiossa. Muita syanoryhmn

lhteit voivat olla asetonisyanohydriini11, etyylisyanoformaatti (NCCOOEt)12, 13, -

hydroksibentseeniasetonitriili eli mantelinitriili, dietyylisyanofosfonaatti13,

trialkyylisilyylisyanidi (R3SiCN)3, alkyylisyanidi ja metallisyanidi8. Esimerkkej

rakenteista on esitetty kuvassa 3.

Kuva 3. Asetonisyanohydriinin, etyylisyanoformaatin, trimetyylisilyylisyanidin14 ja mantelinitriilin rakennekaavat.

Kytettv substraatti valikoituu monien eri tekijiden summasta. Vetysyanidin

myrkyllisyys, alhainen kiehumispiste ja reaktion eksotermisyys ovat trkeit

tyturvallisuudessa huomioitavia seikkoja. Lhteiss kehotetaankin kyttmn

hlytysjrjestelm.3 Muiden, hiukan turvallisempien, lhtaineiden tarkoituksena on

vapauttaa vetysyanidi reaktioseokseen in situ, josta se liittyy kohdemolekyyliin. Kytettv

reaktiotyyppi vaikuttaa syanidilhteen valintaan siten, ett esimerkiksi lhtaineen

emksisyys vaikuttaa entsymaattisten reaktioiden kulkuun.3

5

2.2 Syanohydriinien reaktioita

Syanohydriinit ovat bi- tai monifunktionaalisia yhdisteit, joiden kemiallinen rakenne

sislt nitriili- ja hydroksyyliosan. Nm funktionaaliset ryhmt ovat reaktiivisia ja siten

monikyttisi.3, 15 Tst syyst niit kytetn vlituotteena useissa kemian teollisuuden

reaktioissa.1 Kiraliakeskus tuo lisarvoa syanohydriinien monikyttisyydelle, ja siksi

mys maatalouskemikaali- ja lkeaineteollisuus ovat kiinnostuneita syanohydriinien

kehittmisest.8, 12

2.2.1 Hydroksyyliryhmn reaktiivisuus

Hydroksyyliryhmn aktiivisuutta voidaan list muuttamalla se hyvksi poistuvaksi

ryhmksi.16 Tm mahdollistaa SN2 -tyypin korvautumisreaktiot, joissa tapahtuu

konfiguraation kntyminen.17 Hydroksyyliryhm voidaan syrjytt mys

elektronegatiivisella ryhmll; esimerkiksi primaariset ja sekundaariset amiinit korvaavat

hydroksyylin muodostaen -aminonitriilej. Mys halogeenivedyt sek fosforipentakloridi

(PCl5) reagoivat samalla tavalla muodostaen -halogeeninitriilej.1 Lisksi suorat

stereoselektiiviset reaktiot ovat mahdollisia eriden reagenssien avulla (kuva 4.)

esimerkkin dietyyliamiinirikkitrifluoridin (DAST) reaktio syanohydriinin kanssa.16

Kuva 4. (S)-2-fluoronitriilien ja edelleen (S)-2-fluorokarboksyylihappojen valmistaminen (R)-syanohydriineist.16

Sen sijaan, ett koko hydroksyyliryhm (OH) vaihdetaan, voidaan ainoastaan OH-ryhmn

vety korvata. Reaktioista yleisin on esterin muodostaminen hapon tai happokloridin

kanssa.1 Kuten alkoholeilla yleens, niin mys tsskin tapauksessa, aktivaatio

sulfonyyliryhmll johtaa useisiin erilaisiin jatkoreaktiomahdollisuuksiin (kuva 5).

6

Muodostuvat -sulfonyylioksinitriilit sisltvt hyvn poistuvan ryhmn.17, 18 Optisesti

aktiivisten -sulfonyylioksinitriilien nukleofiiliset substituutioreaktiot johtavat moniin

mielenkiintoisiin yhdisteisiin: -atsidonitriileihin, -aminonitriileihin, -aminohappoihin

sek etyleeni-imiineihin.19 Edell mainituista, alifaattiset optisesti aktiiviset molekyylit

silyttvt konfiguraationsa, kun taas aromaattiset ovat epstabiilimpia optisen puhtautensa

suhteen.16

Kuva 5. Kiraalisten syanohydriinien hydroksyyliryhmn jatkoreaktioita.17 a) R1SO2Cl,

pyridiini (py), b) kaliumftaali-imidi, N,N-Dimetyyliformamidi (DMF) c) kaliumatsidi,

DMF, d) LiAlH4, Et2O, - 80 C, pH 7 fosfaattipuskurissa, e) kaliumasetaatti (KOAc), DMF

f) KF, kruunueetteri, 45 100 C tai amberlyst A-26-F-, CH2Cl2, 0 C, g) DAST, - 80 C

25 C tai TMSCl. py, DAST, - 80 C 25 C, h) hydratsiini (N2H4), , i) Pd-C, H2.

7

Syanohydriineist poistetaan vett fosforipentoksidin avulla. Dehydrauksella molekyyliin

muodostetaan kaksoissidos, joka saadaan polymeroitua. Menetelmll valmistetaan

alkyyliakrylonitriilej, joita kytetn muun muassa muoviteollisuuden raaka-aineina.1

2.2.2 Syanoryhmn reaktiivisuus

Syanohydriinien nitriiliryhmlle voidaan tehd monenlaisia reaktioita, mutta suojaamalla

hydroksyyliryhm esimerkiksi tert-butyylidimetyylisilyylikloridin (TBDMS-Cl) avulla

voidaan syanoryhmn reaktiivisuutta list.17

Ilman hydroksyyliryhmn suojausta voidaan toteuttaa muun muassa pelkistys- ja

hydrolyysireaktioita. Hiili-typpi kolmoissidoksen pelkistminen amiiniksi tapahtuu joko

litiumalumiinihydridill (LiAlH4)16 tai katalyyttisell vedytyksell, jossa katalyyttin

toimii esimerkiksi palladium.20 Yleens natriumboorihydridi (NaBH4) ei pelkist

kolmoissidoksia, mutta eriden lhteiden mukaan sill voidaan pelkist syanohydriinien

nitriiliryhm, kun katalyyttin kytetn trifluorietikkahappoa8, 21 tai nikkelisuolaa.15

Hiili-typpi sidoksen pelkistyksen jlkeen on mahdollista muokata amiinifunktionaalisuutta

happoklorideilla, jolloin muodostetaan -hydroksiamideja. Vaihtoehtoisesti etikkahappo

muurahaishappoanhydridiln avulla muodostetaan N-alkyyli- -aminoalkoholeja.18

Nitriilien hydrolysointi on happokatalysoitu reaktio (kuva 6.), jossa muodostuu ensin amidi

joka hydrolysoituu edelleen karboksyylihapoksi.1 Vaikka hydrolysointi vkevll hapolla

tai emksell muodostaa yleens raseemisen seoksen,15 niin yllttv kyll vkev

suolahappo ei muuta kiraalisten syanohydriinien optista aktiivisuutta.17 Silloin kun amidin

hydrolyysi on hitaampi kuin nitriilin, on amidi mahdollista erist reaktioseoksesta.1

Hydrolysoitaessa trimetyylisilyylikloridia (TMSCl) vedell muodostuu suolahappoa. Jos

reaktio muodostetaan nitriilien kanssa in situ, hydrolysoituu nitriili amidihydrokloridiksi.

Amidi saadaan vapautettua suolastaan neutraloimalla seos.22

8

Kuva 6. Nitriilin hydrolyysi. R = alkyyli tai fenyyli ja R = alkyyli tai vety 1

Hellvaraisempia kemiallisia aineita tai biokatalyyttej kytettess tulee amidin

muodostumisesta todennkisemp, tllin amideja voidaan valmistaa siirtymtila-

metallikatalyyttien tai entsyymien avulla. Toimiviksi todettuja metallikatalyyttej ovat

olleet esimerkiksi platinium(II)fosfiniitti tai palladium(II)kloridi.15 Entsyymeist

nitriilihydrataasit aikaansaavat amideja, kun taas nitrilaaseilla hydrolyysi etenee

karboksyylihapoksi saakka.23

Liittmll useampaa entsyymi apuaineeseen muodostetaan nk. CLEA- entsyymej

(cross-linked enzyme aggregate), joita kyttmll on mahdollista suorittaa monta

reaktiovaihetta samanaikaisesti. Esimerkkin (S)-mantelihapon valmistaminen

bentsaldehydist (kuva 7).24 Toisen tyyppinen nitriilin hydrolyysi tehdn Pinner

reaktiossa, jossa kuivan alkoholin ja suolahapon avulla, saadaan valmistettua estereit.1, 25

Kuva 7. Kyttmll samanaikaisesti (S)-HNLa ja epspesifist nitrilaasia CLEA-matriisiin immobilisoituna saadaan syntetisoitua (S)-2- hydroksihappoja. R=C6H5 24

9

-Aminoalkoholien valmistaminen on trket niiden biologisen aktiivisuuden takia.8

Esimerkiksi efedriinityyppisiin yhdisteisiin kuuluvan yhdisteen, enantiomeerisesti puhtaan

2-aminoalkoholin, valmistuksessa hydroksyyliryhm suojataan trimetyylisilyylikloridilla

(Me3SiCl), reaktioseokseen listn Grignardin reagenssia ja muodostunut imiini vlituote

pelkistetn natriumboorihydridill (kuva 8.).16, 17 Edell mainituista imiineist voidaan

edelleen valmistaa N-substituoituja aminoalkoholeja transiminaatiolla. Vaihtoehtoisesti

aminoalkoholit voidaan hydrolysoida, jolloin muodostetaan optisesti aktiivisia asyloineja,

joiden karbonyylihiilen -asemassa on hydroksyyliryhm.16

Kuva 8. Stereoselektiivinen 2-aminoalkoholien synteesi. R = C3H7, C6H5; R1 = CH3, C2H5, C6H5; X = Br, I 16

Hydroksyyliryhmn suojauksen jlkeen nitriilin mahdollisia reaktioita (kuva 9.) ovat

nukleofiiliset additioreaktiot, joissa muodostetaan -hydroksialdehydej (a),

hydroksiketoneita (b), 2-amino-1,3-dioleja (c), substituoituja -aminoalkoholeja (d), N-

substituoituja -hydroksi--aminohappoja (e), N-substituoituja, -substituoituja, -amino-

-alkoholeja (f), -hydroksialdonitroneja (g), -substituoituja -aminoalkoholeja (h),

tetronihappoja (i) ja -aminoalkoholeja (j).18 Niden yhdisteiden jatkoreaktiona voivat

esimerkiksi olla pelkistminen, transiminaatio, hydrolyysi sek syklisointi.8

10

Kuva 9. Hydroksyyliryhmn suojaus mahdollistaa seuraavat reaktiot: a) Di-isobutyyli-

alumiinihydridi (DIBAL), H2SO4, b) Grignard, H3O+, c) Vinyyli Grignard, NaBH4, di-tert-

butyylidikarbonaatti [(BOC)2O], metanoli, NaBH4, d) DIBAL, amiini, NaBH4 e) DIBAL,

amiini, HCN, karbonyyli-imidatsoli, ems, happo, f) Grignard, NaBH4, formyyliasetaatti,

litiumalumiinihydridi (LiAlH4) g) DIBAL, N-bentsyylihydroksyyli-amiini h) Grignard,

