JAVNA RASPRAVA O TEMI DOKTORSKE DISERTACIJE JAVNA RASPRAVA O TEMI DOKTORSKE DISERTACIJE Ki-67, p16INK4a i DNA ploidija u Ki-67, p16INK4a i DNA ploidija u cervikalnim cervikalnim prekanceroznim lezijama – usporedba prekanceroznim lezijama – usporedba s histološkim nalazom i HPV statusom s histološkim nalazom i HPV statusom Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med.
44
Embed
Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med.
JAVNA RASPRAVA O TEMI DOKTORSKE DISERTACIJE Ki-67, p16INK4a i DNA ploidija u cervikalnim prekanceroznim lezijama – usporedba s histološkim nalazom i HPV statusom. Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med. RAK VRATA MATERNICE. - PowerPoint PPT Presentation
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
JAVNA RASPRAVA O TEMI DOKTORSKE DISERTACIJEJAVNA RASPRAVA O TEMI DOKTORSKE DISERTACIJE
Ki-67, p16INK4a i DNA ploidija u cervikalnim Ki-67, p16INK4a i DNA ploidija u cervikalnim prekanceroznim lezijama – usporedba s prekanceroznim lezijama – usporedba s
histološkim nalazom i HPV statusomhistološkim nalazom i HPV statusom
Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med.Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med.
Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med.Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med.
RAK VRATA MATERNICERAK VRATA MATERNICE
• godišnje 400 000 novooboljelih i 250 000 smrtnih slučajeva
• drugi po učestalosti maligni tumor kod žena
• pojavnost: - razvijene zemlje 10/100 000 (na 10. mjestu kod žena)
- zemlje u razvoju 19/100 000 (najčešći!)
- Hrvatska 13,7/100 000 (na 8. mjestu kod žena)
• poremećaj stanične poremećaj stanične zrelosti i orijentacije i zrelosti i orijentacije i
nuklearne atipijenuklearne atipije
• bojenje H-Ebojenje H-E
• klasifikacija s obzirom na klasifikacija s obzirom na debljinu zahvaćenog epiteladebljinu zahvaćenog epitela
• preinvazivne promjene i invazivni rak vrata preinvazivne promjene i invazivni rak vrata maternice su rezultat infekcije genitalnim humanim maternice su rezultat infekcije genitalnim humanim
papiloma virusompapiloma virusom
• HPV DNA se nalazi u 99,7% karcinoma vrata HPV DNA se nalazi u 99,7% karcinoma vrata maternice maternice
WalboomersWalboomers et al. et al. Human papillomavirus is a necessary cause of Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide.invasive cervical cancer worldwide. J Pathol 1999;189:12–9.J Pathol 1999;189:12–9.
• oko 40 različitih tipova humanog papiloma virusa oko 40 različitih tipova humanog papiloma virusa može inficirati spolni sustav žene može inficirati spolni sustav žene
• tipovi visokog onkogenog rizika su značajno tipovi visokog onkogenog rizika su značajno povezani s progresijom u invazivni rak vrata povezani s progresijom u invazivni rak vrata maternicematernice
• u tipove visokog rizika ubrajaju se HPV 16 i 18 i u tipove visokog rizika ubrajaju se HPV 16 i 18 i filogenetski s njima povezani tipovi: 31, 33, 35, 52, filogenetski s njima povezani tipovi: 31, 33, 35, 52, 58, odnosno 39, 45, 59, 6858, odnosno 39, 45, 59, 68
Bosch Bosch et al. et al. Prevalence of human papilPrevalence of human papillomavirus in cervical cancer: a lomavirus in cervical cancer: a worldwide perspective. J Natl Cancer Inst 1995;87:796–802.worldwide perspective. J Natl Cancer Inst 1995;87:796–802.
Chan Chan et alet al. Analysis of genomic sequences of 95 papillomavirus types: . Analysis of genomic sequences of 95 papillomavirus types: uniting typing, phylogeny, and taxonomy. J Virol 1995;69:3074–83.uniting typing, phylogeny, and taxonomy. J Virol 1995;69:3074–83.