NaBH4 i) BrZnCHR3COOR4, H3O+ j) LiAlH4 tai boraani (BH3). Mukailtu lhteest

Sharma et al.18

11

3 Entsymaattiset menetelmt syanohydriinien valmistuksessa

3.1 Entsyymit

Entsyymit ovat luonnonkatalyyttej, joita esiintyy kaikissa elm sisltviss

olosuhteissa. Ne katalysoivat valtavan mrn erilaisia reaktioita alentamalla reaktioiden

aktivointienergiaa. Reaktionopeus muuttuu tyypillisesti 105108 -kertaiseksi, mutta voi

muuttua jopa 1017 kertaa nopeammaksi kuin ilman entsyymi tapahtuva reaktio.4, 26

Entsyymit ovat proteiineja, ja pysykseen aktiivisena niiden tulee esiinty tietyss

luonnonmukaisessa muodossa.26 Toisin kuin useat kemialliset reagenssit, entsyymit eivt

ole herkki kosteudelle tai ilmalle.4 Osa entsyymeist vaatii toimiakseen mys kofaktorin

ja/tai koentsyymin. Kofaktori on eporgaaninen ioni, esimerkiksi Fe2+ tai Mg2+, kun taas

koentsyymi on metalli-orgaaninen- tai orgaaninen molekyyli.27

Entsyymien luonnonmukaisuuden ja rakenteen takia niill on tiettyj reaktio-

olosuhdevaatimuksia. Kullakin entsyymill on sille ominainen pH- ja lmptila-alue, jossa

se toimii optimaalisesti.26 Entsyymien toiminta on usein substraattispesifist, eli entsyymit

toimivat vain tietynlaisen rakenteen omaavien lhtaineiden kanssa. Nm aineet sisltvt

kullekin entsyymille oikeanlaisen, aktiivisen sitoutumiskohdan. Entsyymin kiinnittyess

substraattiin siihen muodostuu entsyymisubstraattikompleksi, reaktion aktivointienergia

laskee ja reaktio nopeutuu.27

Entsyymien kytt lisntyy jatkuvasti mik johtuu niiden tietyist, hyvist

ominaisuuksista: ne ovat yleens kemo-, regio- ja stereoselektiivisi.9 Entsyymien

katalysoimat reaktiot suoritetaan normaalipaineessa ja lmptilassa (NTP), jolloin

sivureaktioita tapahtuu vhemmn kuin perinteisiss kemiallisissa reaktioissa. Entsyymien

katalysoimissa reaktioissa suojaryhmien kytt on yleens tarpeetonta. Lisksi nit

biokatalyyttej saadaan eristetty luonnosta ja synteesituotteiden tuotantoprosessien

energiankulutus on NTP -olosuhteiden takia vhisemp.28 Edelleen biokatalyytit

hajoavat biologisesti ja teollisuudessa ympristystvllisyys tuo tuotteille lisarvoa.28

12

3.2 Syanohydriinien valmistaminen

Oksinitrilaaseja esiintyy luonnossa erittin yleisesti. Siemenkasvit tuottavat

puolustuksekseen ja aminohappojen biosynteesiin hydroksinitriililyaasia (HNL) eli

oksinitrilaasia. Kasvin sisltmt syanogeeniset glykosidit ja/tai syanolipidit ovat

stabiilissa muodossa olevia syanohydriinej, joita oksinitrilaasit pilkkovat vapauttaen

samalla vetysyanidia (kuva 10).15, 29, 30 -Hydroksinitriilien entsymaattisessa valmis-

tuksessa tt katalyyttiominaisuutta kytetn pinvastaiseen tarkoitukseen eli

syanohydriinien muodostamiseen.15 Syanohydriinit ovat trkeit kemiallisten reaktioiden

lhtaineina kytettvi bifunktionaalisia yhdisteit, joilla voidaan valmistaa

enantiopuhtaita synteesituotteita.31 Lipaasientsyymill (E.C.3.1.1.3) saadaan valmistettua

syanohydriinej, mutta tllin tuotteet muodostuvat raseemisena seoksena, aivan kuten

kemiallisessa reaktiossa.11

Kuva 10. Syanogeenisten glykosidien hajoaminen ensin glukosidaasin avulla, seuraavassa vaiheessa HNL katalysoi vetysyanidin vapautumisen kasvin puolustukseksi. - Hydroksinitriilien entsymaattinen valmistus tapahtuu knteisess reaktiossa. Mukaillen lhteist Schmidt et al. 17, Pichersky et al.32ja Johnson et al.33

13

Entsyymeill on niille suositellut nimet, mutta useiden eri synonyymien takia International

Union of Biochemistry and Molecular Biology:n nimemislautakunnasta koostuva

entsyymikomissio (E.C.) on luokitellut entsyymej E.C.-numeroilla vuodesta 1961

alkaen.34 E.C.-numeron kytt julkaisuissa on suositeltavaa epselvyyksien vlttmiseksi.

Entsyymien luokittelussa kytetn nelinumeroista jrjestelm, jossa ensimminen

numero kertoo reaktiotyypin, toinen reaktion alaluokan, kolmas antaa listietoa reaktiosta

ja neljs numero kertoo substraattispesifisyyden.35 Esimerkiksi E.C.4.1.2.x:ss

ensimminen 4. tarkoittaa, ett entsyymit kuuluvat lyaaseihin, toisena oleva 1. kertoo

kyseess olevan hiili-hiilisidoksia muodostava lyaasi ja kolmantena oleva 2. on

aldehydilyaasien numero.35, 36.

Enantioselektiivinen vetysyanidin additio tuottaa tietyn stereoisomeerin omaavia

syanohydriinej, jotka saadaan aikaan kyttmll hydroksinitriililyaaseja eli

oksinitrilaaseja. Nihin kuuluvat E.C.4.1.2.x; E.C.4.1.2.10, E.C.4.1.2.11, E.C.4.1.2.37,

E.C.4.1.2.38 ja E.C.4.1.2.39.18, 36. E.C.-numerot E.C.4.1.2.37 ja E.C.4.1.2.39 on poistettu ja

niit korvaavat uudet numerot E.C.4.1.2.46 ja E.C.4.1.2.47. Tss tyss kytetn uusia

numeroita, vaikka viitteess olisi kytetty vanhoja E.C.-numeroita. (Taulukko 1. s. 15)

3.2.1 Hydroksinitriililyaasilhteit

Kolmisentuhatta kasvilajia tuottaa oksinitrilaasientsyymi. Lajeihin kuuluu useita eri

kasvisukuja, joiden tuottamat entsyymit erovat toisistaan substraattispesifisyyden ja

koentsyymivaatimusten mukaisesti.37

Entsyymilhteet jaotellaan kahteen luokkaan sen mukaan, minklaisen kofaktorin ne

tarvitsevat. Luokkaan I kuuluvat kyttvt flaviiniadeniinidinukleotidia (FAD) ja luokkaan

II eivt.18. Luokkaan I kuuluvat Rosaceae-suvun alalajien Pruinoideae ja Maloideae

kasvit, kuten omenat (McHNL), kirsikat (PsHNL, PlyHNL) ja mantelit (PaHNL).18.

Niden entsyymien sekvenssi koostuu psntisesti N-glykolysoituneesta proteiinista,

jonka hiilihydraattipitoisuus on 30 %.17 I luokan entsyymien luonnossa esiintyv

substraatti on (R)-mantelinitriili (E.C.4.1.2.10).37, 38 (R)-mantelinitriililyaasin substraatti-

spesifisyys on laaja sill se reagoi mys alifaattisten, aromaattisten, heteroaromaattisten ja

-tyydyttymttmien aineiden kanssa.15 Luokkaan II kuuluvat entsyymit eivt vaadi

FAD:a toimiakseen. Thn luokkaan kuuluvat Euphorbiaceae-sukuun kuuluvat kumipuu

14

(Hevea Brasiliensis) HbHNL (E.C.4.1.2.47) ja kassava (Mannihot esculenta) MeHNL

(E.C.4.1.2.38). Niden entsyymien toiminta on /-hydrolaasien kaltaista. Edell

mainituista kasveista saatavan entsyymin luonnollinen substraatti on asetonisyanohydriini,

mutta ne hyvksyvt reagenssikseen mantelinitriililyaasin lailla alifaattiset, aromaattiset,

heteroaromaattiset ja -tyydyttymttmt substraatit. Niiden stereoselektiivisyys on

mantelinitriilist poiketen S-muotoa.37. (Taulukko 1. s. 15)

Muita II luokkaan kuuluvia kasveja ovat mm. durra ja pellava. Durran (Sorghum bicolor)

SbHNL (E.C.4.1.2.11), entsyymin aminohapposekvenssi on erilainen kuin muiden

tunnettujen hydroksinitriililyaasien ja muistuttaakin suurimmaksi osaksi

karboksipeptidaasien sekvenssi.37 Sen luonnollinen substraatti on (S)-4-hydroksi-

mantelinitriili, ja se reagoi lisksi aromaattisten ja heteroaromaattisten aineiden kanssa.15, 39

Pellavasta (Linus usitatissimum) saadaan (R)-spesifist hydroksinitriililyaasia (LuHNL,

E.C.4.1.2.46), joka on alkoholidehydrogenaasien lailla toimiva sinkist (Zn2+) riippuvainen

entsyymi. Sen luonnollinen substraatti on (R)-2-butanoni syanohydriini, ja se toimii

alifaattisten ja -tyydyttymttmien aldehydien kanssa.37 (Taulukko 1.)

Entsyymilhteest riippuen kullakin HNL:lla on sille optimaalinen pH-toiminta-alue.

Edell mainituista suurin osa toimii hyvin pH:ssa 5.5, mutta ritapauksia ovat MeHNL:n

pH-alue 3.55.4 ja PsHNL:n alue 6.07.0.18 Lisksi rekombinanttitekniikalla tuotetuilla

entsyymeill on omat optimialueensa.

Entsymaattisissa reaktioissa lmptilalla on suuri vaikutus entsyymien stabiilisuuteen ja

muodostuvien tuotteiden enantiomeeriseen puhtauteen. Sen lisksi, ett alhainen lmptila

(-5 4 C) stabiloi entsyymien toimintaa, tuottavat ko. lmptilassa tehdyt reaktiot

enantiomeerisesti puhtaampaa syanohydriini.3, 18, 40, 41

15

Taulukko 1. Hydroksinitriililyaasien E.C.-numerot, niiden suositellut nimet ja synonyymit.35, 42

E.C.-numero Systemaattinen nimi Synonyymej Substraatit pH alue Lmp- tila-alue

4.1.2.10 (R)- mantelinitriili bentsaldehydilyaasi (syanidia muodostava)

(R)-mantelinitriililyaasi, (R)-oksinitrilaasi, Oksinitrilaasi, D-oksinitrilaasi, D--hydroksinitriililyaasi mantelinitriili bentsaldehydilyaasi PaHNL, AtHNL, (R)-HNL, (R)-PeHNL, (R)-hydroksinitriililyaasi R-selektiivinen hydroksinitriililyaasi R-selektiivinen HNL (R)-(+)- mantelinitriililyaasi

Mantelinitiriili Alifaattiset ja aromaattiset aldehydit ja metyyliketonit

2,5-7 10-35 C

4.1.2.11 (S)-4- hydroksimantelinitriili 4-hydroksi bentsaldehydilyaasi (syanidia muodostava)

Hydroksimantelinitriililyaasi Hydroksinitriililyaasi Oksinitrilaasi (S)-4-hydroksimantelinitriili Hydroksibentsaldehydilyaasi Sorghum hydroksinitriililyaasi SbHNL

4-Hydroksi-mantelinitriili, aromaattiset aldehydit, ja metyyliketonit

3,2-6,5 -5-25 C

4.1.2.38 2-hydroksi-1,2-difenyylietanoni bentsaldehydilyaasi (bentsaldehydi muodostava)

Bentsoiini aldolaasi Bentsaldehydilyaasi

2-hydroksi-1,2-difenyylietanoni, 6-8,5 25-37

i

4.1.2.46

(2R)-2-hydroksi-2-metyylibutaaninitriili butan-2-one-lyaasi (syanidia muodostava)

Alifaattinen (R)- hydroksinitriililyaasi (R)-HNL (R)-oksinitrilaasi (R)-hydroksinitriililyaasi LuHNL

Asetonisyano-hydriini, alifaattiset aldehydit ja metyyliketonit 4,1-5,5 25 C

4.1.2.47 (S)-syanohydriinilyaasi (syanidia muodostava)

(S)-hydroksinitriililyaasi (S)-oksinitrilaasi, (S)-HbHNL (S)-MeHNL, Hydroksinitriililyaasi

Mantelinitriili, alifaattiset ja aromaattiset aldehydit sek metyyliketonit

4,8-8 -5-25 C

i stabiilisuustestien tulos

16

3.2.1.1 Rekombinanttientsyymit

Entsyymien saatavuus riippuu tuotantokasvin HNL pitoisuudesta ja kasvien sadosta. Jotta

entsyymien tuotanto ei olisi kasvien tuotannosta ja kasvikaudesta riippuvaista, on niiden

tuottamiseksi kehitetty geenitekniikkaan perustuvia menetelmi.15

Useita HNL-entsyymej on tuotettu yhdistelm-DNA-tekniikkaa hyvksi kytten.

Esimerkiksi bakteeri- ja hiivakantojen avulla on onnistuttu optimoimaan MeHNL ja

HbHNL entsyymien kloonaus ja tuottaminen.15 Mantelista (Prunus amygdalus, Pa)

saatavaa oksinitrilaasia, PaHNL-entsyymi, on muokattu DNA-tekniikalla kloonaamalla

isoentsyymi 5:a. Tt on edelleen tuotettu Pichia pastoris -hiivan kasvuliuoksessa

onnistuneesti.43, 44 Tll tavalla muokkaamalla voidaan tuottaa reaktiivisempia entsyymej.

Rekombinantti isoentsyymi PaHNL5:n toiminnallinen pH-alue on 2.56.5,44 ja

perinteisesti mantelista eristetyn PaHNL:n optimaalinen alue on 5.56.0. Reaktiivisempien

entsyymien ansiosta mys eptavallisten substraattien kytt on mahdollistunut44, 45 ja

lkeaineena kytettyjen kiraalisten tuotteiden saanto on parantunut.46

Yhdistelm-DNA-tekniikan avulla on tuotettu mys lituruohosta (Arabidopsis thaliana,

AtHNL, E.C.4.1.2.10), saatavaa oksinitrilaasia. Se on rakenteeltaan samankaltainen

raseemisen seoksen tuottavan lipaasientsyymin, sek (S)-syanohydriini tuottavien

HbHNL:n ja MeHNL:n kanssa.47, 48 Edell mainituista poiketen AtHNL tuottaa (R)-

konformaatiota. Tllin voidaan syntetisoida (R)-syanohydriinej49 tai (R)--

nitroalkoholeja.50

17

3.2.2 (R)-Oksinitrilaasi

Syanohydriinien synteesi on tehty pasiassa PaHNL -entsyymill, sill mantelista

perisin olevaa entsyymi on saatavilla kohtuulliseen hintaan ja runsaasti.51

Kirjallisuudessa on esitetty useita erilaisia menetelmi sislten eri lhtaineita ja muita

reagensseja syanohydriinien valmistamiseksi. Seuraavassa ksitelln vain (R)-

oksinitrilaasientsyymill suoritettuja reaktioita.

Suurin osa kaupallisesti kiinnostavista oksinitrilaasin substraateista on

bentsaldehydijohdannaisia, yleens veteen liukenemattomia aineita.42 Oksinitrilaasi on

inaktiivinen tysin vedettmiss olosuhteissa ja kaikissa viitteiss onkin kytetty vett

pH:n stmiseksi tai entsyymin aktivoimiseksi. Reaktioita (R)-oksinitrilaasilla on tehty

etyyliasetaatissa, di-isopropyylieetteriss (DIPE) ja dibutyylieetteriss.52-57 Tm johtuu

siit, ett nm liuottimet liukenevat veteen vain osittain. Tllin jopa hitaasti reagoivat

karbonyyliyhdisteet muodostavat haluttuja tuotteita mittmn pienill vetysyanidin

lisyksill.17 DIPE on osoittautunut hyvksi liuottimeksi, sill entsyymin aktiivisuus pysyy

pitkn hyvn.51 Muita kytettyj liuoksia ja liuosyhdistelmi ovat olleet vesi-etanoli,16, 52,

55 vesi-dietyylieetteri,52 metyyli-tert-butyylieetteri (MTBE),58, 59 etanoli-etikkahappo,60

vesi-ioniliuos,61 kaliumfosfaatti-sitraattipuskuri,12 tolueeni,12 ja dikloorimetaani.12

Vetysyanidilhtein on kytetty HCN,54, 55, 62, 63 KCN,52 asetonisyanohydriini,52, 62, 63

NaCN58 tai etyylisyanoformaattia.12

Reaktion pH:ta on sdetty oksinitrilaasientsyymille optimaalisen pH:n aikaansaamiseksi.

Kirjallisuudessa reaktioseoksen pH on vaihdellut 3,3 ja 7 vlill lhtaineesta ja puskurista

riippuen. Artikkeleissa todetaan optimin olevan pH viidess11, 17 tai 5,5-6,0:ssa.64 Tmn

lisksi todetaan orgaanisen liuottimen ja alhaisen pH:n, vhentvn kemiallista reaktiota.11,

37, 51

Reaktiolmptila vaikuttaa entsyymin stabiilisuuteen ja tuotteen enantiomeeriseen

puhtauteen.3 Syanohydriinej onkin syntetisoitu oksinitrilaasilla reaktioseoksissa joiden

lmptila on ollut 0 - 30 C asteen vliss, yleens noin 5 C:ssa.29, 65, 66

18

4 Hiilihydraatit

Hiilihydraatit ovat aldehydej tai ketoneja, joiden hiilirunkoon on liittyneen useita

hydroksyyliryhmi. Suurin osa luonnon orgaanisesta materiaalista koostuu

hiilihydraateista; ne toimivat muun muassa energiavarastona, osana DNA- ja RNA:ta sek

rakenne-elementtein kasvi- ja bakteerisoluissa. Kasvien kuivapainosta jopa 80 % on

hiilihydraatteja.20, 67

4.1 Mono-, oligo- ja polysakkaridit

Hiilihydraatit jaotellaan mono, oligo- ja polysakkarideihin. Monosakkarideissa on yksi

sokerimolekyyli, oligosakkarideista muodostuu hydrolyysiss kahdesta kahdeksaan

monosakkaridiyksikk68 ja polysakkaridit hydrolysoituvat monosakkarideiksi.69

Monosakkaridit ovat yksinkertaisimpia hiilihydraatteja, joissa on kolmesta yhdeksn

hiiliatomia69 ja joiden stereokemiallinen rakenne vaihtelee yhden tai useamman hiiliatomin

osalta. Viisi- ja kuusiatomiset sokerit ovat yleisimpi luonnossa. Pentooseja ovat mm. D-

ksyloosi ja D-arabinoosi, heksooseja ovat D-glukoosi, D-fruktoosi, D-galaktoosi ja D-

mannoosi.70 Monosakkaridit esiintyvt usein rengasrakenteisena johtuen molekyylin

etisten funktionaalisten ryhmien interaktiosta. Yleisesti aldehydin ja alkoholin reaktiossa

muodostuu hemiasetaali ja vastaavasti ketonin reagoidessa alkoholin kanssa muodostuu

hemiketaali.71 Sokerimolekyylin sisltmt hydroksyyliryhmt numeroidaan molekyyliss

olevien hiiliatomien mukaisesti.71

19

Kuva 11. Glukoosimolekyylin hemiasetaalin muodostuminen.71

Rengasrakenne syntyy, kun aldoheksooseista muodostuu hemiasetaali ensimmiseen ja

viidenteen hiilen kiinnittyneen ryhmn reaktiossa esimerkkin glukoosi (kuva 11).

Vastaavasti ketoheksooseista muodostuu hemiketaali, kun toisen ja viidennen hiilen

funktionaaliset ryhmt reagoivat keskenn esimerkkin fruktoosi (kuva 12.). Molemmissa

tapauksissa entiseen karbonyylihiileen muodostuu uusi kiraliakeskus ja siit tulee ns.

anomeerinen hiili.

Kuva 12. Fruktoosin hemiketaalin muodostuminen.71

Rengasrakenteinen, anomeerisen hiilen sisltv sokerimolekyyli esiintyy - tai -

muodossa, riippuen muodostuneen hydroksyyliryhmn suunnasta molekyyliin nhden.71

Liuoksissa sokerien anomeeriset muodot esiintyvt tautomerisessa tasapainossa (kuva

13.)72

20

Oligo- tai polysakkaridissa anomeerisen hiilen hydroksyyliryhm on sitoutunut toisen

sokerimolekyylin hiileen. Sokerimolekyylin anomeerinen hiili voi liitty toisen sokerin

mihin tahansa hydroksyyliryhmn muodostaen uuden - tai -glykosidisen sidoksen.