• cirkularni dvolančani DNA genom od cirkularni dvolančani DNA genom od 7900 parova baza7900 parova baza
• 3 regije: - rana regija3 regije: - rana regija - kasna regija - kasna regija - regulatorna regija - regulatorna regija
• rana regija: E1, E2, E4, E5, E6 i E7 - rana regija: E1, E2, E4, E5, E6 i E7 - transkripcijske jedinice koje kodiraju transkripcijske jedinice koje kodiraju sintezu bjelančevina važnih za virusnu sintezu bjelančevina važnih za virusnu replikacijureplikaciju
• E6 i E7 daju šifru za sintezu E6 i E7 daju šifru za sintezu onkoproteina ključnih za kontrolu onkoproteina ključnih za kontrolu staničnog ciklusastaničnog ciklusa
• cirkularni dvolančani DNA genom od cirkularni dvolančani DNA genom od 7900 parova baza7900 parova baza
• 3 regije: - rana regija3 regije: - rana regija - kasna regija - kasna regija - regulatorna regija - regulatorna regija
• rana regija: E1, E2, E4, E5, E6 i E7 - rana regija: E1, E2, E4, E5, E6 i E7 - transkripcijske jedinice koje kodiraju transkripcijske jedinice koje kodiraju sintezu bjelančevina važnih za virusnu sintezu bjelančevina važnih za virusnu replikacijureplikaciju
• E6 i E7 daju šifru za sintezu E6 i E7 daju šifru za sintezu onkoproteina ključnih za kontrolu onkoproteina ključnih za kontrolu staničnog ciklusa staničnog ciklusa
• kasna regija: L1 i L2 - daju kod za kasna regija: L1 i L2 - daju kod za bjelančevine virusne kapsidebjelančevine virusne kapside
• p16INK4a - ekspresija je regulirana negativnom povratnom spregom od strane pRb
• inaktivacija pRb preko HPV E7 negativnom povratnom spregom dovodi do pojačanja djelovanja p16INK4a biomarker ekspresije HPV onkogena u stanicama
Agoff et al. Mod Pathol. 2003;16:665-73.Wang et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2004;13:1355-60.
CIN CIN Ki-67 Ki-67
• životni vijek normalnih stanica cervikalnog epitela: četiri do pet dana
• u displastičnom epitelu je izmjena stanica ubrzana (CIN 3 - 12 sati)
• Ki-67 antigen je biomarker stanične proliferacije
• stupanj proliferacije cervikalnog epitela određen imunohistokemijskim bojanjem s Ki-67 protutijelom korelira sa stupnjem cervikalne displazije
Kruse et al. J Pathol 2001;193:48-54. Agoff et al. Mod Pathol. 2003;16:665-73.
Zanotti et al. Gynecol Oncol 2003;89:376-84.
HPV HPV DNA DNA
onkogeni HPV tipovi
regulatorne i replikatorne promjene staničnog ciklusa
+genetska nestabilnost
DNA oštećenja aneuploidija
Hanselaar et al. DNA changes in progressive cervical intraepithelial neoplasia. Anal Cell Pathol 1992;4:315-24.
CIN CIN aneuploidija aneuploidija
• aneuploidije su povezane sa skvamoznim intraepitelnim lezijama (SIL) visokog stupnja i s integracijom HPV genoma
Rihet et al. J Clin Pathol 1996;49:892-6.
• aneuploidija se javlja u visokorizičnih HPV pozitivnih skvamoznih intraepitelnih lezija, dok se u niskorizičnih HPV pozitivnih SIL i u HPV negativnih SIL ne javlja
Bollmann et al. Cancer 2003;99:57-62.
• aneuploidija je rizični čimbenik za progresiju CIN-a 1 i 2 u CIN 3
Melsheimer et al. Cytometry 2001;46:166-71.
2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA
• patohistološka analiza cervikalne biopsije ovisi o subjektivnoj procjeni patologa i zbog toga je podložna greškama
• različiti imunohistokemijski biljezi bili su istraživani s obzirom na njihovu specifičnost da označe displastične ili neoplastične stanice
• aneuploidija se povezuje sa CIN-om visokog stupnja i progresijom intraepitelne lezije
2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA
• u nijednom dosadašnjem istraživanju nije istražena moguća korist od istovremenog određivanja Ki-67, p16INK4a i DNA aneuploidije
• u većini dosadašnjih istraživanja registrirana je samo prisutnost Ki-67 pozitivnih stanica u gornje 2/3 epitela točnije je kvantitativno određivanje tih stanica u odnosu na visinu epitela
Kruse et al. Ki-67 immunoquantitation in cervical intraepithelial neoplasia (CIN): a sensitive marker for grading. J Pathol 2001;193:48-54.