Aksiaalisesti toisiinsa sitoutuneet sokerimolekyylit voivat muodostaa kierteisen

konformaation, tllin glykosidiset sidokset ovat -muotoa. Trkkelyksen sisltm

amyloosi on esimerkki tllaisesta kierteisest muodosta. -Glykosidisten sidosten

muodostama molekyyli on taas lineaarinen, kuten esimerkiksi galaktomannaanissa.70

Kuva 13. Glukoosin vesiliuoksessa (rt) muodostuvat eri tautomeriamuodot. - furanosodi, -furanosodi-, ja asyklista aldehydi -muotoa on liuoksessa yhteens alle 0,2 %. Mukaillen lhteest 72

21

Kolme trkeint oligosakkaridia ovat sakkaroosi, laktoosi ja maltoosi, nm kaikki ovat

disakkarideja. Niiden kemiallinen merkitys on lhinn ravitsemuksellinen. Ne

hydrolysoituvat elimistss siten, ett sakkaroosi glukoosiksi ja fruktoosiksi, laktoosi

galaktoosiksi ja glukoosiksi sek maltoosi kahdeksi glukoosiksi. Nm muutetaan

elimistss aineenvaihdunnan avulla energiaksi.71 Ers esimerkki trisakkaridista on

raffinoosi, jota saadaan uutettua soijapavuista.73 Raffinoosi koostuu galaktoosi-, glukoosi-

ja fruktoosiyksikist (kuva 14.).68 Trisakkaridina siin on noin 30 %

galaktoosiyksikit.74

Kuva 14. Raffinoosin eli -D-Galaktopyranosyyli-(16)--D-glukopyranosyyli-(12)--D-fruktofuranosidin rakenne. Mukailtu lhteest Neubauer et al. 75

Polysakkaridit ovat homo- tai heteropolysakkarideja sen mukaan koostuuko sen rakenne

samanlaisista vai erilaisista monosakkarideista. Polysakkaridien rakenne voi olla suora tai

haaroittunut. Esimerkiksi glukoosin energiavarastomuoto glykogeeni on

homopolysakkaridi. Se koostuu suorasta glukoosiketjusta, jossa on noin joka

kymmenenness yksikss haarautuma.69 Ers esimerkki heteropolysakkaridista on

guarkumi (kuva 15.).

22

4.2 Galaktomannaanit

Galaktomannaanit ovat trkeit polysakkarideja useilla eri teollisuuden aloilla. Vilja- ja

palkokasvien siementen varastoravintoa on yleens trkkelys, mutta joidenkin

palkokasvien varastopolysakkaridina toimivat galaktomannaanit.76 Nm ovat

monikyttisi makromolekulaarisia hiilihydraatteja, joita saadaan sek monivuotisten

puuvartisten ett yksivuotisten kasvien siemenist.77 Guarkumi (Cyamopsis

tetragonolobus) on ers tllainen yksivuotinen palkokasvi, jota kasvaa runsaasti Intian

niemimaalla. Sen rakenne on muistuttaa useimmista palkokasveista saatavien

galaktomannaanien perusrakennetta (kuva 15.). Se on lineaarinen (14) -glykosidisin

sidoksin sitoutunut D-mannopyranosidiketju, jossa on satunnaisesti liittyneen yksittinen

(16)-sidoksella kiinnittynyt D-galaktoosihaara. Johanneksen leippuusta (Cerartonia

siliqua) saatava kumi (locust bean gum, LBG) on toinen trke galaktomannaani.78

Kuva 15. Idealisoitu guarkumin rakenne.77

Eri kasvilajien galaktomannaanit eroavat toisistaan mannoosi-galaktoosi -suhteen (M:G),

galaktoosihaarojen paikan- ja molekyylipainovaihteluvlin mukaan.76, 79 Galaktoosihaarat

voivat esiinty molekyyliss snnllisesti, satunnaisesti tai jaksoina. Guarkumin M:G -

suhde on noin 2:1 ja siin olevat galaktoosiyksikt esiintyvt pareittain tai kolmen

sarjoissa. Haarautumaton mannoosiketju on yleens alle kuuden sokerimolekyylin

mittainen.76, 78 Johanneksenleippuukumin M:G -suhde on 4:1 ja sen haarautumaton

mannoosiketju voi olla jopa 20. yksikn mittainen.70 Johanneksenleippuun

23

galaktomannaanin galaktoosipitoisuus on noin 1726 % ja guarkumin galaktoosipitoisuus

vaihtelee 3340 % vlill.74, 77 Galaktomannaanien rakenteiden erot vaikuttavat niiden

vesiliukoisuuteen, viskositeettiin ja reaktiivisuuteen.80 Nm mrittelevt edelleen kunkin

galaktomannaanin teolliset sovellukset. Guarkumin teollinen kytt on lhtisin

paperiteollisuuden tarpeista, mutta koska se on taloudellisin ja runsaimmin saatavilla oleva

raaka-aine, on sen kytt nykyn laaja-alaista mm. elintarvike- ja lketeollisuudessa.76

Kytttarkoituksesta riippumatta galaktomannaanin perusrakenne pysyy

muuttumattomana, mutta mm. molekyylipainoa, viskositeettia ja liukoisuutta voidaan

muuttaa hydrolyyttisella tai oksidatiivisella depolymerisaatiolla. Tllin muodostetaan

stabilisaattoreita, viskositeetin muodostajia ja emulsaattoreita.76 Nit kytetn

ljylhteiden kaivauksissa, rjhde-, kaivos-, paperi- ja tekstiiliteollisuudessa. Edelleen

guarkumia kytetn ruoka-, lke- ja kosmetiikkateollisuudessa edullisena lisaineena

esimerkiksi estmn veden kidemuodostusta jteliss, ravintoaineissa lismss

kyllisyyden tunteen syntymist ja ruokavalmisteissa miellyttvn suutuntuman

aikaansaamiseksi.76, 77, 81

4.2.1 Galaktomannaanien reaktiivisuus

Guarkumin galaktoosisivuhaarat sisltvt yhden primaarisen ja kolme sekundaarista OH-

ryhm, substituoitu mannoosi kaksi sekundaarista OH-ryhm, sek substituoimaton

mannoosi kaksi sekundaarista ja yhden primaarisen OH-ryhmn (kuva 15).77

Galaktomannaanien hydroksyyliryhmt voidaan derivatisoida. Niiden primaariset ja

sekundaariset hydroksyyliryhmt (OH) ovat lhes yht reaktiivisia.77 Yleisesti ottaen

primaarinen hydroksyyli reagoi helpommin kuin sekundaarinen. Hydroksyyliryhmi on

mahdollista hapettaa selektiivisesti kyttmll joko kemiallista tai entsymaattista

menetelm. Kemiallisessa reaktiossa voidaan kytt esimerkiksi 2,2,6,6-

tetrametyylipiperidiini-1-oksyyli (TEMPO)82, 83 ja entsymaattisessa esimerkiksi

galaktoosioksidaasia (GO).74, 84, 85 TEMPO:lla galaktoosin ja vapaiden mannoosiryhmien

C-6 hydroksyyliryhmt hapettuvat karboksyylihapoksi. Entsymaattisella menetelmll

terminaalisten galaktoosien C-6 hydroksyyliryhmt hapettuvat aldehydiksi.

Guarkumia voidaan derivatisoida tarpeen mukaan muodostamalla siit estereit tai

eetterijohdannaisia. Sit karboksimetyloidaan vesiliuoksissa86, 87 ja hydroksietyloidaan

24

emksisiss olosuhteissa.88 Siit on muodostettu metyylieettereit, joiden

metyylisubstituentit ovat olleet satunnaisesti kiinnittyneen sokerirenkaisiin

substituutioasteella 0,3-0,6.89 Teollisuuden tarpeisiin valmistetaan hydroksipropyyli-,

hydroksietyyli-, karboksimetyyli-hydroksipropyyli- ja kationista guarkumia.90 Mys

kationisia hydroksyylipropyyliguarkumeja, hydrofobisia guarkumeja sek

guarkumifosfaatteja valmistetaan.77 Hydroksyyliryhmien korvautumista kuvataan

substituutioasteella (DS, degree of substitution). Sen maksimaalinen arvo on kolme, jolloin

kaikki molekyylin hydroksyyliryhmt ovat substituoituja.90 Polysakkaridin

liukoisuusominaisuudet voivat muuttua niinkin pienill DS:n arvoilla kuin 0,1.90

Guarkumia voidaan depolymerisoida lmmittmll sit suolahapon kanssa.89 Mys

muiden vahvojen happojen tai orgaanisten happojen, kuten sitruuna- tai askorbiinihapon,

kyttminen on mahdollista. Ketjun pilkkomiseen on mahdollista kytt mys emksisi

olosuhteita tai vahvoja hapettimia esim. vetyperoksidia, mys elektronisuihkulla tai

gammasteill steilyttminen pilkkovat polymeerin pienempiin osasiin.77 Nin ollen

derivatisointireaktioita suoritettaessa on huomioitava kytetyn emksen konsentraatio,

lmptila sek reaktioaika suurimman mahdollisen substituutioasteen saavuttamiseksi,

kuitenkin molekyylikoon siit krsimtt.89

25

KOKEELLINEN OSUUS

5 Johdanto

Tss tyss tutkittiin oligo- ja polysakkarideja, joiden terminaalisen galaktoosin C-6-

asemassa oleva hydroksyyliryhm hapetettiin entsymaattisella reaktiolla selektiivisesti

aldehydiksi. Muodostetun aldehydin annettiin edelleen reagoida vetysyanidin kanssa siten,

ett katalyyttin toimi mantelista perisin oleva oksinitrilaasientsyymi. Reaktioseoksessa

muodostui syanohydriini, joka hydrolysoitui edelleen -hydroksiamidiksi (kuva 16.).

Reaktioseokseen mahdollisesti jljelle jnyt lhtaine (aldehydi) pelkistettiin alkoholiksi

NaBH4:ll.

Kuva 16. Synteesireitti, GO = galaktoosioksidasi, HRP= piparjuuriperoksidaasi, PaHNL= (R)-oksinitrilaasientsyymi

Tuotteet analysoitiin pasiassa kaasukromatografia-massaspektrometrill (GC-MS).

Analyysi varten tuote kuivattiin vakuumiuunilla, hydrolysoitiin ja silyloitiin.

Synteesituotteiden rakenteet varmistettiin nestekromatografia-massaspektrometrilla (LC-

MS/MS) ja ydinmagneettisella resonanssispektroskopialla (NMR). Nit menetelmi

varten nytteet kuivattiin kylmkuivaimella.

26

5.1 Materiaalit ja menetelmt

5.1.1 Reagenssit ja entsyymit

Sakkaridit:

D-(+)-raffinoosi pentahydraatti (Sigma R0250)

Guarkumi, GG (Sigma, G 4129)

Pilkottu guarkumi, GM50, (3KP17, mw 50 000 g/mol)

Metyyli--D-galaktopyranosidi (Fluka 66916)

D-(+)-mannoosi, Merck

D-(+)-glukoosi, Merck

D-(+)-galaktoosi, Merck

Syanidilhteet:

Natriumsyanidi, NaCN, Merck

Etyylisyanoformaatti, NCCOOEt, (Sigma E18859)

Entsyymit:

Galaktoosioksidaasi (GO, G7907, E.C.1.1.3.9, Sigma), 73 U/mg

Piparjuuriperoksidaasi (HRP, P8250, EC 1.11.1.7, Sigma), Tyyppi II, 188 U/mg

Katalaasi (Kat, C30, E.C. 1.11.1.6, Sigma), 22000 U/mg ja 638 kU/ml

(R)-Oksinitrilaasi (PaHNL, M6782, E.C.4.1.2.10, Sigma) 560 U/ml

-glukosidaasi (G0395, E.C. 3.2.1.21, Sigma) 2,18 U/mg

Hydroksinitriililyaasi (HNL), Arabidopsis thaliana, recombinant from E.Coli, (79847,

Sigma), 581 U/ml

27

Pelkistimet:

Natriumboorihydridi (NaBH4, Sigma)

Natriumboorideuteridi (NaBD4, Sigma)

Silylointireagenssit:

Klooritrimetyylisilaani, TMCS (Fluka 92360)

Heksametyylidisiloksaani, HMDS (Fluka 52619)

Pyridiini, py, (Sigma)

Muut reagenssit:

Etanoli, EtOH, (92,4 %)

Metanoli, MeOH, (Sigma)

Asetyylikloridi, (Sigma)

Sitruunahappo monohydraatti, (Merck)

Trinatriumsitraatti dihydraatti, (Merck)

Natriumdivetyfosfaatti dihydraatti NaH2PO42H2O, (Riedel de Han)

Dinatriumvetyfosfaatti Na2HPO4, (Riedel de Han)

Dowex 1x2-200 ioninvaihtohartsi, (Sigma 217387)

Synteesit tehtiin huoneenlmptilassa magneettisekoituksella.

28

5.1.2 Sokereiden hapetus

Hapetettua sakkaridia valmistettiin D-(+)-raffinoosi pentahydraatista (Raf) sek

guarkumista (GG).74, 84 Menetelmss galaktoosiyksikn C-6 hydroksyyli hapetetaan

selektiivisell entsymaattisella menetelmll aldehydiksi vesiliuoksessa. Hapetusreaktioon

kytettyjen entsyymien pitoisuus laskettiin suhteellisena osuutena polysakkaridin

sisltmist terminaalista galaktoosiyksikist.

D-(+)-raffinoosi pentahydraattia liuotettiin ultrapuhtaaseen veteen siten, ett sen

raffinoosipitoisuus oli 42 mM. Liuosta sekoitettiin 200-300 rpm nopeudella kahden tunnin

ajan huoneenlmptilassa, jotta kaikki raffinoosi oli varmasti liuennut. Thn liuokseen

listtiin galaktoosioksidaasia (GO) 73U, katalaasia (kat) 127 kU ja piparjuuriperoksidaasia

(HRP) 226 U. Liuosta hapetettiin avoimessa astiassa 200 rpm sekoituksella 72 tunnin ajan

+4 C. Entsyymien toiminta inaktivoitiin kuumentamalla liuosta kiehuvassa vesihauteessa.

Liuoksen sislmptilaa pidettiin 5 minuutin ajan 80 C, jonka jlkeen liuos siirrettiin

silpulloon ja +4 C. Tst liuoksesta otettiin nyte hapetusasteen mrityst varten.

Guarkumia hapetettaessa liuotettiin se ultrapuhtaaseen veteen ja annettiin liuoksen (1

mg/ml) sekoittua 200-300 rpm nopeudella kahden tunnin ajan. Thn liuokseen listtiin

GO (29 U), kat (51 kU) sek HRP (188U). Liuosta hapetettiin avonaisessa astiassa 200

rpm sekoituksella 24 h, + 4 C. Reaktio lopetettiin lmmittmll seosta vesihauteessa,

jossa sit pidettiin niin kauan ett liuoksen sislmptila oli 5 minuutin ajan + 80 C. Liuos

jhdytettiin ja silytettiin + 4 C. Liuoksesta otettiin nyte hapetusasteen mrityst

varten. (Taulukko 7. s. 43)

Pilkottua guarkumia (GM50) hapetettiin liuottamalla sit (5 mg/ml) ultrapuhtaaseen veteen,

liuosta sekoitettiin 200-300 rpm 1,5 tunnin ajan huoneenlmptilassa. Reaktio

kynnistettiin lismll liuokseen HRP (37,6 U), kat (10 kU) ja GO (5,8 U).

Reaktioliuosta sekoitettiin avonaisessa astiassa 200 rpm sekoituksella + 4 C 48 h, jonka

jlkeen se siirrettiin silpulloon.

29

5.2 Syanohydriinien synteesi

Syanohydriininien syntetisointia on tehty aikaisemmin useilla eri entsyymeill, mutta

reaktioliuoksena on ollut joko liuotin tai kaksifaasisysteemi. Vaihtoehtoisesti entsyymej

on kytetty kantajamateriaalissa, esimerkiksi selluloosassa. Tss tyss tarkoituksena oli

saada mantelista perisin oleva (R)-oksinitrilaasientsyymi toimimaan sellaisenaan vesi-

puskuri-liuoksessa.

Synteeseiss tutkittiin (R)-oksinitrilaasientsyymi sek -glukosidaasia, jotka molemmat

toimivat kasveissa syanogeenisten glykosidien katabolian katalyyttein. Lisksi kokeiltiin

lituruohosta saatavan hydroksinitriililyaasin toimivuutta. Synteesit suoritettiin pasiassa

pH 4.0:ssa, jotta korkeammassa pH:ssa tapahtuva kemiallinen reaktio olisi ehkisty

mahdollisimman hyvin. Kemiallisen reaktion suuruutta tutkittiin ns. reaktionollalla, jossa

reaktio suoritettiin entsymaattisen reaktion optimaalisissa olosuhteissa ilman entsyymi.

Suoritettuja kokeita tehtiin suuri mr, sill haluttiin selvitt kaikkien reaktioon

osallistuvien aineiden ristikkisvaikutus. Nin ollen esimerkiksi oksinitrilaasilla

onnistuneet kokeet toistettiin -glukosidaasilla. Lisksi synteesin toimivuutta tutkittiin

guarkumilla.

5.2.1 Syanidilhteet

Reaktioissa syanidilhteen kytettiin natriumsyanidia (NaCN) ja etyylisyanoformaattia

(NCCOOEt). Kirjallisuuden mukaan asetonisyanohydriini olisi helppokyttinen

kaupallinen syanidilhde syanohydriinin muodostamiseksi, sill se liukenee veteen ja

hydrolysoituu reaktioseoksessa asetoniksi ja syanidiksi.2 Valitettavasti

asetonisyanohydriini ei ollut saatavilla tynsuoritusajankohtana. Mys sek

natriumsyanidi ett etyylisyanoformaatti muodostavat reaktioseokseen vetysyanidia in situ.

Etyylisyanoformaatti hajoaa vedess (kuva 17.) muodostaen vetysyanidia, hiilidioksidia ja

etanolia, kun taas natriumsyanidi muodostaa vetysyanidia ja emst.

30

Kuva 17. Etyylisyanoformaatin hajoaminen vedess.12

Ensimmiset kokeet tehtiin natriumsyanidilla, mutta todettiin kytn olevan hankalaa pH:n

stmisen takia. Etikkahapolla olisi ollut mahdollista aikaansaada oikea pH

natriumsyanidia kytettess,39 mutta riskin oli sakkaridin hydrolysoituminen, joten sit

reitti ei edes harkittu. Natriumsyanidin emksisyys aiheutti reaktioseokseen pH:n

kohoamisen jopa kolmeentoista saakka. Tllin reaktioseokseen listtiin sitruunahappoa,

jonka seurauksena liuoksen puskurointikyky menetettiin. Koska reaktio-olosuhteiden

vakioiminen todettiin hankalaksi ja samanlaisten olosuhteiden aikaansaaminen useisiin eri

reaktioihin koettiin mahdottomaksi, ptettiin jatkossa kytt etyylisyanoformaattia

syaanilhteen.

5.2.2 Puskuriolosuhteet

Kytetyt lhtaineet olivat sakkarooseja jotka liukenevat veteen ja pyridiiniin sek osittain

etanoliin. Lhtaineiden hapetus tehtiin laimeissa vesiliuoksissa ja jatkoreaktion

puskurointikyky saavutettiin lismll lhtaineliuokseen vkevmp puskuria. Tm

laimeni siten, ett saatiin reaktioille sopiva puskurikonsentraatio ja pH.

Kirjallisuudessa (R)-oksinitrilaasin kanssa on yleisimmin kytetty sitraattipuskuria66 mutta

mys fosfaatti-12, 21 tartraatti-11, 91 ja asetaattipuskureja29, 92 on kytetty. Fosfaattipuskurilla

saavutettava pH-taso (5,78,0) on huomioitava sit kytettess ja puskurin pH:ta

laskettiinkin kirjallisuuden mukaisesti sitruunahapolla.12, 21

Tss tyss puskuriliuoksena kytettiin pasiassa pH 4.0:n sitruunahappopuskuria, mutta

mys saman pH:n fosfaatti-sitraattipuskurin toimivuutta kokeiltiin. Edelleen testattiin

synteesin toimivuutta fosfaattipuskurin pH-tason alarajalla (5,8) ja sen vaikutusta

kemiallisen reaktion mrn.

31

5.3 Synteesit hapetetulla raffinoosilla

5.3.1 Reaktiot natriumsyanidilla

Alkuvalmisteluina turvotettiin -glukosidaasi entsyymi, jotta se oli aktiivista heti

reaktioseokseen pipetoitaessa. -glukosidaasia punnittiin Eppendorf-putkeen, johon

listtiin natriumsitraattipuskuria (pH 4,0) siten, ett liuoksen puskurikonsentraatio oli

reaktioseoksessa noin 40 mmol. Entsyymin annettiin turvota putkessa 20 minuutin ajan. -

glukosidaasilla tehdyiss reaktioissa liuoksen vri oli keltainen tai kellertv.

Kaksikaulakolviin, jossa oli magneettisekoitus, pipetoitiin hapetettua raffinoosiliuosta

(esim. 0,34 mmol). Kolviin listtiin joko 0,1 M natriumsitraattipuskurissa turvotettua -

glukosidaasia (esim. 55 U) tai (R)-oksinitrilaasia (esim. 106 U) sek punnittu,

sitruunahappoon (pH 4,0) liuotettu natriumsyanidi (NaCN, esim. 2 mmol). Liuoksen

natriumsitraattikonsentraatio oli tllin 48 mM (taulukko 2.). Lisysten jlkeen tarkistettiin

liuoksen pH ja sdettiin se neljksi sitruunahapon avulla. Kolviin liitettiin

vetysyanidipoisto, joka johdettiin letkun kautta suppilolla laimeaan NaOH -liuokseen.

Tllin reaktioseoksesta mahdollisesti kaasumaisena vapautuva vetysyanidi ji

emsliuokseen. Tt vetysyanidin talteenottoa kytettiin kaikissa kokeissa.

Taulukko 2. Reaktiot hapetetulla raffinoosiliuoksella (Raf), jossa vetysyanidia vapauttavana reagenssina oli natriumsyanidi (NaCN). Puskurina kytettiin natriumsitraattia pH 4,0.