2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA
Preliminarni rezultati našeg istraživanja:
- značajne razlike u broju Ki-67 pozitivnih stanica izmeđurazličitih stupnjeva cervikalne displazije
0
10
20
30
40
50
60
70
UKUPNO/100 mikrometara
normalniCIN 1CIN 2CIN 3
2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA
Preliminarni rezultati našeg istraživanja:
- značajne razlike u učestalosti Ki-67 pozitivnih stanica u pojedinim trećinama cervikalnog epitela kod različitih stupnjeva displazije
0102030405060708090
100
% donja trećina % srednja trećina % gornja trećina
1. U ispitivanom materijalu utvrditi: a) prisutnost HPV-a visokog i niskog rizikab) imunohistokemijsku ekspresiju Ki-67 i p16INK4a proteinac) DNA ploidiju
3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA
1. U ispitivanom materijalu utvrditi: a) prisutnost HPV-a visokog i niskog rizikab) imunohistokemijsku ekspresiju Ki-67 i p16INK4a proteinac) DNA ploidiju
2. Utvrditi postoji li povezanost ekspresije Ki-67 i p16INK4a proteina i DNA ploidije s prisutnošću HPV-a, posebno za HPV visokog i niskog rizika
3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA
1. U ispitivanom materijalu utvrditi: a) prisutnost HPV-a visokog i niskog rizikab) imunohistokemijsku ekspresiju Ki-67 i p16INK4a proteinac) DNA ploidiju
2. Utvrditi postoji li povezanost ekspresije Ki-67 i p16INK4a proteina i DNA ploidije s prisutnošću HPV-a, posebno za HPV visokog i niskog rizika
3. Usporediti dijagnostičku vrijednost navedenih parametara u otkrivanju cervikalne intraepitelne neoplazije.
3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA
1. U ispitivanom materijalu utvrditi: a) prisutnost HPV-a visokog i niskog rizikab) imunohistokemijsku ekspresiju Ki-67 i p16INK4a proteinac) DNA ploidiju
2. Utvrditi postoji li povezanost ekspresije Ki-67 i p16INK4a proteina i DNA ploidije s prisutnošću HPV-a, posebno za HPV visokog i niskog rizika
3. Usporediti dijagnostičku vrijednost navedenih parametara u otkrivanju cervikalne intraepitelne neoplazije.
4. Utvrditi koji je nabolji pokazatelj prisustva CIN-a visokog stupnja.
3.CILJEVI ISTRAŽIVANJA3.CILJEVI ISTRAŽIVANJA
1. U ispitivanom materijalu utvrditi: a) prisutnost HPV-a visokog i niskog rizikab) imunohistokemijsku ekspresiju Ki-67 i p16INK4a proteinac) DNA ploidiju
2. Utvrditi postoji li povezanost ekspresije Ki-67 i p16INK4a proteina i DNA ploidije s prisutnošću HPV-a, posebno za HPV visokog i niskog rizika
3. Usporediti dijagnostičku vrijednost navedenih parametara u otkrivanju cervikalne intraepitelne neoplazije.
4. Utvrditi koji je nabolji pokazatelj prisustva CIN-a visokog stupnja.
5. Utvrditi da li se istovremenim određivanjem i kombinacijom različitih biljega mogu postići točniji rezultati u dijagnostici cervikalne intraepitelne neoplazije, odnosno u razdvajanju CIN-a 1 od CIN-a 2 i CIN-a 3
4. HIPOTEZA4. HIPOTEZA
očekujemo značajno veću učestalost HPV-a visokog rizika u umjerenih i teških displazija (CIN 2 i CIN 3) i u karcinomu cerviksa u odnosu na normalno tkivo i CIN 1
4. HIPOTEZA4. HIPOTEZA
očekujemo značajno veću učestalost HPV-a visokog rizika u umjerenih i teških displazija (CIN 2 i CIN 3) i u karcinomu cerviksa u odnosu na normalno tkivo i CIN 1
imunohistokemijska ekspresija Ki-67 i p16INK4a proteina bi trebala biti u korelaciji s prisutnošću HPV-a visokog rizika, a posljedično i sa visokim stupnjem displazije, odnosno karcinomom cerviksa
4. HIPOTEZA4. HIPOTEZA
očekujemo značajno veću učestalost HPV-a visokog rizika u umjerenih i teških displazija (CIN 2 i CIN 3) i u karcinomu cerviksa u odnosu na normalno tkivo i CIN 1
imunohistokemijska ekspresija Ki-67 i p16INK4a proteina bi trebala biti u korelaciji s prisutnošću HPV-a visokog rizika, a posljedično i sa visokim stupnjem displazije, odnosno karcinomom cerviksa
u aneuploidnim i tetraploidnim uzorcima očekujemo nalaz HPV-a visokog rizika i morfološku dijagnozu CIN-a
4. HIPOTEZA4. HIPOTEZA
očekujemo značajno veću učestalost HPV-a visokog rizika u umjerenih i teških displazija (CIN 2 i CIN 3) i u karcinomu cerviksa u odnosu na normalno tkivo i CIN 1
imunohistokemijska ekspresija Ki-67 i p16INK4a proteina bi trebala biti u korelaciji s prisutnošću HPV-a visokog rizika, a posljedično i sa visokim stupnjem displazije, odnosno karcinomom cerviksa
u aneuploidnim i tetraploidnim uzorcima očekujemo nalaz HPV-a visokog rizika i morfološku dijagnozu CIN-a
kombinacija više parametara (Ki-67, p16INK4a, DNA ploidija) bi trebala imati veću osjetljivost i specifičnost u odvajanju kako cervikalnih intraepitelnih neoplazija od normalnog nalaza, tako i unutar skupine CIN-a na CIN 1, CIN 2 i CIN 3
5. SADRŽAJ ISTRAŽIVANJA5. SADRŽAJ ISTRAŽIVANJA
Uzorci tkiva s potvrđenom patohistološkom dijagnozom:
Postupci:- grupna tipizacija na HPV visokog i niskog rizika lančanom reakcijom
polimeraze- imunohistokemijska analiza upotrebom protutijela na antigen Ki-67- imunohistokemijska analiza upotrebom protutijela na protein p16INK4a - protočna citometrija i određivanje DNA ploidije
Patolog koji vrši analizu nije upoznat kojoj skupini pripada pojedini uzorak
5. SADRŽAJ ISTRAŽIVANJA5. SADRŽAJ ISTRAŽIVANJA
Analizom uzoraka bojanih na Ki-67 antigen odrediti će se:- ukupan broj Ki-67 pozitivnih jezgara na 100 m bazalne
membrane- postotak Ki-67 pozitivnih jezgara u svakoj trećini epitela
Analizom na p16INK4a smatrati će se pozitivnima uzorci sa više od 5% nuklearno ili citoplazmatski obojanih stanica
Protočnom citometrijom uzorci će se razvrstati u 3 skupine: 1.diploidni 2. aneuploidni3. poliploidni
6. METODE ISTRAŽIVANJA6. METODE ISTRAŽIVANJA
6.1. ISPITANICI
30 uzoraka tkiva cerviksa za svaku dijagnostičku skupinu CIN-a
Kontrolne skupine:- normalno tkivo cerviksa pacijentica operiranih zbog drugih
Kriterij uključenja u istraživanje: patohistološka dijagnoza jasno definirana od strane patologa eksperta za ginekološku patologiju
6. METODE ISTRAŽIVANJA6. METODE ISTRAŽIVANJA
6.2. POSTUPCI
6.2.1. HISTOLOŠKA ANALIZA
fiksacija tkiva 24 h u 4% puferiranom formalinu uklapanje u parafin rezovi debljine 4 m bojanje hemalaun-eozinom
6. METODE ISTRAŽIVANJA6. METODE ISTRAŽIVANJA
6.2. POSTUPCI
6.2.2. IMUNOHISTOKEMIJSKA ANALIZA
6.2.2.1. Bojanje na Ki-67 antigen
protutijela na ljudski Ki-67 (mišje protutijelo M7240, DAKO, Glostrup, Danska)
obojanost staničnih jezgara Ki-67 antigenom kvantitativno će se odrediti koristeći Analysis Soft Imaging System, GmbH, Muenster, Germany
u svakom uzorku izabrati će se najreprezentivnije područje (s najvećim stupnjem CIN-a) izbjegavajući tangencijalno rezana područja
6. METODE ISTRAŽIVANJA6. METODE ISTRAŽIVANJA
6.2. POSTUPCI
6.2.2. IMUNOHISTOKEMIJSKA ANALIZA
6.2.2.1. Bojanje na Ki-67 antigen
Kvantitativna analiza: - ukupan broj Ki-67 pozitivnih jezgara na 100 m bazalne membrane - postotak Ki-67 pozitivnih jezgara posebno u donjoj, srednjoj i gornjoj trećini epitela
6. METODE ISTRAŽIVANJA6. METODE ISTRAŽIVANJA
6.2. POSTUPCI
6.2.2. IMUNOHISTOKEMIJSKA ANALIZA
6.2.2.2. Bojanje na protein p16INK4a
monoklonsko protutijelo za protein p16INK4a (CINtecTM p16INK4a citology kit, DAKO, Glostrup, Danska)
imunoreaktivnost na p16INK4a:- nalaz smeđe obojanosti jezgara
i/ili citoplazmi, pri čemu će se pozitivnim nalazom smatra obojanost u više od 5% epitelnih stanica