Koe n (Raf) [mmol]

-glukosi-daasi [U]

n (NaCN) [mmol]

Oksi-nitrilaasi

[U]

Puskuri-konsen-traatio [mM]

RAFCN 1 0,34 55 2 48

RAFCN 2 0,34 110 4 40

RAFCN 7 0,17 106 1 40

RAFCN 6 0,17 1 106 40

32

Reaktio suoritettiin huoneenlmptilassa, ilman erillist jhdytyst. Seoksesta otettiin

nytteit 0-24 h reaktioajoilla. Nytteet (esim. 0,08 mmol gal) saostettiin etanoli-vesi -

liuoksella (3:1), sentrifugoitiin 13400 rpm, 5 min. Supernatantti dekantoitiin pois, sakka

pestiin vedell ja nyte saostettiin uudelleen etanoli-vesi -liuoksella. Nytteet pelkistettiin

NaBD4:lla (esim. 0,2 mmol) yli yn, ja saostettiin kuten edell. Vaihtoehtoisesti nytteet

pelkistettiin ensin NaBD4:lla, jonka jlkeen suoritettiin vastaava saostus ja pesu kuin edell

ennen pelkistyst. Saatu tuote jatkoksiteltiin kohdan 5.5. mukaisesti.

5.3.2 Reaktiot etyylisyanoformaatilla

Kolviin pipetoitiin hapetettua raffinoosiliuosta (esim. 0,10 mmol), listtiin

natriumsitraattipuskuria (pH 3,3 tai 4,0) siten, ett liuoksen puskurikonsentraatio oli 10 tai

40 mM (taulukko 3). Vaihtoehtoisesti kytettiin fosfaattisitraattipuskuria. Seokseen listtiin

natriumsitraattipuskurissa turvotettua -glukosidaasia (esim. 57 U) tai mantelista perisin

olevaa oksinitrilaasia (esim. 53 U) sek etyylisyanoformaattia (NCCOOEt, esim. 0,42

mmol), (taulukko 3.). Etyylisyanoformaatti ei liuennut vesi- puskuri -liuokseen, joten

NCCOOEt:in reaktiivisuutta parannettiin pienentmll sen pisarakokoa. Pisara hajotettiin

sekoitusta hetkellisesti nopeuttamalla, jolloin seokseen muodostui useita mikropisaroita.

Nin saavutettiin suurempi reaktiivinen pinta-ala, joka lissi reaktiivisuutta.

Reaktiot toteutettiin huoneenlmptilassa magneettisekoituksella. Nytteidenotto- ja

reaktioaika oli 0,5-25 tuntia. Nytteet pelkistettiin analyysimenetelmn vaatimusten

mukaisesti joko NaBD4:lla tai NaBH4:ll yli yn. Nytteet saostettiin etanoli-vesiliuoksella

(6:1-8:1), sentrifugoitiin ja pestiin kuten kohdassa 5.5.

33

Taulukko 3. Hapetetulla raffinoosiliuoksella (Raf) tehtyj kokeita, jossa vetysyanidilhteen toimi etyylisyanoformaatti (NCCOOEt).

Koe n (Raf) [mmol]

-glukosi-

daasi [U]

n (NCCOOEt)

[mmol]

Oksi-nitrilaasi

[U]

Natrium-sitraatti-puskuri [mM]

Fosfaatti-sitraatti- puskuri [mM]

RAFCN 9 0,10 57 0,42

40

RAFCN 3 0,34 1,2 106 10

RAFCN 8 0,17 0,84 53 40

RAFCN 14 0,17 0,84 53 40

RAFCN 14_II 0,50 2,5 160 40

RAFLituCN 0,20 0,84 54a 40

a Rekombinanttitekniikalla tuotettu, lituruohosta perisin oleva oksinitrilaasi, AtHNL (taulukko 1. s. 15).

5.3.3 Kemiallisen reaktion tutkiminen

Kemiallisessa reaktiossa muodostuvien syanohydriinien mr rajoitetaan pitmll

reaktion pH mahdollisimman alhaisena. Tss tyss reaktiot suoritettiin suurimmaksi

osaksi pH 4:ss, jossa entsyymin toiminta olisi kohtalaista ja kemiallinen reaktio olisi ollut

vhist. Kemiallista reaktiota tutkittiin seuraamalla etyylisyanoformaatin ja

raffinoosialdehydin vlist reaktiota puskuriolosuhteissa. Tutkittiin lisksi pelkn puskurin

vaikutusta hapetettuun raffinoosiliuokseen (taulukko 4).

Hapetettua raffinoosiliuosta (esim. 0,17 mmol), natriumsitraatti- tai fosfaatti-

sitraattipuskuria (pH 4,0) ja etyylisyanoformaattia (esim. 0,84 mmol) sekoitettiin

huoneenlmptilassa 1-19 tunnin ajan. Liuoksen puskurikonsentraatio oli 40 mM.

Seoksesta otetut nytteet pelkistettiin NaBD4:lla. Pelkistetty nyte saostettiin etanolilla

(1:3-1:6). Nyte sentrifugoitiin 13400 rpm, 10 min. Supernatantti kaadettiin pois ja nyte

pestiin vedell, toistettiin saostus ja sentrifugointi. Nytteet ksiteltiin kohdan 5.5

mukaisesti.

34

Taulukko 4. Kemiallisen reaktion tutkiminen pH 4,0:ssa.

Koe n (Raf) [mmol]

n (NCCOOEt)

[mmol]

Natrium-sitraatti-puskuri [mM]

Fosfaatti-sitraatti- puskuri [mM]

RAFCN 0 0,17 0,84 40

RAFCN0_2 0,10 40

RAFCN 15 0,10 0,42 40

5.3.4 Reaktiot korkeammassa pH:ssa

Tutkittiin pH:n vaikutusta reaktioon, tutkittiin mys vastaava reaktionolla kemiallisen

reaktion vertaamiseksi korkeammassa pH:ssa.

Hapetettuun raffinoosiliuokseen (0,17 mmol) listtiin natriumsitraatti- tai

natriumvetyfosfaattipuskuri. Puskurien pH-arvot olivat 5,8 ja reaktiossa reaktioseoksen pH

sdettiin 5,95 vastaavan puskurin happo- tai emsmuodolla. Reaktioseoksen

puskurikonsentraatio oli 40 mM. Seokseen listtiin oksinitrilaasientsyymi (53 U) sek

etyylisyanoformaatti (0,84 mmol), (taulukko 5.). Reaktio- ja nytteidenottoaika oli 1-4

tuntia. Nytteet pelkistettiin NaBH4:ll yn yli, saostettiin etanolilla (1:8) ja pestiin kuten

edell kohdassa 5.5.

Taulukko 5. Hapetetun raffinoosiliuoksen kokeet pH 5,95:ss.

Koe n (Raf) [mmol]

Oksi-nitrilaasi

[U]

n (NCCOOEt)

[mmol]

Natrium-sitraatti-puskuri [mM]

Natrium-vetyfosfaatti-

puskuri [mM]

RAFCN 10 0,17 53 0,84 40

RAFCN 11 0,17 53 0,84 40

RAFCN 13 0,10 0,42 40

35

5.4 Synteesit hapetetulla guarkumilla

Reaktion toimivuutta tutkittiin hapetetulla guarkumiliuoksella. Lisksi reaktiota tutkittiin

hapetetulla, pilkottua guarkumia (molekyylipaino noin 50 000 g/mol, GM50) sisltvll,

liuoksella. Selvitettiin lisksi reagenssien mrn vaikutusta tulokseen.

Hapetettuun guarkumiliuokseen (esim. 0,1 mmol gal) listtiin oksinitrilaasia (esim. 38 U)

tai natriumsitraattipuskurissa turvotettua -glukosidaasia (40 U). Liuokseen listtiin joko

sitruunahappoliuokseen (pH 4,0) liuotettua NaCN (0,45 mmol) tai etyylisyanoformaattia

(esim. 0,56 mmol), sek natriumsitraattipuskuria (pH 4,0). Liuoksen puskurikonsentraatio

oli 40 mM tai 160 mM (taulukko 6.).

Taulukko 6. Hapetetulla guarkumilla suoritetut kokeet. GG_kem = kemiallisen reaktion tutkiminen, GG_oxCN ja GuarCN 1 ja 2 ovat guarkumiliuoksien koodeja, GuarCN_R = rekombinanttitekniikalla tuotetun entsyymin AtHNL merkint, GM50_oxCN ja CN2 ovat pilkotun guarkumin (M =50 000 g/mol) koodeja, n(Gal) on reaktioseoksen sisltm laskennallinen galaktoosin ainemr.

Koe n (Gal) [mmol]

-glukosi-

daasi [U]

Oksi-nitrilaasi

[U]

n (NaCN) [mmol]

n (NCCOOEt)

[mmol]

Natrium-sitraatti-puskuri [mM]

GG_kem. 0,02 0,11 40

GG_oxCN 0,10 40 0,45 160

GuarCN 1 0,10 38,0 0,56 40

GuarCN 2 0,10 76,0 1,12 40

GuarCN_R 0,10 38,0a 0,56 40

GM50_oxCN 0,04 15,2 0,22 40

GM50_oxCN 2 0,04 30,4 0,44 40

a Rekombinanttitekniikalla tuotettu, lituruohosta perisin oleva oksinitrilaasi, AtHNL (taulukko 1. s.15).

36

Reaktio- ja nytteenottoaika oli 1-24 tuntia. Nytteet (0,007-0,010 mmol gal) joko

pelkistettiin heti NaBD4:lla (0,03-0,07 mmol) yn yli ja pelkistettiin seuraavana pivn tai

vaihtoehtoisesti saostettiin ennen pelkistyst. Nytteet saostettiin etanolilla (1:1-1:3),

sentrifugoitiin 13000 rpm 5 min, dekantoitiin supernatantti pois ja pestiin etanoli-

vesiseoksella (1:1-3:1). Toistettiin sentrifugointi ja dekantointi. Nytteet jatkoksiteltiin

kohdan 5.5. mukaisesti.

5.5 Nytteiden ksittely

5.5.1 GC-MS nytteiden valmistaminen

5.5.1.1 Pelkistminen

Hapetetuista sakkaridiliuoksista, tai vaihtoehtoisesti syanohydriinien synteeseist, otetut

nytteet pelkistettiin NaBD4:ll. Tllin lhtaineen raffinoosin tai guarkumin galaktoosin

C-6- asemassa ollut hapettunut aldehydi pelkistyi deuteroiduksi alkoholiksi. Nytteisiin

listtiin kolmea galaktoosiekvivalenttia vastaava mr NaBD4:a, jonka annettiin reagoida

yn yli huoneenlmptilassa magneettisekoituksella. Nytteet saostettiin etanolilla (1:1-

1:8) ja sentrifugoitiin 5 tai 10 min 13400 rpm. Supernatantti dekantoitiin pois ja sakka (5-

10 mg) siirrettiin prynkolviin.

5.5.1.2 Hapan metanolyysi ja silylointi

Reaktioseoksista otetut pelkistetyt ja saostetut nytteet kuivattiin veden poistamiseksi

prynkolvissa vakuumiuunissa +40 C, 30120 min, 0 bar. Nytteet hydrolysoitiin

happamalla metanolyysill, jolloin sokerimolekyyleist muodostettiin metyylieettereit.

Tllin tutkittavana olleen polysakkaridin terminaalinen galaktoosiyksikk saatiin erilleen

ja metyloitua 1-asemassa olleen hiilen hydroksyylistn.93-95. Edelleen nyte silyloitiin,

jotta saatiin muodostettua haihtuva, GC-MS:ll analysoitava monomeeri. Silyloinnissa

galaktoosin ja muidenkin liuoksessa olevien sokereiden vapaat hydroksyyliryhmt

derivatisoitiin trimetyylisilyylieettereiksi (kuva 18.).93, 94

37

Kuva 18. NaBD4:ll pelkistetyn guarkumin metanolyysi ja silylointi kaavamaisesti esitettyn. Kuvassa olevat rakenteet ovat esitetty esimerkinomaisesti, sill metanolyysiss voi muodostua useita eri sokerirakenteita.93, 95

Kuivuneisiin nytteisiin listtiin 2 ml vedetnt, 2M hapanta metanolia (HCl/MeOH),

korkki suljettiin tiukasti kiinni ja kolvi laitettiin lmpkaappiin 100 C, 3h. Nytteiden

annettiin jhty, mahdollinen jljelle jnyt happo neutraloitiin 100 l:lla pyridiini.

Liuos siirrettiin mitta-asteikolliseen muoviputkeen ja kolvi huuhdeltiin metanolilla, kunnes

liuoksen tilavuus vastasi 1 mg/ml pitoisuutta. Lopputilavuus oli nin ollen 5-10 ml.93

Tst otettiin edelleen 1 ml lasiseen koeputkeen silylointia varten. Liuos haihdutettiin

koeputkesta typpivirralla 50 C:ssa, johon listtiin silylointireagenssit: pyridiini (py, 180

l), heksametyylidisiloksaani (HMDS, 60 l) ja trimetyylikloorisilaani (TMCS, 20 l).

Tarvittavan silylointireagenssin mrn muuttuessa, olivat aineiden suhteelliset tilavuudet

kuitenkin 9:3:1 (py, HMDS, TMCS).96 Koeputki suljettiin kierrekorkilla ja liuokset

vorteksoitiin. Putki siirrettiin uuniin 60 C puolen tunnin ajaksi, jonka jlkeen nyte

haihdutettiin jlleen typpivirralla 50 C kuivaksi (20 min). Koeputkeen pipetoitiin 1 ml

heptaania ja vorteksoitiin. Saatu liuos suodatettiin Pall 0,45 l ruiskusuodattimen lpi

38

nytteensyttjn lasiastiaan (vialiin) joka suljettiin korkilla. Nyte analysoitiin GC-

MS:ll.94

5.5.2 NMR- ja MS- nytteiden valmistaminen

NMR- ja LC-MS/MS- analyysi varten nyte pelkistettiin reagoimattoman aldehydin

poistamiseksi NaBH4:ll, saostettiin etanolilla (1:5) ja sentrifugoitiin 8500 rpm, 10

minuutin ajan. Nyte pestiin vedell ja saostettiin uudelleen. Sakka liuotettiin pieneen

mrn ultrapuhdasta vett, jdytettiin pakastimessa (-22 C) ja kuivattiin

pakkaskuivaimessa noin 20 tunnin ajan.

Muodostuneesta hienojakoisesta jauheesta punnittiin noin 20 mg NMR-nyteeksi

eppendorf-putkeen. Jauhe liuotettiin 1,0 ml:aan deuteroitua vett (D2O) ja suodatettiin Pall

0,45 m ruiskusuodattimen lpi NMR- putkeen.

LC-MS/MS -analyysi varten valmistettiin kuivatusta jauheesta 1 mg/ml pitoisuustasolla

oleva liuos ultrapuhtaaseen veteen.

5.6 Muita kokeita

5.6.1 Saostus

Yleisesti ottaen oligosakkaridit saostuvat noin 60 % etanoliliuoksella.97, 98 Kokeissa

raffinoosiperisten nytteiden saostuksessa oli hankaluuksia, sill kytetty noin 70 % (3:1,

v/v) etanoliliuos ei saostanut synteesist otettuja nytteit ja todettiin tarvittavan etanolin

mrn olevan jopa 8:1 veteen nhden. Polysakkarideilla tt saostusongelmaa ei ollut.

Puskuriolosuhteet vaikuttivat saostumiseen. Fosfaattisitraattipuskurilla nytteist

saostuneen sakan mr oli hyvin pieni, kun taas natriumsitraattipuskurilla sakka oli

selkesti suurempi. Tm voi johtua sitraattipuskurin suuresta sitruunahappomrst, sill

se liukenee etanoliin, joka taas aiheutti suuremman sakan nytteenksittelyss.

Fosfaattisitraattipuskurissa sitruunahappoa listtiin ainoastaan pH:n stn, jolloin sen

mr puskurissa oli suhteellisen pieni.

39

5.6.1.1 Puhdistuskokeet

Nytteiden sisltm sitruunahappoa yritettiin poistaa kokeilumuotoisesti Dowex 200

kationinvaihtohartsilla sek DP-10 suolanpoistopylvll. Dowex-hartsilla saatiin

erottumaan kaksi fraktiota UV-signaaliin perustuen, mutta fraktiot sislsivt edelleen

puskurin komponentteja. Sephadex-matriisilla tytetty DP-10 suolanpoistopylvn

todettiin kapasiteetiltaan liian pieneksi, jotta puskurin ja tuotteen samankaltaisesti

kyttytyvt molekyylit olisi saatu erilleen toisistaan.

5.6.2 Jtteiden hvitys

Reaktiossa kytettiin joko natriumsyanidia tai etyylisyanoformaattia jolloin vapautui

vetysyanidia. Tst syyst kaikki tyss muodostuneet pesuliuokset ja jljelle jneet

reagenssit, joihin olisi mahdollisesti jnyt syanidia, ksiteltiin vaarattomaksi.

Liuosten maksimaalinen syanidimr arvioitiin mahdollisimman tarkasti. Isoon

dekantterilasiin sdettiin magneettisekoitus ja seos laimennettiin syaniditasolle 1 mg/ml ja

sen pH sdettiin NaOH:lla noin yhdeksitoista. Thn liuokseen listtiin 72 l 1015 % -

natriumhypokloriittia yht syanidimilligrammaa kohden. Sekoitusta jatkettiin 0,5-1 tunnin

ajan. pH:n tarkistettiin olevan 10 ja seokseen listtiin 2 M HCl pieniss eriss, kunnes pH

oli 7-8. Liuosta seisotettiin vhintn tunnin ajan (yleens yli yn), jonka jlkeen se

kaadettiin viemriin runsaan veden kera.99

40

5.7 Analysointi

5.7.1 GC-MS analyysi

Nytteet analysoitiin Hewlett-Packard 5890 kaasukromatografilla (GC), johon oli liitetty

saman valmistajan 5972 massaspektrometri (MS). Kolonnina kytettiin DB-5-tyypin

kolonnia, jossa on 5 % fenyyliryhmi metyylipolysiloksaanifaasissa. Kolonnin pituus oli

30 m, sishalkaisija 0,32 mm, sek stationrifaasin paksuus 0,25 m. Tmn tyyppiset

kolonnit ovat poolittomia, monikyttisi ns. yleiskolonneja, jotka kestvt korkeitakin

lmptiloja.

Nytteen injektiotilavuus oli 1 l, kolonnin kantajakaasuna kytettiin heliumia, jonka

virtaus oli 1,1 ml/min. Nytteen jakosuhde oli 1:10 sek huuhteluventtiilin virtaus 3

ml/min. Kolonnin alkupn paine oli 15 psi ja injektorin lmptila 250 C.

Kaasukromatografin ajo-ohjelma oli seuraavanlainen:

Uunin lmptila 120 C (5 min) - 3 C/min, 180 C - 15 C/min, 250 C (5 min).

Kokonaisajoaika oli 32,67 min.

5.7.1.1 Lhtaineiden hapetusasteen mrittminen

Hapetettujen guarkumi- ja raffinoosiliuosten hapetusaste mritettiin, jotta voitiin tarkistaa

reaktion onnistuminen. Hapetusaste vaikutti mys jatkoreaktioiden saannon arvioimiseen.

Nytteen kaasukromatografisesta kromatogrammista haettiin galaktoosin piikki standardin

retentioajan perusteella. Tmn piikin massaspektrin ionien m/z 361 ja m/z 362

intensiteettien avulla saatiin laskettua tuotteen hapetusaste (kaava 1).74

Kaava (1)

Kaavassa 1. A= m/z 361 intensiteetti ja B= m/z 362 intensiteetti.

41

Kuva 19. Hapetetun guarkumin kromatogrammin piikin tr 19,544 min spektrin osa, jossa ovat tutkittavat ionit A m/z 361 ja B m/z 362, sek niiden intensiteetit (A =3284 ja B = 5748).

Kaavan (1) avulla saadaan kuvan 19. tuloksista laskettua guarkumin hapetusasteeksi

58,6%. Lhtaineiden hapetusasteiden tulokset on esitetty taulukossa 7 sivulla 43.

5.7.2 Massaspektrometrinen analyysi

Massaspektrometrinen (MS) analyysi tehtiin Agilent 6330 Ion Trap LC/MS -laitteella,

jossa ionisointimenetelmn oli shksumutusionisaatio (ESI), (Agilent Technology, Palo

Alto, USA).

Massaspektrometrist analyysi varten nytett tai raffinoosiliuosta (1 mg/ml) pipetoitiin

3-5 l 400 l:aan metanoli-vesi-muurahaishappoliuosta (50:49:1). Lisksi varauksellisten

adduktien muodostamiseksi nytteisiin pipetoitiin apuaineita (1-3 l). Positiivisten ionien

muodostamiseen litiumasetaattia (10 mg/ml) ja negatiivisten ionien aikaansaamiseksi

ammoniumkloridia (10 mg/ml). Nytteen virtausnopeus shksumutusionisaatioyksikkn

oli 7 ml/min. Nytteet analysoitiin pasiassa positiivisella ionisaatiolla, mutta yksi nyte

tutkittiin kokeeksi mys negatiivisella ionisaatiolla.

42

5.7.3 NMR analyysi

NMR analyysit tehtiin Varian NMR-spektometreill kytten joko 300, 500 tai 600

MHz:in laitetta. Nytteist mitattiin sek 1H- ett 13C NMR spektrit 27 C:n lmptilassa.

Vertailuksi NMR:ll analysoitiin reaktiossa kytetty D-(+)-raffinoosi pentahydraatti tai

puskurissa kytetty sitruunahappo.

NMR-analyysit tehtiin deuteroidussa vedess (D2O) ilman kemiallisen siirtymn

referenssi, joka D2O- liuoksilla on tyypillisesti asetoni tai 4,4-dimetyyli-4-silapentaani-1-

sulfonihappo (DSS).100 Nin ollen spektrien ppm-asteikkoa ei voitu asettaa kohdalleen ns.

tunnettujen kemiallisten siirtymien avulla, vaan nollakohta mritettiin laskennallisesti

kytten liuottimen deuteriumsignaalin taajuutta.

5.8 Tulokset

5.8.1 Lhtaineiden hapetusasteet

Reaktion onnistumista seurattiin pelkistmll tuote NaBD4:ll jolloin aldehydist

muodostui deuteroitualkoholi. Tmn jlkeen tuote metanolysoitiin ja silyloitiin

kromatografista analyysi varten. Kaasukromatografisessa analyysiss havaittiin

galaktopyranoosin piikki, galaktoosille tyypillisell retentioajalla (tr) noin 19,55 min.

Piikin massajakaumasta voitiin havaita muodostetun, silyloidun d1-metyyli--D-

galaktopyranosidin ioni, jonka massaluku 362 eroaa yhdell massayksikll

hapettumattoman, silyloidun, metyyli--D-galaktopyranosidin massasta 361 (Kuva 20.).74,

96

Kuva 20. Vasemmalla d1-metyyli--D-galaktopyranosidin ja oikealla metyyli--D-galaktopyranosidin massaspektrometrist tulosta vastaavat rakenteet.74

43

Taulukko 7. Lhtaineiden hapetusasteet. GG=guarkumi, RAF= raffinoosi, GM50 = pilkottu guarkumi ja RAF ox =50 mg/ml raffinoosi.

Lhtaine Pitoisuus [mg/ml] Hapetusaste

[%]

GG_1 1 67

RAF_1 21 100

GM50 5 97

RAF ox 42 100

5.8.2 Syanohydriinit

5.8.2.1 GC-MS analyysin tulokset

Menetelm, jossa tutkitaan tietyn kromatografisen piikin massaspektrin yht tai kahta ionia

vaatii kohtalaisen vahvat nytteet. Tst syyst nytteiden kromatogrammit eivt tss

tyss edustaneet ns. kaunista muotoa, vaan piikit levenivt, jotta massaspektriss nkyi

tarpeeksi intensiivinen ioni.

Kromatografisen erotuksen varmistamiseksi analysoitiin standardeina D-(+)-mannoosi

(Man), D-(+)-glukoosi (Glc) ja D-(+)-galaktoosi (Gal), jotka metanolysoitiin ja silyloitiin,

kuten nytteet yleens (kohta 5.5.). Nin saatiin varmistettua kromatogrammissa olevien

piikkien retentioajat (taulukko 8.), sek kyseisten aineiden massaspektrit. Lisksi

analysoitiin hapetettu, pelkistetty raffinoosi ja guarkumi.

Jokaisen kokeen kaikki nytteet metanolysoitiin, silyloitiin ja analysoitiin GC-MS:ll.

Onnistuneissa kokeissa havaittiin kromatogrammin muuttuneen raffinoosin

kromatogrammista (kuva 21.) siten, ett galaktoosin signaalit retentioajoilla (tr) 18,6, 19,6

ja 20,6 min olivat pienentyneet tai jopa hvinneet kokonaan. Lisksi kromatogrammiin

muodostui uusia, kohtalaisen suuria signaaleja retentioajoilla 6,3, 9,3, 26,2, 26,6 ja 26,8

minuuttia. (kuvat 22 ja 23). Nist 6,3 ja 9,3 min eluoituvat yhdisteet olivat massaspektrien

mukaan puskurin sisltmi sitruunahapon ja natriumsitraatin silyloituja muotoja.

44

Taulukko 8. GC-MS:ll analysoitujen standardien retentioajat minuutteina. tr = retentioaika [min], man = mannosi, gal = galaktoosi, glc = glukoosi, raf = raffinoosi ja guar = guarkumi. Guarkumistandardi analysoitiin ensimmisen, jonka jlkeen kolonnin alkupst poistettiin pieni pala, tst syyst mannoosi- ja galaktoosistandardien retentioajat eroavat hiukan guarkumin ajoista.

tr 1 tr 2 tr 3 tr 4 tr 5 tr 6

Man 18,03

Gal 18,59 19,62 20,60

Glc 21,39 22,06

Raf 18,57 19,58 20,58 21,39 22,05

Guar 18,15 18,52 19,56 20,52

Kuva 21. Raffinoosin kromatogrammi. Galaktoosin signaaleja ovat 18,57, 19,58 ja 20,58 min eluoituvat piikit ja glukoosin vastaavasti 21,39 ja 22,05 min.

45

Hapetettun raffinoosin syanohydriinisyntetisointi aloitettiin 24 tunnin reaktioajalla, josta

otettiin muutamia nytteit reaktioajan optimoimista varten. Neljn ja kuuden tunnin

reaktioajoilla ei ollut merkittv eroa tuloksissa, mutta 24 h reaktioajalla

kromatogrammin oletetut tuotepiikit retentioajoilla 26,2 ja 26,5 min pienenivt.

Seuraavaksi otettiin 0-4 tunnin ajanjakso, jonka aikana nytteit otettiin 0,5 tunnin vlein.

Tuloksena oli reaktioaikaoptimi 1,52,0 tuntia, jonka kohdalla tuotteiden piikit olivat

maksimissaan.

Kuva 22. Nytteen (RAFCN 5, 2,5 h) kromatogrammi. Galaktoosin piikit tr 18,50 ja 19,50 min ovat pienentyneet huomattavasti. Glukoosin piikit ovat edelleen paikallaan tr 21,29 ja 21,97 min, tr 26,14 min jlkeen eluoituu useita eri yhdisteit.

Tutkittaessa nytteiden kromatogrammeja voitiin todeta ajon loppupuolella eluoituneiden

piikkien olevan sokeriyhdisteit. Johtoptksen oli se, ett joku tai jotkut nist suurista

tr 2627 min eluoituneista yhdisteist olisi voinut olla synteesiss muodostunut toivottu

tuote.

46

Kuva 23. Nytteen kromatogrammi (RAFCN 7, 2 h). Galaktoosin piikit tr 18,50 ja 19,50 min ovat pienentyneet niin pieniksi, etteivt integroituneet. tr 26,2, 26,5 ja 26,7 min eluoituvat mahdollisen tuotteen piikit.

Kuva 24. Nytteen (RAFCN 4, 4 h) kromatogrammin tr 26,5 min eluoituneen piikin massaspektri.

47

Nytteiden massaspektrit noudattavat sokerimolekyyleille tyypillist pilkkoutumisspektri.

Esimerkiksi galaktoosistandardin tr 19,53 min spektrin suurimpien intensiteettien ionit

ovat: 217, 204, 147, 133 ja 73 aivan kuten kuvassa 25.96

Tutkittaessa tarkemmin reaktiossa selvsti muodostuneiden yhdisteiden tr 26,2 ja 26,5 min

massaspektrej (kuva 24.), lytyi jlkimmisest mielenkiintoinen tulos: ionit 509 ja 525;

niiden molekyylimassat ovat suuremmat kuin oletetun synteesituotteen molekyylimassa

507 olisi ollut (kuva 25.). Nin ollen ptettiin tehd MS- ja NMR -analyysi samalla lailla

tehdylle nytteelle.

Kuva 25. GC-MS analyysi varten metyloitu ja silyloitu synteesituote ja sen oletettu rakenne.

Raffinoosialdehydin muuttumista tuotteeksi tutkittiin suhteellisena osuutena glukoosin

piikkien (tr 21,40 ja 22,06 min) pinta-alasta (taulukko 9.). Oletuksena oli, ett glukoosi ei

reagoi reaktio-olosuhteissa, sill se on raffinoosissa galaktoosin ja fruktoosin vliss, eik

sisll sellaista reaktiivista ryhm, joka olisi voinut reagoida kyttmissmme reaktio-

olosuhteissa. Tllin sen osuus nytepiikeist pysyy vakiona analyysimenetelmn

vaihteluvlin puitteissa. Analysoinnissa kytettiin automaattista integrointia. Lhes

kaikissa analyyseiss glukoosin piikki oli kromatogrammin suurin. Galaktoosin kahden

isomeerin piikkien pinta-alat olivat keskimrin 147,6 % ( 1,6 %) nytteiden

kokonaispinta-aloista.

48

Kytetyll menetelmll ei toistaiseksi voida laskea saantoprosenttia, sill menetelmn ei

ole olemassa sellaista standardia, joka kestisi happaman metanolyysin. Menetelmss

olisi voitu kytt sorbitolia ulkoisena standardina. Sen kytt ei koettu tarpeelliseksi,

sill tss tyss arvioitiin lhinn entsymaattisen reaktion onnistumista. Tt voitiin

arvioida yhtlailla glukoosin avulla.

Tuotteen muodostumista aldehydist arvioitiin lhtaineen galaktoosin piikin pinta-alan

avulla. Hapetetulla raffinoosilla galaktoosin piikki on noin 128 % ja glukoosin vastaavasti

148 %, jolloin pinta-alojen suhde on natriumsitraattipuskurissa tehdyill reaktioilla noin 86

%. Nin ollen kromatogrammissa olevien tuotteen piikkien ja glukoosin piikkien pinta-

alojen maksimaalinen suhdeluku voi olla saman verran (86 %). Tm vastaisi 100 %

muuttumista lhtaineesta tuotteeksi. Vastaavasti sitraattifosfaattipuskurissa tehtyjen

reaktioiden maksimaalinen konversio on noin 70 %.

Konversiota arvioitiin tuotteen ja glukoosin pinta-alojen suhteena. Tulos esitetn

muuttumisena maksimikonversioista (kaava 2.).

(Kaava 2.)

Kaavassa 2. K = konversio, P = tuotteen prosentuaalinen yhteenlaskettu pinta-ala, S = lhtaineen prosentuaalinen yhteenlaskettu pinta-ala. Esimerkkilaskuna kaavan 2 mukaisesti laskettu, fosfaattisitraattipuskurilla tehdyn reaktion,

konversioprosentti:

49

Taulukko 9. Sitraattipuskurissa (pH 4,0) tehtyjen reaktioiden konversioprosentit. Glukoosi (glc), galaktoosi (gal), Gal/Glc suhde sek konversioprosentti. Luvut kohdissa glc, gal ja tuote esitetn kromatogramissa esiintyvien ko. yhdisteen piikkien yhteenlaskettujen pinta-alojen prosentuaalisina osuuksina. Konversio on laskettu kaavan 2 mukaisesti.

Reaktio Glc [%] Gal [%] Gal/Glc [%] Tuote [%] Konversio

[%]

Hapetettu raffinoosi (Raf) 148,8 128,1 86,1 - -

Kemiallinen reaktio (Raf 0) 148,7 51,4 34,6 44,7 34,9

RafCN 8 146,3 20,9 14,3 40,5 32,1

RafCN 9 149,9 75,0 50,0 33,2 25,7

RafCN 10 145,9 59,5 40,8 34,9 27,8

RafCN 11 148,7 64,8 43,6 46,0 35,9

RafCN 12 147,2 43,2 29,4 20,9 16,5

Nollanytteen konversio tuotteeksi on 1035 % hapetetun raffinoosin metanolysoidusta ja

silyloidusta galaktoosin piikist. Sitraattipuskurilla tehtyjen synteesituotteiden konversio

ji pienemmksi kuin pelkn kemiallisen reaktion muodostama konversio (Taulukko 9.).

Paras saatiin pitkll reaktioajalla (1920 h), fosfaattisitraattipuskurissa, pH 4,0 tehdyss

kokeessa. Tllin kemiallisen reaktion osuus ji pieneksi, kun vastaavassa pH 6,0 tehdyss

reaktiossa kemiallinen reaktio tuotti 50 % konversion (Taulukko 10.).